使用嵌合性嗅觉受体产生cAMP的方法

摘要

本发明提供使用嵌合性嗅觉受体产生cAMP的方法，其具备以下的工序：准备具备第1层、脂质双层膜及第2层的反应体系的工序（a），这里，脂质双层膜被第1层及第2层夹持，脂质双层膜具备嵌合性嗅觉受体及腺苷酸环化酶，嵌合性嗅觉受体贯穿脂质双层膜，腺苷酸环化酶贯穿脂质双层膜，第2层含有ATP及G蛋白，G蛋白配置在嵌合性嗅觉受体的一端附近，嵌合性嗅觉受体的N末端被Rho标签（序列号01）-myc附加表位（序列号04）的氨基酸序列修饰，并且IC4结构域被置换成β1肾上腺素能受体的IC4结构域；以及将刺激嵌合性嗅觉受体的化学物质供至第1层以由ATP产生cAMP的工序（b）。

权利要求

1.一种使用嵌合性嗅觉受体产生cAMP的方法，其具备以下的工序：准备具备第1层、脂质双层膜及第2层的反应体系的工序(a)，这里，所述脂质双层膜被所述第1层及所述第2层夹持，所述脂质双层膜具备所述嵌合性嗅觉受体及腺苷酸环化酶，所述嵌合性嗅觉受体贯穿所述脂质双层膜，所述腺苷酸环化酶贯穿所述脂质双层膜，

所述第2层含有ATP及G蛋白，

所述G蛋白配置在所述嵌合性嗅觉受体的一端附近，所述嵌合性嗅觉受体来自于由N末端-EC1结构域-TM1结构域-IC1结构域-TM2结构域-EC2结构域-TM3结构域-IC2结构域-TM4结构域-EC3结构域-TM5结构域-IC3结构域-TM6结构域-EC4结构域-TM7结构域-IC4结构域-C末端的氨基酸序列所构成的小鼠来源的嗅觉受体，所述嵌合性嗅觉受体的N末端被由序列号01所表示的氨基酸序列构成的Rho标签-序列号04所表示的myc附加表位的氨基酸序列修饰，并且所述IC4结构域被置换成β1肾上腺素能受体的IC4结构域，所述嵌合性嗅觉受体由序列号36、51、60或69所表示的氨基酸序列构成；以及将刺激所述嵌合性嗅觉受体的化学物质供至所述第1层以由所述ATP产生cAMP的工序(b)。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述小鼠来源的嗅觉受体为小鼠来源的丁子香酚识别嗅觉受体，所述化学物质为丁子香酚。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述小鼠来源的嗅觉受体为小鼠来源的嗅觉受体Olfr168，所述化学物质为2-戊酮。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述小鼠来源的嗅觉受体为小鼠来源的嗅觉受体Olfr15，所述化学物质为环己酮。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述小鼠来源的嗅觉受体为小鼠来源的嗅觉受体Olfr609，所述化学物质为香草酸。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，

所述G蛋白具备Gαolf、Gβ及Gγ，在所述工序(b)中，所述G蛋白分离为所述Gαolf及复合体，所述复合体由所述Gβ及所述Gγ构成，并且所述Gαolf将所述腺苷酸环化酶活化。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，

所述脂质双层膜还具备离子通道，

所述离子通道贯穿所述脂质双层膜，并且

所述工序(b)中产生的所述cAMP将所述离子通道活化。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述离子通道为钙离子通道。

9.一种判定试样溶液中是否含有刺激嵌合性嗅觉受体的分子的方法，其具备以下的工序：准备具备第1层、脂质双层膜及第2层的反应体系的工序(a)，这里，所述脂质双层膜被所述第1层及所述第2层夹持，所述第1层及所述第2层中的至少任一层含有离子，所述脂质双层膜具备所述嵌合性嗅觉受体、离子通道及腺苷酸环化酶，所述嵌合性嗅觉受体贯穿所述脂质双层膜，所述腺苷酸环化酶贯穿所述脂质双层膜，

