仪陇坨麦抗条锈病基因相连锁的特异分子标记及其应用转让专利
申请号 : CN201210479255.1
文献号 : CN103088016B
文献日 : 2014-06-11
发明人 : 郑有良 , 陈国跃 , 陈时盛 , 魏育明 , 兰秀锦 , 刘亚西 , 代寿芬
申请人 : 四川农业大学
摘要 :
本发明涉及农业生物技术工程和小麦抗病遗传育种领域，具体地涉及与小麦抗条锈病基因相连锁的分子标记、其获得方法及应用。本发明的实质是根据连锁分离规律，以台长29/仪陇坨麦的F2群体为作图群体，通过田间条锈病抗性鉴定结果和SSR标记数据间的连锁分析，获得了与小麦条锈病抗性基因连锁的SSR标记Xgpw7342-350bp（正向引物：5’-GCGGTGGCAACAACCTAC-3’；反向引物：5’-GTGCATAAAGAGGGCAGAGC-3’）。该标记可用于小麦抗条锈病的辅助选择育种，可克服常规育种中小麦条锈病抗性鉴定易受环境影响、稳定性和重复性较差、工作量大、费时费力、育种周期长等缺点，进而简化选择方法，提高育种效率，加快小麦抗条锈病品种的育种进程。
权利要求 :
1.与小麦抗条锈病基因相连锁的分子标记，其特征在于，所述分子标记通过使用以下述的SSR引物Xgpw7342-350bp扩增仪陇坨麦而得，正向引物：5’-GCGGTGGCAACAACCTAC-3’；反向引物：5’-GTGCATAAAGAGGGCAGAGC-3’。
2.权利要求1所述的与小麦抗体锈病基因相连锁的分子标记在鉴定小麦品种抗条锈病方面的应用。
3.一种获得与小麦抗条锈病基因相连锁的分子标记的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：（1）以感病小麦品种台长29为母本，以四川地方小麦品种仪陇坨麦为父本，构建F2和F2:3遗传作图群体，构建的F2群体为抗条锈病基因遗传作图群体；
（2）用CTAB方法提取小麦亲本幼苗及其F2群体单株DNA；
（3）采用SSR分子标记技术进行小麦条锈病抗性分子标记的筛选，其中，使用SSR引物Xgpw7342-350bp扩增抗病亲本、感病亲本、抗病基因池、感病基因池以及它们的F2遗传作图群体，经过连锁性鉴定，发现该标记与小麦条锈病抗性基因相连锁，所述SSR引物Xgpw7342-350bp包括正向引物：5’-GCGGTGGCAACAACCTAC-3’和反向引物：
5’-GTGCATAAAGAGGGCAGAGC-3’。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，采用SSR分子标记进行筛选与小麦抗条锈病基因相连锁分子标记的方法是：（1）使用SSR引物在抗病亲本、感病亲本、抗病基因池、感病基因池以及它们的F2遗传作图群体中进行DNA多态性分析，所述SSR引物Xgpw7342-350bp包括正向引物：
5’-GCGGTGGCAACAACCTAC-3’和反向引物：5’-GTGCATAAAGAGGGCAGAGC-3’；
（2）分子标记的连锁性分析：对仪陇坨麦与感病亲本台长29杂交获得的F2单株抗性进行田间鉴定，调查F2单株的抗病性，提取F2群体单株DNA，用与前面同样的反应体系、引物及程序进行PCR扩增，统计抗、感株系标记带的出现频率和交换类型并计算交换值，计算标记与抗条锈病基因之间的遗传距离。
说明书 :
仪陇坨麦抗条锈病基因相连锁的特异分子标记及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及农业生物技术工程和小麦抗病遗传育种领域，具体地涉仪陇坨麦抗条锈病基因相连锁的特异分子标记及其应用。
[0002] 背景技术
