郁金香TfMYB2蛋白及其编码基因和探针

摘要

本发明提供了一种郁金香TfMYB2蛋白及其编码基因和探针，所述蛋白质为如下（a）或（b）的蛋白质：（a）由如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有郁金香MYB蛋白活性的由（a）衍生的蛋白质。本发明还提供了一种编码上述蛋白质的核酸序列，以及检测上述核酸序列的探针；本发明为利用基因工程技术，通过调节TfMYB2基因的表达来调控类黄酮生物合成途径中多个结构基因的表达，或将TfMYB2基因在另外不同的植物中进行转化，有效提高或降低转基因植物中类黄酮的含量，达到改变花色的目的提供了基础，具有重要应用价值。

权利要求

1.一种由如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.一种编码权利要求1所述蛋白质的核酸序列。

3.如权利要求2所述的核酸序列，其特征是，所述核酸序列具体为：碱基序列如SEQ ID NO.3第1～657位所示。

4.一种用于检测如权利要求2所述核酸序列的探针，其特征在于，所述探针为包含有所述核酸序列8～100个连续核苷酸的核酸分子。

说明书

郁金香TfMYB2蛋白及其编码基因和探针

技术领域

[0001] 本发明涉及郁金香花色苷合成途径中的关键酶及其编码基因和探针，具体地，涉及一种郁金香TfMYB2蛋白及其编码基因和探针。

背景技术

[0002] 花是植物重要的生殖器官，花色是植物正常繁育后代的前提，也是观赏植物重要经济价值所在。研究花色物质代谢的分子机理是为选育新异花色花卉品种的基础。花朵的颜色是花色素积累的结果。花色素主要包括类黄酮、类胡萝卜素以及甜菜碱类。类黄酮的生物合成途径是目前研究的最深入的代谢途径之一。

[0003] 类黄酮生物合成途径主要由两类基因控制：结构基因和调节基因。其中，结构基因直接编码与类黄酮次生代谢生物合成有关的各种酶类，而调节基因则是控制结构基因表达强度和表达方式的一类基因。调节基因编码的转录因子能够通过与结构基因启动子中含有的能被其识别的顺式作用元件结合，从而激活类黄酮生物合成途径中多个基因的表达，有效地启动类黄酮生物合成途径。因此，调节基因能一定程度上调节特定次生代谢物的形成。尽管利用转基因技术将控制类黄酮次生代谢的关键酶基因或其反义序列导入植物能促进或抑制该基因的表达，改变了类黄酮次生代谢途径，改变花色，但植物类黄酮生物合成途径复杂，涉及酶种类繁多，并不是个别关键酶所控制。通过转录因子作用，有可能激活类黄酮次生代谢途径中多个结构基因的表达，达到的效果将比导入某个结构基因的作用更明显。

[0004] 目前已在一些植物中发现了调控类黄酮生物合成途径的调节基因，并且用转座子标签法等技术克隆了部分编码转录因子的基因，其中MYB类转录因子家族是研究的最为广泛的，它能调控类黄酮合成途径中多个结构基因的转录水平。MYB转录因子家族成员的共同特征是含有MYB结构域，MYB结构域在不同物种之间是高度保守的。郁金香遗传分子基础研究很少，目前NCBI上只登记郁金香属（Tulipa）245条核酸序列，其中与花色相关的基因有5个。郁金香中MYB蛋白编码基因序列及表达模式尚不清楚，也未有任何与郁金香MYB蛋白及其编码基因序列相关的文献报道。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于填补郁金香MYB基因家族成员的克隆、表达模式分析以及郁金香MYB蛋白的空白，提供了一种郁金香MYB蛋白TfMYB2，本发明还提供了一种编码上述蛋白质的核酸序列以及检测所述核酸序列的探针；本发明公开了郁金香TfMYB2蛋白及其核酸序列在郁金香不同器官、不同发育阶段的表达模式。通过分析TfMYB2基因与类黄酮合成途径中结构基因的表达模式，推测TfMYB2基因编码的转录因子与结构基因的转录水平相关。本发明为利用基因工程技术，通过调节TfMYB2基因的表达，从而调控类黄酮生物合成途径中多个结构基因的表达水平，或将TfMYB2基因在另外不同的植物中进行转化，有效地提高或降低转基因植物中类黄酮的含量，达到改变花色的目的提供了基础，具有重要的应用价值。