所述离子通道贯穿所述脂质双层膜，

所述第2层含有ATP及G蛋白，

所述G蛋白配置在所述嵌合性嗅觉受体的一端附近，所述嵌合性嗅觉受体来自于由N末端-EC1结构域-TM1结构域-IC1结构域-TM2结构域-EC2结构域-TM3结构域-IC2结构域-TM4结构域-EC3结构域-TM5结构域-IC3结构域-TM6结构域-EC4结构域-TM7结构域-IC4结构域-C末端的氨基酸序列所构成的小鼠来源的嗅觉受体，所述嵌合性嗅觉受体的N末端被由序列号01所表示的氨基酸序列构成的Rho标签-序列号04所表示的myc附加表位的氨基酸序列修饰，并且所述IC4结构域被置换成β1肾上腺素能受体的IC4结构域，所述嵌合性嗅觉受体由序列号36、51、60或69所表示的氨基酸序列构成；

将所述试样溶液供至所述第1层并对所述第1层及所述第2层中的至少任一层所含有的所述离子的浓度进行测定的工序(b)；以及在所述测定得到的离子的浓度发生变化时判定所述试样溶液含有所述刺激嵌合性嗅觉受体的分子的工序(c)。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述小鼠来源的嗅觉受体为小鼠来源的丁子香酚识别嗅觉受体，所述刺激嵌合性嗅觉受体的分子为丁子香酚。

11.根据权利要求9所述的方法，其中，所述小鼠来源的嗅觉受体为小鼠来源的嗅觉受体Olfr168，所述刺激嵌合性嗅觉受体的分子为2-戊酮。

12.根据权利要求9所述的方法，其中，所述小鼠来源的嗅觉受体为小鼠来源的嗅觉受体Olfr15，所述刺激嵌合性嗅觉受体的分子为环己酮。

13.根据权利要求9所述的方法，其中，所述小鼠来源的嗅觉受体为小鼠来源的嗅觉受体Olfr609，所述刺激嵌合性嗅觉受体的分子为香草酸。

14.根据权利要求9所述的方法，其中，所述G蛋白具备Gαolf、Gβ及Gγ，在所述工序(b)中，所述G蛋白分离成所述Gαolf及复合体，所述复合体由所述Gβ及所述Gγ构成，并且所述Gαolf将所述腺苷酸环化酶活化。

15.根据权利要求9所述的方法，其中，所述脂质双层膜还具备离子通道，

所述离子通道贯穿所述脂质双层膜，并且

所述工序(b)中产生的所述cAMP将所述离子通道活化。

16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述离子通道为钙离子通道。

17.一种对含有在试样溶液中且刺激嵌合性嗅觉受体的化学物质进行定量的方法，其具备以下的工序(a)～工序(c)：准备具备第1层、脂质双层膜及第2层的反应体系的工序(a)，这里，所述脂质双层膜被所述第1层及所述第2层夹持，所述第1层及所述第2层中的至少任一层含有离子，所述脂质双层膜具备所述嵌合性嗅觉受体、离子通道及腺苷酸环化酶，所述嵌合性嗅觉受体贯穿所述脂质双层膜，所述腺苷酸环化酶贯穿所述脂质双层膜，

所述离子通道贯穿所述脂质双层膜，

所述第2层含有ATP及G蛋白，

所述G蛋白配置在所述嵌合性嗅觉受体的一端附近，所述嵌合性嗅觉受体来自于由N末端-EC1结构域-TM1结构域-IC1结构域-TM2结构域-EC2结构域-TM3结构域-IC2结构域-TM4结构域-EC3结构域-TM5结构域-IC3结构域-TM6结构域-EC4结构域-TM7结构域-IC4结构域-C末端的氨基酸序列所构成的小鼠来源的嗅觉受体，所述嵌合性嗅觉受体的N末端被由序列号01所表示的氨基酸序列构成的Rho标签-序列号04所表示的myc附加表位的氨基酸序列修饰，并且所述IC4结构域被置换成β1肾上腺素能受体的IC4结构域，所述嵌合性嗅觉受体由序列号36、51、60或69所表示的氨基酸序列构成；