[0003] 由条型柄锈菌（Puccinia striiformis Westend.f.sp.tritici，Pst）引起的小麦条锈病是小麦危害程度最重的典型气传病害之一，早在小麦作为人类的主要粮食作物之前就已经存在，在全世界除南极洲之外的各大洲60多个国家均有不同程度发生。中国是世界上最大且相对独立的小麦条锈病流行区，小麦条锈病一直是威胁我国西北、西南、黄淮海等地冬麦区和西北春麦区最重要的小麦病害之一。近年来由于新毒性小种条中32和条中33的出现和流行更加剧了条锈病成灾趋势，我国小麦条锈病自2000年以来一直处于大流行状态。因此，迫切需要发掘新的抗条锈病基因并高效转育到现有主栽品种中，增强小麦栽培品种的抗性。
[0004] 抗病新基因的发掘及利用是育种工作的基础，也是解决抗性丧失这一难题的根本途径。虽然传统的药剂防治可以从一定程度上减轻条锈病的危害，但是大量使用农药不仅增加了生产成本，还会对生态环境和人类健康产生很大的威胁。因此，选育抗病品种是防治条锈病经济、安全、有效的方法。近年来，我国条锈病发生表现出爆发频率高、范围广、危害逐年加重、发病时间早等特点。因此，从小麦野生近缘种属、稀有种和地方小麦中发掘新的抗条锈病基因，并有效利用，选育推广新的抗条锈病品种，已经成为我国小麦抗条锈病育种中重要任务。
[0005] 随着分子生物学的发展，DNA分子标记技术在分子选择辅助育种领域中的应用越来越广泛。分子标记技术能够在基因水平上对作物种质资源进行评价和鉴定，同时为抗病基因的定位、克隆和聚合提供了依据。正是由于分子标记技术较传统标记手段具有速度快，标记位点多，共显性，不易受环境影响的特点，所以，近年来分子标记技术得到了迅速发展的。目前，主要利用RAPD、SSR、AFLP、RGAP、RFLP等几种DNA分子标记技术在50个正式命名的抗条锈病主效基因和暂定名的抗条锈主效基因中已经找到了与48个抗条锈基因连锁的分子标记。在所有的标记技术中，Litt等于1989年开发的SSR标记具有简便、快速、稳定性高和等位基因多样性高等优点,在遗传多样性、种质资源鉴定、遗传作图、基因定位及分子标记育种等研究方面得到 了广泛的应用。目前利用该技术已成功筛选和鉴定多个条锈病抗性基因，例如Yr2、Yr5、Yr24、Yr26、Yr30、Yr33、Yr34、Yr36、YrZH84、YrSph等。但基于单一或少数组合的分离群体而得到的条锈病抗性基因连锁标记，通用性常受品种背景的限制；而且多数标记距目标基因较远，导致这些标记在育种中的应用不多。
[0006] 来自中国四川的地方小麦品种仪陇坨麦，经多年多点田间条锈病抗性鉴定表明，该种质对我国目前条锈病菌流行生理小种具有良好抗性。遗传分析表明，仪陇坨麦含有一对能够抗我国条中31、32和33混合生理小种的显性基因。因此，筛选该抗性基因连锁分子标记，有望直接应用于小麦抗病品种的选育，以提高选择效率和加快小麦抗病育种进程。 发明内容
[0007] 为了解决上述问题，本申请的发明人提出并完成了本发明。
[0008] 本发明的目的之一是提供与小麦抗条锈病基因相连锁的分子标记。
[0009] 本发明的目的之二是提供获得上述与小麦抗条锈病基因相连锁的分子标记的方法。
[0010] 本发明的目的之三是提供上述与小麦抗条锈病基因相连锁的分子标记的应用。 [0011] 本发明针对上述研究背景，以仪陇坨麦/台长29的F2群体为作图群体，通过抗病性鉴定结果和SSR标记数据间的连锁分析，获得了与小麦条锈病抗性基因连锁的标记Xgpw7342-350bp，该标记可应用于小麦条锈病抗病品种的辅助选择育种。
[0012] 根据本发明的与小麦抗条锈病基因相连锁的分子标记Xgpw7342-350bp，通 过 使 用 SSR 引 物：正 向 引 物：5’-GCGGTGGCAACAACCTAC-3’；反 向 引 物：