[0006] 一方面，本发明提供了一种具有郁金香MYB蛋白活性的蛋白质，所述蛋白质是由如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或由SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有郁金香MYB蛋白活性的蛋白质。该蛋白质在花朵的不同发育阶段、不同器官内的有无及活性大小存在较大差异。

[0007] 优选的，所述蛋白质为SEQ ID NO.4所示氨基酸序列经过1～50个氨基酸的缺失、插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加1～20个以内氨基酸而得到的序列。

[0008] 进一步优选的，所述蛋白质为SEQ ID NO.4所示氨基酸序列中1～10个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成的序列。

[0009] 另一方面，本发明提供了一种编码上述蛋白质的核酸序列。

[0010] 优选的，所述核酸序列具体为：（a）碱基序列如SEQ ID NO.3第1～657位所示；或（b）与SEQ ID NO.3第1～657位所示的核酸有至少70%的同源性的序列；或（c）能与SEQ ID NO.3第1～657位所示的核酸进行杂交的序列。

[0011] 优选的，所述核酸序列具体为SEQ ID NO.3第1～657位所示的核酸序列中1～90个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5′和/或3′端添加60个以内核苷酸形成的序列。

[0012] 此外，本发明还提供了一种检测上述核酸序列的探针，所述探针为具有上述核酸序列8～100个连续核苷酸的核酸分子，该探针可用于检测样品中是否存在编码郁金香MYB蛋白相关的核酸分子。

[0013] 在本发明中，“分离的DNA”、“纯化的DNA”是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中相伴随的蛋白质分开。

[0014] 在本发明中，术语“郁金香TfMYB2蛋白编码序列”指编码具有郁金香MYB蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3所示的第1～657位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.3所示的第1～657位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.3所示的第1～657位核苷酸序列同源性低至约70%的简并序列也能编码出SEQ ID NO.4所示的序列。该术语还包括与SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的同源性至少70%的核苷酸序列。

[0015] 该术语还包括能编码天然郁金香MYB蛋白的相同功能、SEQ ID NO.3所示序列的变异形式。这些变异形式包括（但并不限于）：通常为1～90个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5′和/或3′端添加为60个以内核苷酸。

[0016] 在本发明中，术语“郁金香TfMYB2蛋白”指具有郁金香TfMYB2蛋白活性的SEQ IDNO.4所示序列的多肽。该术语还包括具有与天然郁金香TfMYB2蛋白相同功能的、SEQ IDNO.4序列的变异形式。这些变异形式包括（但并不限于）：通常为1～50个氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或为20个以内氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括郁金香TfMYB2蛋白的活性片段和活性衍生物。

[0017] 本发明的郁金香TfMYB2蛋白的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与郁金香TfMYB2相关DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用郁金香TfMYB2蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。

[0018] 在本发明中，“郁金香TfMYB2保守性变异多肽”指与SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列相比，有至多10个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。

[0019] 表1

[0020]最初的残基 代表性的取代 优选的取代
Ala(A) Val;Leu;Ile Val
Arg(R) Lys;Gln;Asn Lys
Asn(N) Gln;His;Lys;Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro;Ala Ala
His(H) Asn;Gln;Lys;Arg Arg
Ile(I) Leu;Val;Met;Ala;Phe Leu
Leu(L) Ile;Val;Met;Ala;Phe Ile
Lys(K) Arg;Gln;Asn Arg
Met(M) Leu;Phe;Ile Leu
Phe(F) Leu;Val;Ile;Ala;Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr;Phe Tyr
Tyr(Y) Trp;Phe;Thr;Ser Phe
Val(V) Ile;Leu;Met;Phe;Ala Leu

[0021] 发明还包括郁金香TfMYB2蛋白或多肽的类似物。这些类似物与郁金香TfMYB2相关多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基（如D-氨基酸）的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸（如β、γ-氨基酸）的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述列举的代表性的多肽。

[0022] 修饰（通常不改变一级结构）形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶（如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶）而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基（如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸）的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

[0023] 在本发明中，可用实时荧光定量PCR的方法分析郁金香TfMYB2基因产物的表达模式，即分析郁金香TfMYB2基因的mRNA转录物在细胞中的存在与否和数量。