将所述试样溶液供至所述第1层并对所述第1层及所述第2层中的至少任一层所含有的所述离子的浓度进行测定的工序(b)；以及根据所述测定得到的离子的浓度的变化量对所述试样溶液中含有的所述化学物质进行定量的工序(c)。

18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述小鼠来源的嗅觉受体为小鼠来源的丁子香酚识别嗅觉受体，所述化学物质为丁子香酚。

19.根据权利要求17所述的方法，其中，所述小鼠来源的嗅觉受体为小鼠来源的嗅觉受体Olfr168，所述化学物质为2-戊酮。

20.根据权利要求17所述的方法，其中，所述小鼠来源的嗅觉受体为小鼠来源的嗅觉受体Olfr15，所述化学物质为环己酮。

21.根据权利要求17所述的方法，其中，所述小鼠来源的嗅觉受体为小鼠来源的嗅觉受体Olfr609，所述化学物质为香草酸。

22.根据权利要求17所述的方法，其中，所述G蛋白具备Gαolf、Gβ及Gγ，在所述工序(b)中，所述G蛋白分离为所述Gαolf及复合体，所述复合体由所述Gβ及所述Gγ构成，并且所述Gαolf将所述腺苷酸环化酶活化。

23.根据权利要求17所述的方法，其中，所述脂质双层膜还具备离子通道，

所述离子通道贯穿所述脂质双层膜，并且

所述工序(b)中产生的所述cAMP将所述离子通道活化。

24.根据权利要求23所述的方法，其中，所述离子通道为钙离子通道。

25.由序列号36表示的嵌合性嗅觉受体。

26.由序列号51表示的嵌合性嗅觉受体。

27.由序列号60表示的嵌合性嗅觉受体。

28.由序列号69表示的嵌合性嗅觉受体。

29.一种脂质双层膜，其是在用于对试样溶液中含有的化学物质进行检测或定量所使用的反应体系中具备的脂质双层膜，其中，所述脂质双层膜具备所述嵌合性嗅觉受体、离子通道及腺苷酸环化酶，所述嵌合性嗅觉受体贯穿所述脂质双层膜，所述腺苷酸环化酶贯穿所述脂质双层膜，

所述离子通道贯穿所述脂质双层膜，

所述嵌合性嗅觉受体来自于由N末端-EC1结构域-TM1结构域-IC1结构域-TM2结构域-EC2结构域-TM3结构域-IC2结构域-TM4结构域-EC3结构域-TM5结构域-IC3结构域-TM6结构域-EC4结构域-TM7结构域-IC4结构域-C末端的氨基酸序列所构成的小鼠来源的嗅觉受体，所述嵌合性嗅觉受体的N末端被由序列号01所表示的氨基酸序列构成的Rho-序列号

04所表示的myc的氨基酸序列修饰，并且所述IC4被置换成β1肾上腺素能受体的IC4，所述嵌合性嗅觉受体由序列号36、51、60或69所表示的氨基酸序列构成。

30.一种用于对试样溶液中含有的化学物质进行检测或定量所使用的反应体系，其中，所述反应体系具备第1层、脂质双层膜及第2层，这里，所述脂质双层膜被所述第1层及所述第2层夹持，所述第1层及所述第2层中的至少任一层含有离子，所述脂质双层膜具备所述嵌合性嗅觉受体、离子通道及腺苷酸环化酶，所述嵌合性嗅觉受体贯穿所述脂质双层膜，所述腺苷酸环化酶贯穿所述脂质双层膜，