5’-GTGCATAAAGAGGGCAGAGC-3’扩增而得，所述分子标记的大小为350bp，其定位在小麦7B短臂上，遗传距离为1.8cM。
5’-GTGCATAAAGAGGGCAGAGC-3’扩增而得，所述分子标记的大小为350bp，其定位在小麦7B短臂上，遗传距离为1.8cM。
[0013] 本发明还提供了上述分子标记在鉴定小麦抗条锈病方面的应用。根据本发明的具体实施例方式，以抗病品种仪陇坨麦与感病品种台长29为亲本的杂交组合的高代（F3）单个小麦株系（L1-L4）对象，通过检测其特异分子标记Xgpw7342-350bp的带型数据，结合田间抗病鉴定表型数据，可以预测该株系对小麦条锈病的抗性。
[0014] 根据本发明的鉴定小麦抗条锈病的方法包括使用SSR引物：正向引物：5’-GCGGTGGCAACAACCTAC-3’；反向引物：5’-GTGCATAAAGAGGGCAGAGC-3’进行扩增的步骤。 [0015] 根据本发明的获得与小麦抗条锈病基因相连锁的分子标记的方法，所述方法包 括以下步骤：
[0016] （1）以感病小麦品种台长29为母本，以四川省地方小麦品种仪陇坨麦为父本，构建F2和F2:3遗传作图群体，构建的F2群体为抗条锈病基因遗传作图群体；
[0017] （2）用CTAB方法提取小麦亲本幼苗及其F2群体单株DNA；
[0018] （3）采用SSR分子标记技术进行小麦条锈病抗性分子标记的筛选，其中，使用SSR 引物 Xgpw7342-350bp（正 向 引 物：5’-GCGGTGGCAACAACCTAC-3’；反 向 引 物：5’-GTGCATAAAGAGGGCAGAGC-3’）扩增抗病亲本、感病亲本、抗病基因池、感病基因池以及它们的F2遗传作图群体，经过连锁性鉴定，发现该标记与小麦条锈病抗性基因相连锁。 [0019] 根据本发明的获得与小麦抗条锈病基因相连锁的分子标记的方法，其中，采用SSR分子标记进行筛选与小麦抗条锈病基因相连锁分子标记的方法是：
[0020] （1）使用SSR引物在抗病亲本、感病亲本、抗病基因池、感病基因池以及它们的F2遗传作图群体中进行DNA多态性分析；
[0021] （2）对仪陇坨麦与感病亲本台长29杂交获得的F2单株抗性进行田间鉴定，调查F2单株的抗病性，提取F2群体单株DNA，用与步骤（1）同样的反应体系、引物及程序进行PCR扩增，统计抗、感株系标记带的出现频率和交换类型并计算交换值，用MAPMARKER/EXP 3.0b计算标记与抗条锈病基因之间的遗传距离。
[0022] 根据本发明的具体实施方式，本发明所提供的与小麦条锈病抗性基因连锁的SSR标记Xgpw7342-350bp，是通过以下方法获得的：
[0023] 1）以感病小麦品种台长29为母本，抗病品种仪陇坨麦为父本，构建F2遗传作图群体，对获得的F2单株抗性进行抗性鉴定。
[0024] 2）以CTAB方法提取亲本、抗病基因池、感病基因池及F2群体单株DNA。 [0025] 3）根据GrainGenes(http://www.wheat.pw.usda.gov)上公布的SSR引物序列合成引物，PCR后采用6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，获得分子标记数据；
[0026] 4）利用条中31、32和条中33条锈病生理混合小种对仪陇坨麦与感病亲本台长29杂交、自交获得的F2单株抗性进行田间鉴定，条锈病接种在两叶一心的小麦苗，将条锈病菌人工接种至病害鉴定圃的诱发行上，通过自然传播接种，当诱发行完全发病时，测定F2单株的抗病性，调查级别分为高抗（HR）、抗（R）、中抗（MR）、感（S）和高感（HS）五级。其中，测定病级为高抗（HR）、抗（R）或中抗的单株确定为抗病，而测定病级为中感或高感的单株确定为感病。