[0024] 本发明检测样品中是否存在郁金香TfMYB2相关核苷酸序列的检测方法，包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于郁金香TfMYB2相关核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15～50个核苷酸。

[0025] 此外，根据本发明的郁金香TfMYB2核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选郁金香TfMYB2相关同源基因或同源蛋白。

[0026] 为了得到与郁金香TfMYB2相关基因的点阵，可以用DNA探针筛选郁金香cDNA文32
库，这些探针是在低严谨条件下，用 P对郁金香TfMYB2相关的全部或部分做放射活性标记而得的。适合于筛选的cDNA文库是来自郁金香的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clontech，Stratagene，Palo Alto,Cal.。这种筛选方法可以识别与郁金香MYB蛋白相关的基因家族的核苷酸序列。

[0027] 本发明的郁金香TfMYB2相关核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

[0028] 当获得了有关序列后，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

[0029] 此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

[0030] 除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产（Stewart等人，（1969）固相多肽合成，WH Freeman Co.,San Francisco;Merrifield J.（1963）J.Am Chem.Soc85:2149-2154）。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪（Foster City，CA）来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。

[0031] 利用本发明的郁金香TfMYB2蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与郁金香TfMYB2蛋白相关发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮抗剂等。

[0032] 与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：郁金香为世界十大切花之一，观赏价值极高，应用广泛，人们对新花色品种的需求也越来越大。本发明首次克隆郁金香植物体内类黄酮生物合成途径中调控结构基因表达活性的转录因子TfMYB2蛋白的编码序列，并采用荧光实时定量PCR的方法分析了TfMYB2基因的表达模式及其与类黄酮生物合成途径中结构基因表达模式的关系。为今后利用基因工程技术，通过调节TfMYB2基因的表达，从而调控类黄酮生物合成途径中多个结构基因的表达，或将TfMYB2基因在另外不同的植物中进行转化，有效地提高或降低转基因植物中类黄酮的含量，达到改变花色的目的提供了基础，具有重要的应用价值。

附图说明

[0033] 通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

[0034] 图1为本发明的郁金香TfMYB2基因与百合LhMYB6基因mRNA的核苷酸序列的同源比较(GAP)结果图；

[0035] 图2为本发明的郁金香TfMYB2蛋白与百合R2R3-MYB转录因子的氨基酸保守结构域序列的同源比较（FASTA）结果图，其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出。

具体实施方式

[0036] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

[0037] 实施例1、郁金香TfMYB2基因的克隆

[0038] 1.植物材料的获得

[0039] 将健康、大小一致的郁金香球茎（Tulipa fosteriana‘Shangnong zaoxia’，已通过上海市农作物品种审定委员会审定。编号：沪农品认花卉2011第004号）按常规种植并进行田间管理，待花朵完全开放，花瓣完全着色时采集花瓣组织，用于提取RNA；

[0040] 2.RNA的抽提

[0041] 用“RNA prep pure植物总RNA提取试剂盒”抽提总RNA（RNA prep pure Plant Kit：天根生化科技（北京）有限公司），用甲醛变性胶电泳鉴定RNA的完整性，然后在分光光度计（Thermo Scientific NANODROP1000Spectrophotometer）上测定RNA的纯度及浓度；

[0042] 3.基因的全长克隆

[0043] 根据其它物种中MYB蛋白的氨基酸保守序列，利用同源性基因克隆原理，采用TMRACE方法（3′-Full RACE Core Set Ver.2.0：宝生物工程（大连）有限公司，SMARTer RACEcDNA Amplification Kit:Clontech Laboratories,Inc.）进行cDNA全长克隆，分三个阶段进行：

[0044] （1）RT-PCR获得基因中间片段

[0045] 将提取的RNA进行反转录（Prime ScriptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit:宝生物工程（大连）有限公司），以第一链cDNA为模板，利用引物F1（SEQ ID NO.1）和R1（SEQ ID NO.2）进行PCR，扩增得到188bp片段，回收并连接到pMD18-T Simplevector载体上，用RV-M和M13-47作为通用引物，采用终止物荧光标记（Big-Dye，Perkin-Elmer，USA）的方法，在ABI377测序仪（Perkin-Elmer，USA）上进行测序，测序结果通过在NCBI网站进行BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）比对已有的数据库（GenBank），知其核酸序列及编码蛋白与已知的百合属MYB蛋白编码基因的同源性很高，初步认为它是一个MYB蛋白编码基因；