所述离子通道贯穿所述脂质双层膜，

所述第2层含有ATP及G蛋白，

所述G蛋白配置在所述嵌合性嗅觉受体的一端附近，所述嵌合性嗅觉受体来自于由N末端-EC1结构域-TM1结构域-IC1结构域-TM2结构域-EC2结构域-TM3结构域-IC2结构域-TM4结构域-EC3结构域-TM5结构域-IC3结构域-TM6结构域-EC4结构域-TM7结构域-IC4结构域-C末端的氨基酸序列所构成的小鼠来源的嗅觉受体，所述嵌合性嗅觉受体的N末端被由序列号01所表示的氨基酸序列构成的Rho标签-序列号04所表示的myc附加表位的氨基酸序列修饰，并且所述IC4被置换成β1肾上腺素能受体的IC4，所述嵌合性嗅觉受体由序列号36、51、60或69所表示的氨基酸序列构成。

说明书

使用嵌合性嗅觉受体产生cAMP的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及使用嵌合性嗅觉受体产生cAMP的方法。

背景技术

[0002] 嗅觉受体是三聚体G蛋白偶联受体（GPCR），更具体地说是三聚体G蛋白偶联七跨膜型受体的1种。

[0003] 图1表示将气味分子对细胞膜的刺激转换成电信号的机制。

[0004] 嗅觉受体是在细胞膜上表达的膜蛋白。该细胞膜主要由脂质双层膜构成。脂质双层膜具有各层由高密度排列的磷脂分子构成的双层结构。该脂质双层膜示意性地示于图1的中央。图1中，脂质双层膜的上侧为细胞外侧，而脂质双层膜的下侧为细胞内侧。在该嗅觉受体的附近配置有三聚体G蛋白。

[0005] 该三聚体G蛋白是由α亚基（Gαolf）、β亚基（Gβ）及γ亚基（Gγ）所构成的异三聚体。细胞含有腺苷酸环化酶。图1中，腺苷酸环化酶用符号“AC”表述。腺苷酸环化酶准确地说是跨膜型蛋白质。蛋白质RTP1S（序列号42）具有辅助嗅觉受体在细胞膜上表达的功能。另外，该蛋白质RTP1S与上述机制并不直接有关系。

[0006] 接着说明上述机制。气味分子结合在该嗅觉受体上。该结合将三聚体G蛋白分离为α亚基（Gαolf）和βγ复合体。该βγ复合体由亚基Gβ及Gγ构成。分离出的Gαolf将腺苷酸环化酶（AC）活化。活化后的腺苷酸环化酶（AC）将三磷酸腺苷（ATP）转换成环状腺苷一磷酸（cAMP）。

[0007] 环状腺苷一磷酸（cAMP）将离子通道（具体地说，例如环核苷酸门控型离子通道（CNG））活化。该活化引起离子由细胞内被输送至细胞外、或者由细胞外被输送至细胞内。该离子的输送程度可以以电信号的形式被测定。

[0008] 当然，环状腺苷一磷酸（cAMP）的产生量越多，则可获得越多的电信 号。该更多的电信号使测定的精度提高。

[0009] 另外，已知对β1肾上腺素能受体的刺激会使细胞内的cAMP的产生量增加。可以预见组装了β1肾上腺素能受体的一部分的多个嗅觉受体会使cAMP增加、由此使测定精度提高。这种嗅觉受体、即组装了其他受体（这种情况下为β1肾上腺素能受体）的一部分的嗅觉受体被称作“嵌合性嗅觉受体”。

[0010] （现有技术文献的公开内容）

[0011] 非专利文献1公开了肾上腺素能受体的细胞内结构域IC3及IC4是对于与三聚体G蛋白的相互作用重要的区域。

[0012] 非专利文献2公开了通过对IC3结构域导入点突变、对IC4结构域导入点突变、IC4结构域的缺损、或者用视紫红质（Rhodopsin）的IC4结构域将IC4结构域置换，cAMP的产生量会急剧降低。

[0013] 非专利文献3公开了在Rho-mOREG的N末端附加有Flag标签的Flag-Rho mOREG比Rho-mOREG更为迅速地向细胞膜表面移动，由此提高了嗅觉受体的应答。