[0027] 5）利用条中31、32和条中33条锈病生理混合小种对仪陇坨麦与感病亲本台长29杂交、自交获得的F2：3株系抗性进行田间鉴定，条锈病接种在分蘖期的小麦苗，将 条锈病菌人工接种至病害鉴定圃的诱发行上，通过自然传播接种，当诱发行完全发病时，测定F2：3株系各单株抗病性，调查级别分为高抗（HR）、抗（R）、中抗（MR）、感（S）和高感（HS）五级。其中，测定病级为高抗（HR）、抗（R）或中抗（MR）的单株确定为抗病，而测定病级为感（S）或高感（HS）的单株确定为感病。
[0028] 6）结合4）和5）结果，确定F2单株抗病性及携带抗病基因杂合性。
[0029] 7）用CTAB法提取小麦亲本幼苗及其F2群体单株DNA；并根据6）结果，分别筛选15个抗病基因纯合F2单株和15个感病基因纯合F2单株等量DNA混合，构建抗病基因池和感病基因池。
[0030] 8）采用SSR分子标记方法进行小麦条锈病抗性基因分子标记的筛选，其具体获得与小麦抗条锈病基因相连锁的分子标记的方法是：
[0031] （1）SSR引物在抗病亲本、感病亲本、抗病基因池、感病基因池及其它们的F2单株间DNA多态性分析：
[0032] 用SSR标记技术筛选，根据GrainGenes(http://www.wheat.pw.usda.gov)上公布的SSR引物序列合成引物，在ABI-9700 PCR仪上进行PCR扩增，PCR扩增反应体系：2+
50ng/μl小麦基因组DNA 1.0μl，10×PCR Buffer(with Mg )2.0μl，2.5mM dNTP1.6μl，
100μM引物1.0μl，2.5U/μl Taq DNA聚合酶0.3μl，ddH2O 13.1μl，总体系20μl。扩增反应程序：94℃变性5分钟，94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸1分钟，40个循环，最后72℃延伸10分钟；产物检测：6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，点击缓冲液为
1×TBE，恒定功率80瓦。凝胶染色采用硝酸银染色；照相并在白光灯箱上记录实验结果。 [0033] （2）分子标记的连锁性鉴定：
50ng/μl小麦基因组DNA 1.0μl，10×PCR Buffer(with Mg )2.0μl，2.5mM dNTP1.6μl，
100μM引物1.0μl，2.5U/μl Taq DNA聚合酶0.3μl，ddH2O 13.1μl，总体系20μl。扩增反应程序：94℃变性5分钟，94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸1分钟，40个循环，最后72℃延伸10分钟；产物检测：6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，点击缓冲液为
1×TBE，恒定功率80瓦。凝胶染色采用硝酸银染色；照相并在白光灯箱上记录实验结果。 [0033] （2）分子标记的连锁性鉴定：