[0046] （2）3′RACE

[0047] 二轮巢式PCR完成3′末端序列的扩增。

[0048] 第一轮：Outerprimer+TfMYB23-1（5′-TCGAAGAGACGAGGATGACCT-3′）[0049] 第二轮：Innerprimer+TfMYB23-2（5′-TCAGGCTTCATAATCTCTTGGGC-3′）[0050] Outerprimer和Innerprimer为试剂盒提供。3′RACE得到TfMYB2基因的3′末端序列（650bp），回收，连接到pMD18-T Simple vector载体上，用RV-M和M13-47作为通用引物，采用终止物荧光标记（Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI377测序仪（Perkin-Elmer，USA）上进行测序，测序结果通过在NCBI网站进行BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）比对已有的数据库（GenBank），知其核酸序列及编码蛋白与已知的百合属MYB蛋白编码基因的同源性很高；

[0051] （3）5′RACE

[0052] 以5′RACE ready cDNA为模板，通过二轮巢式PCR完成5′末端序列的扩增，其中UPM和NUP为试剂盒提供。

[0053] 第一轮：UPM+TfMYB25-1（5′-TGGTTCGGAGTCCTCACGCATCATAAG-3′）[0054] 第二轮：NUP+TfMYB25-1（5′-ACGAGCCTTCCTGCTTTCATTCAACAA-3′）[0055] 5′RACE得到郁金香TfMYB2基因的5′末端序列（487bp），回收连接后用同上面一样的方法进行测序，将通过上述3种方法获得的序列的测序结果进行拼接，将拼接序列提交BLAST分析，结果证明从郁金香中新得到的TfMYB2基因的确为一个与编码MYB蛋白相关的基因，将测序结果结合NCBI的ORF Finding（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf）预测，发现了郁金香TfMYB2基因的起始密码子与终止密码子，根据获得的序列，分别从起始密码子和终止密码子处设计特异性引物ORF-F（5′-ATGACGAGCAACCCTTCCTCCTACC-3′），ORF-R（5′-CTAGTTCTGTCCAAAAGTCTCCTCC-3′），以郁金香cDNA为模板进行PCR，扩增得到657bp郁金香TfMYB2蛋白的全长编码序列（如SEQ ID NO.3所示）。

[0056] 实施例2、郁金香TfMYB2基因的序列信息与同源性分析

[0057] 本发明新的郁金香TfMYB2基因全长开放读码框序列为657bp，其详细序列如SEQ IDNO.3所示；根据开放读码框序列推导出郁金香TfMYB2蛋白的氨基酸序列，共218个氨基酸残基，分子量为24851.8道尔顿，等电点（pI）为8.25，其详细序列如SEQ ID NO.4所示；

[0058] 将郁金香TfMYB2基因的开放读码框序列及其编码蛋白的氨基酸序列用BLAST程序在GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与百合LhMYB6基因（GenBank登录号为AB534587.1）在核苷酸水平上具有77%的相同性，如图1所示（Query：郁金香TfMYB2蛋白的编码基因序列；Sbjct：百合LhMYB6的mRNA序列）；在氨基酸水平上，它与百合R2R3-MYB转录因子（GenBank登录号BAJ22983.1）在全长上有58%的一致性和74%的相似性，如图2所示（Query：郁金香TfMYB2蛋白的氨基酸序列；Sbjct：百合R2R3-MYB转录因子的氨基酸序列）。TfMYB2在氨基酸序列上含有MYB蛋白保守的R2和R3区域（特异性结合的DNA区域的序列），其中R3区域中含有一个保守的bHLH结合域（[D/E]Lx2[R/K]x3Lx6Lx3R），除了R2和R3区域之外，TfMYB2还含有一个motif6区域，此区域是拟南芥中所有与花青素普合成相关的MYB家族成员的保守区域。由此可见，郁金香TfMYB2基因与百合MYB蛋白编码基因无论从核酸还是蛋白水平上都存在较高的同源性，且隶属于与花青素苷生物合成相关的R2R3MYB基因群，序列上具有这个类群的保守结构域，结构域序列具有高度保守性，因此推断TfMYB2调控郁金香的花青素苷合成。

