一种植物双基因共表达载体的构建方法

摘要

本发明涉及一种植物双基因共表达载体的构建方法，其特征在于通过PCR扩增将质粒pGWB605(GenBank登记号AB543114)中的间隔序列两端添加Ncol和EcoR？I内切酶酶切位点后，将间隔序列克隆入pXCS-HAStrep质粒中，构建了植物双基因共表达载体pXCS-Dgene-HAStrep。该表达载体自身仅有5682Kb，可装载两个较大的外源基因，而且两个外源基因能在一套真核表达系统中独立表达。该表达载体采用bar基因做筛选标记基因，转基因植株的筛选操作简单，效率高。

权利要求

1.一种植物双基因共表达载体的构建方法，其特征在于包括：

1)设计引物

a.根据 待扩 增的间 隔序 列，设计 引物SP-F 和SP-R，引物 序列 分别 为CATGCCATGGTCTAGAGGATCCGGCTTA和GGAATTCGAACTTCACCAGCCCCTGTTC，并在引物SP-F中引入Ncol内切酶酶切位点，在引物SP-R中引入EcoR I内切酶酶切位点；

b.根据pXCS-HAStrep载体多克隆位点结构特点，设计接头SP-A1和SP-A2，接头序列分别为AGCTTTGGTAC和CATGGTACCAA；

2)载体构建

a.以载体pGWB605为模板，pGWB605在GenBank的登记号为AB543114，SP-F/SP-R为引物，通过PCR扩增获取间隔序列，产物大小为341bp；

b.将扩增产物与pMD-19T载体在16℃连接过夜,次日转化大肠杆菌DH5a,涂布于含抗生素Carb的LB固体培养基上，37℃培养12h，挑取阳性单克隆，提取质粒进行测序；

c.用内切酶Hind III和EcoR I酶解质粒pXCS-HAStrep，回收大片段并与接头SP-A1/SP-A2连接；

d.对步骤b中测序正确的阳性克隆提取质粒pMD-19T，用Ncol和EcoR I酶解质粒pMD-19T，回收间隔序列,并与步骤c中的连接产物进行连接；

e.连接产物转化大肠杆菌DH5a，挑取阳性单克隆，提取质粒，所得质粒即为植物双基因共表达载体pXCS-Dgene-HAStrep，该载体能在一套真核表达系统中，独立表达两个基因。

说明书

一种植物双基因共表达载体的构建方法

技术领域

[0001] 本发明属于分子生物学技术领域，具体地说，涉及一种植物双基因共表达载体的构建方法。

背景技术

[0002] 以往植物转基因多是利用单个目的基因改良植物的个别性状，而单个目的基因的转化不能满足植物改良的需要，尤其是对一些代谢途径或数量性状的遗传修饰。随着植物基因工程和分子生物学研究的深入，多基因转化研究应运而生，并迅速发展。

[0003] 目前，植物遗传转化多基因共表达系统通常包括多质粒共转化系统和单个载体表达多个基因表达盒系统。在多质粒共转化系统中，是将多个外源基因分别克隆至不同的抗性载体中，共转化后同时添加多种抗生素实现多基因的共表达，由于受到抗性标记种类及组合方式的限制，这种系统仅能实现少数几个基因的共表达，此外共表达时，还需要考虑两个或多个表达质粒的相容性，操作起来也比较麻烦，且转化效率不是很高。Johnston等在构建pRSET/pRM1相容性双质粒共表达体系的研究中提出，2个载体都要带有T7启动子，并且还要带有不同的抗性；最重要的一点，就是2个载体的复制子不能相同，这样才能保证在传代过程中不会发生质粒的丢失。但是目前大部分商品化表达载体均为ColE1/pMB1复制子，所以不同复制子的2种载体不容易得到，这会给研究工作带来一些麻烦。在单个载体表达多个基因表达盒系统中，是将多个目的基因克隆于同一表达载体，外源基因含有各自的启动子、翻译起始和终止信号，各基因能独立表达各自的产物。但是，该系统存在翻译极性效应，各基因的表达并不趋于平衡，当串联基因较多时，这种现象尤为明显，最终严重影响整个代谢通路的效率。

发明内容

[0004] 本发明的目的是针对现有载体构建技术中所存在的问题，研制出植物双基因共表达载体及其构建方法。

[0005] 为了实现本发明目的，本发明的一种植物双基因共表达载体的构建方法，包括如下步骤：

[0006] 1.设计引物

[0007] 1)根据待扩增的间隔序列，设计引物，SP-F和SP-R，并在上游引物和下游引物中分别引入Ncol和EcoR I内切酶酶切位点；

[0008] 2)根据pXCS-HAStrep载体多克隆位点结构特点，设计接头SP-A1和SP-A2。

[0009] 2.载体构建

[0010] 1)以载体pGWB605(GenBank登记号AB543114)为模板，SP-F/SP-R为引物，通过PCR扩增获取间隔序列，产物大小为341bp；

[0011] 2)将扩增产物与pMD-19T载体在16℃连接过夜,次日转化大肠杆菌DH5a，涂布于含抗生素Carb的LB固体培养基上，37℃培养12h，挑取阳性单克隆，提取质粒进行测序；

[0012] 3)用内切酶Hind III和EcoR I酶解质粒pXCS-HAStrep，回收大片段并与接头SP-A1/SP-A2连接；

[0013] 4)对步骤2)中测序正确的阳性克隆提取质粒pMD-19T，用Ncol和EcoR I酶解质粒pMD-19T，回收间隔序列，并与步骤3)中的连接产物进行连接；