[0034] 根据连锁遗传定律，按照MapmakerEXP3.0b软件要求，将抗病亲本仪陇坨麦和抗病基因池相同的带型赋值为“A”，与感病亲本台长29和感病基因池相同的带型赋值为“B”，同时扩增出抗病亲本、抗病基因池和感病亲本、感病基因池两种带型的赋值为“H”，带型不清楚或缺失的赋值为“-”，结合4）田间抗病性鉴定结果，用Kosambi函数算出遗传距离。 [0035] 9） 筛 选 出 一 个 SSR 分 子 标 记 Xgpw7342-350bp( 正 向 引 物：5’-GCGGTGGCAACAACCTAC-3’；反向引物：5’-GTGCATAAAGAGGGCAGAGC-3’），扩增抗病亲本、感病亲本、抗病基因池、感病基因池以及它们的F2遗传作图群体，发现在350bp处存在一标记，经过连锁性鉴定，发现该标记与小麦条锈病抗性基因连锁。
[0036] SR分子标记Xgpw7342-350bp在抗性基因辅助选择的应用，其具体的方法是： [0037] （1）利用条中31、32和条中33条锈病生理混合小种对抗病品种仪陇坨麦与感 病品种川农16为亲本的杂交组合的高代（F5）4个小麦株系（L1-L4）、4个与抗病品种仪陇坨麦不同的四川地方小麦品种（包括：巴中坨麦、开江白麦子、宜宾猪儿麦、合江转载小麦）、10个与抗病品种仪陇坨麦无亲缘关系的小麦育成品种（包括：内麦8号、内麦9号、川麦47、科成麦2号、川麦42、川农16、川辐5号、绵农3号、绵阳26、川麦22）抗性进行田间鉴定，条锈病接种在两叶一心的小麦苗，将条锈病菌人工接种至病害鉴定圃的诱发行上，通过自然传播接种，当诱发行完全发病时，测定抗病性，调查级别分为高抗（HR）、抗（R）、中抗（MR）、感（S）和高感（HS）五级。其中，测定病级为高抗（HR）、抗（R）或中抗的材料确定为抗病，而测定病级为中感或高感的材料确定为感病。
[0038] （2）用SDS法提取（1）提及小麦材料DNA；
[0039] （3）分子标记Xgpw7342-350bp在（2）DNA多态性分析：
[0040] SSR分子标记Xgpw7342-350bp在ABI-9700PCR仪上进行PCR扩增，PCR扩增反2+
应体系：50ng/μl小麦基因组DNA 1.0μl，10×PCR Buffer(with Mg )2.0μl，2.5mM dNTP1.6μl，100μM引物1.0μl，2.5U/μl Taq DNA聚合酶0.3μl，ddH2O 13.1μl，总体系20μl。扩增反应程序：94℃变性5分钟，94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸1分钟，40个循环，最后72℃延伸10分钟；产物检测：6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，点击缓冲液为1×TBE，恒定功率80瓦。凝胶染色采用硝酸银染色；照相并在白光灯箱上记录实验结果。
应体系：50ng/μl小麦基因组DNA 1.0μl，10×PCR Buffer(with Mg )2.0μl，2.5mM dNTP1.6μl，100μM引物1.0μl，2.5U/μl Taq DNA聚合酶0.3μl，ddH2O 13.1μl，总体系20μl。扩增反应程序：94℃变性5分钟，94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸1分钟，40个循环，最后72℃延伸10分钟；产物检测：6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，点击缓冲液为1×TBE，恒定功率80瓦。凝胶染色采用硝酸银染色；照相并在白光灯箱上记录实验结果。
[0041] （4）利用分子标记Xgpw7342-350bp对抗性基因的鉴定：