[0059] 实施例3、郁金香TfMYB2基因的表达差异性

[0060] 1.材料的获得：在郁金香（Tulipa fosteriana）3个不同花色品种（颜色分别为粉红、浅红、大红）花朵的4个不同发育阶段（花蕾，花瓣未着色；花蕾，花瓣开始着色；花朵部分开放，花瓣未完全着色；花朵完全开放，花瓣完全着色），于田间采取其花瓣，同时采取地下根、地上茎、叶片和花瓣（各发育阶段花朵花瓣的混合样），将样品分别用铝铂纸包好后立刻投入液氮中，接着转入-80℃超低温冰箱中贮存待用；

[0061] 2.RNA的提取：利用RNA prep pure植物总RNA提取试剂盒（RNA prep pure Plant Kit：天根生化科技（北京）有限公司）提取郁金香不同发育阶段花朵的花瓣以及不同组织中的RNA；

[0062] 3.RNA的完整性、纯度、浓度的确定：用普通琼脂糖凝胶电泳（胶浓度1.2%；0.5×TBE电泳缓冲液；150v，15min）检测完整性，电泳条带中最大rRNA亮度应为第二条rRNA亮度的1.5～2.0倍，否则表示rRNA样品的降解；纯度较好的RNA，A260/A280以及A260/A230约为2.0左右，用分光光度计测定OD值并计算RNA含量；

[0063] 4.cDNA的 获 得：以500ng的 总RNA 为 模 板，按 照 宝 生 物 公 司 TaKaRa TMPrimeScript RT reagent Kit Perfect Real Time试剂盒操作说明进行反转录获得cDNA备用；

[0064] 5.设计特异性引物以进行实时荧光定量PCR分析基因在各器官与组织中的表达量，根据已经获得的郁金香TfMYB2基因序列，利用引物设计软件设计用于Real-time PCR中TfMYB2基因定量分析的特异性引物，引物M-QF（5′-CAAGTGGACCCGTGTTCCC-3′），引物M-QR（5′-ATCCGGCCTGCTATTAGCG-3′），内参基因为Actin（GenBank登录号AB456684），引物为Actin-F（5′-AGTCAGTCATACAGTGCCAATC-3′），Actin-R（5′-TCATAAGAGAGTCGGTCAAATCC-3′）；

[0065] 6.制作目的基因及内参基因的标准曲线：用EASY Dilution（试剂盒提供）将标准品cDNA溶液进行梯度稀释，然后分别以稀释后的cDNA溶液为模板，以目的基因及内参基因的特异性引物进行Real-time PCR扩增，反应结束后绘制溶解曲线和标准曲线；分析溶解曲线，判断目的基因及内参基因的溶解曲线是否得到单一峰，以判断使用该引物能否得到单一的PCR扩增产物；通过标准曲线确定模板cDNA的合适稀释倍数；

[0066] 7.待测样品中目的基因的实时荧光定量分析：以合成的cDNA第一条链为模板，分别用目的基因与内参照基因的特异性引物扩增进行荧光定量分析，Real-time PCR反应在BIO-RAD Chromo4实时定量仪上进行，反应体系为20μL，反应采用三步法，94℃变性20s，接着41个循环：94℃15s；56℃20s；72℃25s；每次扩增完成后，均做溶解曲线，以检验扩增产物是否为特异产生；

[0067] 8.采用2-△△Ct法作相对定量分析，结果表明郁金香TfMYB2基因只在花瓣中能检测到转录本，在根、茎、叶中均未检测到转录本，表明这个转录因子跟花朵的发育紧密相关；TfMYB2基因在花瓣中的的表达水平随着花朵的发育过程而逐渐升高，在花朵完全开放、花瓣完全着色时表达量最高，分别为前三个花朵发育时期表达量的5.6、1.5和1.2倍；3种不同红色郁金香品种同一发育等级花瓣中花色苷含量为大红﹥浅红﹥粉红，与此对应的是，TfMYB2基因在这三个品种中的表达水平也表现为大红﹥浅红﹥粉红，推测TfMYB2基因与花色苷的合成相关，调控花色苷合成途径中结构基因的表达水平。

[0068] 以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。