[0014] 5)连接产物转化大肠杆菌DH5a，挑取阳性单克隆，提取质粒，所得质粒即为植物双基因共表达载体pXCS-Dgene-HAStrep（图1），该载体能在一套真核表达系统中，独立表达两个基因。

[0015] 本发明所用的引物和接头序列如下：

[0016] SP-F CATGCCATGGTCTAGAGGATCCGGCTTA

[0017] SP-R GGAATTCGAACTTCACCAGCCCCTGTTC

[0018] SP-A1 AGCTTTGGTAC

[0019] SP-A2 CATGGTACCAA

[0020] 本发明一种植物双基因共表达载体的构建方法，该载体的成功构建和表达，可以克服多基因共表达的不均衡性，使各基因的表达趋于平衡；也能避免多质粒共转化系统中由于受到多种抗生素的选择而带来的困扰。本发明的优点在于①通过一个质粒同时对两个基因进行植物转化；②两个基因可以在一个真核表达盒内独立表达；③克服了多基因共表达的不均衡性，对8株HbWRKY11和HbWRKY7的拟南芥共表达转基因植株进行基因表达分析，结果表明，HbWRKY11和HbWRKY7在转基因植株体内表达差异不显著（Pr>0.05），在植株间存在明显差异（图2，图3）；④利用bar基因做筛选标记基因，简化了转化植株的筛选程序；⑤本发明的质粒自身仅有5682Kb，可容纳较大的基因而不影响转化效率；⑥本发明的质粒可应用于农杆菌介导的植物遗传转化中。附图说明：

[0021] 图1：双基因共表达载体pXCS-Dgene-HAStrep的结构示意图。

[0022] 图2：HbWRKY11和HbWRKY7基因在共表达载体pXCS-HbWRKY11-HbWRKY7-HAStrep转化的拟南芥中的半定量PCR扩增图。

[0023] 图中：A为HbWRKY11的半定量PCR扩增图谱；B为HbWRKY7的半定量PCR扩增图谱；M为DNA marker；+为阳性对照质粒pXCS-HbWRKY11-HbWRKY7-HAStrep，泳道1为阴性对照野生型拟南芥；泳道2为空白对照；泳道S1-S8为拟南芥转基因植株株系S1-S8。

[0024] 图3：HbWRKY11和HbWRKY7基因在共表达载体pXCS-HbWRKY11-HbWRKY7-HAStrep转化的拟南芥中的荧光定量分析图。

[0025] 图中：纵轴为HbWRKY11和HbWRKY7在拟南芥转化苗中的相对表达量，横轴为拟南芥转化苗株系。

[0026] 图4：共表达载体pXCS-HbWRKY11-HbWRKY7-HAStrep结构示意图。

具体实施方式

[0027] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

[0028] 实施本发明时，以构建HbWRKY11和HbWRKY7的共表达载体为例做进一步描述，具体步骤如下：

[0029] 1.设计引物

[0030] 1)根据待扩增的间隔序列，设计引物，SP-F和SP-R，并在上游引物和下游引物中分别引入Ncol和EcoR Ⅰ酶切位点；

[0031] 2)根据pXCS-HAStrep载体多克隆位点结构特点，设计接头SP-A1和SP-A2。

[0032] 2.载体构建

[0033] 1)以载体pGWB605(GenBank登记号AB543114)为模板，SP-F/SP-R为引物，通过PCR扩增获取间隔序列，产物大小为341bp；

[0034] 2)将扩增产物与pMD-19T载体在16℃连接过夜，次日转化大肠杆菌DH5a，涂于含抗生素Carb的LB固体培养基，37℃培养12h，挑取阳性单克隆，提取质粒进行测序;

[0035] 3)用内切酶Hind III和EcoR I酶解质粒pXCS-HAStrep，回收大片段并与接头SP-A1/SP-A2连接；

[0036] 4)对步骤2)中测序正确的阳性克隆提取质粒pMD-19T，用Ncol和EcoR I酶解质粒pMD-19T，回收间隔序列，并与步骤3)中的连接产物进行连接；

[0037] 5)连接产物转化大肠杆菌DH5a，挑取阳性单克隆，提取质粒，所得质粒即为植物双基因共表达载体pXCS-Dgene-HAStrep;

[0038] 6)用Cla I和Hind III内切酶酶解质粒pXCS-Dgene-HAStrep，回收大片段产物；

[0039] 7)用Cla I和Hind III内切酶酶解末端带有Cla I和Hind III酶切位点的HbWRKY11基因开放阅读框（ORF）序列，回收酶解产物后与步骤6）中的大片段产物进行连接；

[0040] 8)用EcoR I和Pst I内切酶酶解步骤7）中的连接产物，回收大片段产物；

[0041] 9)用EcoR I和Pst I内切酶酶解末端带有EcoR I和Pst I酶切位点的HbWRKY7基因开放阅读框（ORF）序列，回收酶解产物后与步骤8）中的大片段产物进行连接；

[0042] 10)将连接产物转化大肠杆菌DH5a,涂布于含抗生素Carb的LB固体培养基上，37℃培养12h,挑取阳性单克隆，提取质粒，所得质粒即为HbWRKY11和HbWRKY7的双基因共表达载体pXCS-HbWRKY11-HbWRKY7-HAStrep（图3）。

[0043] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。