[0042] 在抗病亲本、抗病基因池、及抗病品种仪陇坨麦与感病品种川农16为亲本的杂交组合的高代（F5）4个小麦株系（L1-L4）材料间扩增出了一条350bp大小的多态性带纹，而在感病亲本、感病基因池、4个与抗病品种仪陇坨麦不同的四川地方小麦品种（包括：巴中坨麦、开江白麦子、宜宾猪儿麦、合江转载小麦）和10个与抗病品种仪陇坨麦无亲缘关系的小麦育成品种（包括：内麦8号、内麦9号、川麦47、科成麦2号、川麦42、川农16、川辐5号、绵农3号、绵阳26、川麦22）中均不能扩增出这一350bp的特异带型。因此，结合田间表型抗性鉴定结果，从而证实该抗性基因特异分子标记Xgpw7342-350bp可以鉴定该抗性基因在小麦材料中的存在。
[0043] 本发明的积极性效果及应用如下：
[0044] 1、本发明使用的PCR体系，不需要特殊的PCR仪器和特殊的反应试剂，普通商业公司生产的产品均能达到要求。
[0045] 2、本发明获得的与条锈病抗性基因紧密连锁的分子标记，是在对我国条锈病高抗的四川地方小麦品种仪陇坨麦及其遗传作图群体中获得的新的标记，该标记与抗 性基因遗传距离近，PCR扩增重复性好，稳定性强，可以用于小麦条锈病品种鉴定和小麦抗病后代的分子辅助选择，进而加快抗病品种的育种进程。
[0046] 3、为克隆小麦抗条锈病基因、基因序列分析以及转抗条锈病基因小麦研究奠定了良好的基础。
附图说明
[0047] 图1显示SSR标记Xgpw7342-350bp在抗病亲本、感病亲本、抗病基因池、感病基因池及其F2群体中的扩增。（RP为抗病亲本仪陇坨麦；SP为感病亲本台长29；RB为抗病基因池；SB为感病基因池；R为抗病表型；H为杂合型；S为感病表型；“+”为具有特异标记；“-”为无特异标记带；箭头表示SSR标记Xgpw7342-350bp）。
[0048] 图2显示SSR标记Xgpw7342-350bp在抗病亲本、感病亲本、抗病基因池、感病基因池及抗病品种仪陇坨麦与感病品种川农16为亲本的杂交组合的高代（F5）4个小麦株系（L1-L4）、4个与抗病品种仪陇坨麦不同的四川地方小麦品种（包括：巴中坨麦、开江白麦子、宜宾猪儿麦、合江转载小麦）、10个与抗病品种仪陇坨麦无亲缘关系的小麦育成品种（包括：内麦8号、内麦9号、川麦47、科成麦2号、川麦42、川农16、川辐5号、绵农3号、绵阳26、川麦22）的PCR扩增。（RP为抗病亲本仪陇坨麦；SP为感病亲本台长29；RB为抗病基因池；SB为感病基因池；黑色实心箭头表示SSR标记Xgpw7342-350bp）。
具体实施方式
[0049] 以下结合实施例对本发明作进一步的详细描述，但并非对本发明的限制，凡依照本发明公开内容所作的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
[0050] 实施例1：与四川地方小麦品种仪陇托坨麦条锈病抗性基因连锁的SSR分子标记Xgpw7342-350bp的获得
[0051] 1、供试材料
[0052] 植物材料：以感病品种台长29为母本，抗病品种四川地方小麦仪陇坨麦为父本，构建F2遗传作图群体。2010年正季将F2群体的152个单株种植于四川农业大学成都校区温江试验基地病害鉴定圃，用于抗性鉴定。苗期取各单株的部分叶片，用于SSR分析。成熟时，收获F2:3家系的种子，晾干保存，2011年用于抗性鉴定。
[0053] 条锈病菌混合生理小种：用于F2群体及F2:3家系抗性鉴定的条锈病菌混合生理小种由条中31、32和33三个小种等量混合组成。
[0054] 2、抗性鉴定
[0055] 田间试验设计：2010年及2011年正季，四川农业大学成都校区温江试验基地病害鉴定圃分别将感病品种台长29、抗病品种四川地方小麦仪陇坨麦及其F2群体和F2:3家系单粒播种，行长2.0m，行距20cm，每行播种10粒，每间隔20行设置一行感病对照品种SY95-71，在鉴定圃周围分别种植1行用于条锈病诱发感病品种SY95-71和台长29。 [0056] 抗性鉴定：采用人工接种方式进行田间抗性鉴定。当小麦幼苗长至二叶一心时用涂抹法对条锈病诱发感病品种SY95-71和感病亲本台长29进行单株人工接种。待感病亲本台长29发病充分后，记载抗病性。按以下标准进行条锈病抗性鉴定：
[0057] 高抗（HR）：无可见侵染；
[0058] 抗（R）：仅产生枯死斑点或失绿反应，无夏孢子堆；
[0059] 中抗（MR）：夏孢子堆较小，周围有枯死或失绿反应；
[0060] 感（S）：夏孢子堆中等，周围无枯死或失绿反应；
[0061] 高感（HS）：夏孢子堆大，周围无枯死或失绿反应。
[0062] 鉴定结果发现F2群体中表现为感病的有35株，其后代F2:3株系表现均为感病；F2表现为抗病的有117株，其对应的F2:3中全部植株表现为抗性的有39个株系，而表现为抗感分离的株系有78个。F2群体抗感分离比符合3:1，F2:3株系抗感分离比符合1:2:1，说明抗病品种四川地方小麦仪陇坨麦携带了一个显性主效抗条锈病基因。
[0063] 3、基因组DNA提取
[0064] 采用CTAB法提取基因组DNA。取2g新鲜幼嫩叶片,液氮研磨成细粉后加预热至65℃的2×CTAB提取液(2% CTAB，1.4M NaCl，0.1MTris-HCl（pH8.0），0.1M EDTA（pH8.0），临用前加2% β-巯基乙醇15ml，混匀。
[0065] 65℃水浴30-45min，其间轻摇混匀。
[0066] 冷却至室温后加等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，轻轻混匀至上清液呈牛奶状，4000rpm离心10min。
[0067] 取上清液，加等体积异丙醇，置于冰浴沉淀DNA。
[0068] 勾出DNA，用70%酒精洗2次，无水乙醇洗一次，气干DNA，溶于适量pH8.0的TE溶液中。
[0069] 0.8％琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。紫外分光光度法测定各样品DNA浓度，将各样品DNA稀释至50ng/μl备用。
[0070] 4、SSR分析
[0071] 根据GrainGenes(http://www.wheat.pw.usda.gov)上公布的SSR引物序列合成 引物（由上海英俊生物技术有限公司合成），在ABI-9700 PCR仪上进行PCR扩增，具体如下： [0072] 1）PCR反应体系（20μl）
[0073]
[0074] 2）PCR扩增体系
[0075]
[0076] 3）电泳检测
[0077] 用6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，用银染的方法进行显色，照相并在白光灯箱上记录实验结果（图1）。
[0078] 5、分子标记连锁性鉴定
[0079] 利用亲本、基因池多态性检测筛选出的SSR标记对152个F2单株进行分析，按照MAPMAKER软件（Lander et al.,1987）的要求，将抗病亲本仪陇坨麦和抗病基因池相同的带型赋值为“A”，与感病亲本台长29和感病基因池相同的带型赋值为“B”，同时扩增出抗病亲本、抗病基因池和感病亲本、感病基因池两种带型的赋值为“H”，带型不清楚或缺失的赋值为“-”。用Kosambi函数算出遗传距离。经计算，获得一个SSR标记Xgpw7342-350bp，由该SSR分子标记Xgpw7342-350bp扩增抗病亲本、感病亲本、抗病基因池、感病基因池以及它们的F2遗传作图群体，发现在350bp处存在一标记，与小麦条锈病抗性基因连锁，遗传距离为1.8cM。 [0080] 实施例2：小麦条锈病抗性基因分子选择
[0081] 1、供试材料
[0082] 植物材料：感病品种台长29、抗病品种四川地方小麦仪陇坨麦，抗病品种仪陇坨麦与感病品种川农16为亲本的杂交组合的高代（F5）4个小麦株系（L1-L4）、4个与抗病品种仪陇坨麦不同的四川地方小麦品种，包括：巴中坨麦、开江白麦子、宜宾猪儿麦、合江转载小麦、10个与抗病品种仪陇坨麦无亲缘关系的小麦育成品种，包括：内麦8号、内麦9号、川麦47、科成麦2号、川麦42、川农16、川辐5号、绵农3号、绵阳26、川麦22。2011年正季将上述材料种植于四川农业大学成都校区温江试验基地病害鉴定圃，用于抗性鉴定。苗期取各单株的部分叶片，用于SSR分析。
[0083] 条锈病菌混合生理小种：用于抗性鉴定的条锈病菌混合生理小种由条中31、32和33三个小种等量混合组成。
[0084] 2、抗性鉴定
[0085] 同实施例1。鉴定结果发现，感病品种台长29表现为高感，抗病品种仪陇坨麦表现为高抗；抗病品种仪陇坨麦与感病品种川农16为亲本的杂交组合的高代（F5）4个小麦株系（L1-L4）表现为高抗；4个与抗病品种仪陇坨麦不同的四川地方小麦品种中巴中坨麦、开江白麦子表现为感病，而宜宾猪儿麦、合江转载小麦表现为抗病；10个与抗病品种仪陇坨麦无亲缘关系的小麦育成品种中内麦8号、内麦9号、川麦47、科成麦2号、川麦42表现为抗病，而川农16、川辐5号、绵农3号、绵阳26、川麦22表现为感病。
[0086] 3、基因组DNA提取
[0087] 同实施例1。
[0088] 4、特异分子标记Xgpw7342-350bp的SSR分析
[0089] 利 用 该SSR 引 物(正 向 引 物：5’-GCGGTGGCAACAACCTAC-3’；反 向 引 物：5’-GTGCATAAAGAGGGCAGAGC-3’），对上述抗病品种四川省地方小麦仪陇坨麦、感病品种台长
29，4个与抗病品种仪陇坨麦不同的四川地方小麦品种，包括：巴中坨麦、开江白麦子、宜宾猪儿麦、合江转载小麦、10个与抗病品种仪陇坨麦无亲缘关系的小麦育成品种，包括：内麦
8号、内麦9号、川麦47、科成麦2号、川麦42、川农16、川辐5号、绵农3号、绵阳26、川麦
22进行SSR分析，SSR分析同实施例1。
29，4个与抗病品种仪陇坨麦不同的四川地方小麦品种，包括：巴中坨麦、开江白麦子、宜宾猪儿麦、合江转载小麦、10个与抗病品种仪陇坨麦无亲缘关系的小麦育成品种，包括：内麦
8号、内麦9号、川麦47、科成麦2号、川麦42、川农16、川辐5号、绵农3号、绵阳26、川麦
22进行SSR分析，SSR分析同实施例1。
[0090] 5、抗条锈病基因特异分子标记Xgpw7342-350bp的辅助选择
[0091] 用该SSR分子标记Xgpw7342-350bp对上述材料进行扩增，结果：在抗病亲本、抗病基因池及抗病品种仪陇坨麦与感病品种川农16为亲本的杂交组合的高代（F5）4个小麦株系（L1-L4）材料间扩增出的DNA谱带中找到一条350bp大小的多态性带纹（即本 发明的与四川地方品种仪陇坨坨麦抗条锈病基因连锁的分子标记Xgpw7342-350bp，），而在感病亲本、感病基因池4个与抗病品种仪陇坨麦不同的四川地方小麦品种（包括：巴中坨麦、开江白麦子、宜宾猪儿麦、合江转载小麦）、10个与抗病品种仪陇坨麦无亲缘关系的小麦育成品种（包括：内麦8号、内麦9号、川麦47、科成麦2号、川麦42、川农16、川辐5号、绵农3号、绵阳26、川麦22）中均不能扩增出这一350bp的特异带型，结合田间表型抗性鉴定结果，从而证实该抗性基因特异分子标记Xgpw7342-350bp可以鉴定抗性基因在小麦材料中的存在。（图2）。