[0014] 现有技术文献

[0015] 非专利文献

[0016] 非 专 利 文 献 1：Noel M.Delos Santos,Lidia A.Gαrdner,Stephen W.White,Suleiman W.Bahouth（2006）J.Biol.Chem.,281,12896-12907

[0017] 非 专 利 文 献 2 ：Kato A.,Katada S.,Touhara K.（2008）J.Neurochem.,107,1261-1270

[0018] 非 专 利 文 献 3 ：Katada S.,Tanaka M.,Touhara K.（2004）J.Neurochem.,90,1453-1463

发明内容

[0019] 发明要解决的技术问题

[0020] 但是，本发明人等发现了，与上述期待不同，绝大多数的嵌合性嗅觉受体会导致cAMP的产生量减少。

[0021] 本发明的目的在于提供使cAMP的产生量增加的嵌合性嗅觉受体。

[0022] 用于解决技术问题的手段

[0023] 以下的方法A1～C6、嵌合性嗅觉受体D1～D4、脂质双层膜E1～E5或者反应体系F1～F5解决上述技术问题：

[0024] A1.一种使用嵌合性嗅觉受体产生cAMP的方法，其具备以下的工序：

[0025] 准备具备第1层、脂质双层膜及第2层的反应体系的工序（a），

[0026] 这里，所述脂质双层膜被所述第1层及所述第2层夹持，

[0027] 所述脂质双层膜具备所述嵌合性嗅觉受体及腺苷酸环化酶，

[0028] 所述嵌合性嗅觉受体贯穿所述脂质双层膜，

[0029] 所述腺苷酸环化酶贯穿所述脂质双层膜，

[0030] 所述第2层含有ATP及G蛋白、

[0031] 所述G蛋白配置在所述嵌合性嗅觉受体的一端附近，

[0032] 所述嵌合性嗅觉受体来自于由（N末端）-EC1结构域-TM1结构域-IC1结构域-TM2结构域-EC2结构域-TM3结构域-IC2结构域-TM4结构域-EC3结构域-TM5结构域-IC3结构域-TM6结构域-EC4结构域-TM7结构域-IC4结构域-（C末端）的氨基酸序列所构成的小鼠来源的嗅觉受体，

[0033] 所述嵌合性嗅觉受体的N末端被Rho标签（序列号01）-myc附加表位（序列号04）的氨基酸序列修饰，并且

[0034] 所述IC4结构域被置换成β1肾上腺素能受体的IC4结构域；以及

[0035] 将刺激所述嵌合性嗅觉受体的化学物质供至所述第1层以由所述ATP产生cAMP的工序（b）。

[0036] A2.根据A1所记载的方法，其中，所述小鼠来源的嗅觉受体为小鼠来源的丁子香酚识别嗅觉受体，所述化学物质为丁子香酚。

[0037] A2-1.根据A1所记载的方法，其中，所述小鼠来源的嗅觉受体为小鼠来源的嗅觉受体Olfr168，所述化学物质为2-戊酮。

[0038] A2-2.根据A1所记载的方法，其中，所述小鼠来源的嗅觉受体为小鼠来源的嗅觉受体Olfr15，所述化学物质为环己酮。

[0039] A2-3.根据A1所记载的方法，其中，所述小鼠来源的嗅觉受体为小鼠来源的嗅觉受体Olfr609，所述化学物质为香草酸。

[0040] A3.根据A2所记载的方法，其中，所述嵌合性嗅觉受体由序列号36所表示的氨基酸序列构成。

[0041] A3-1.根据A2-1所记载的方法，其中，所述嵌合性嗅觉受体由序列号 51所表示的氨基酸序列构成。

[0042] A3-2.根据A2-2所记载的方法，其中，所述嵌合性嗅觉受体由序列号60所表示的氨基酸序列构成。

[0043] A3-3.根据A2-3所记载的方法，其中，所述嵌合性嗅觉受体由序列号69所表示的氨基酸序列构成。

[0044] A4.根据A1所记载的方法，其中，所述G蛋白具备Gαolf、Gβ及Gγ，

[0045] 在所述工序（b）中，所述G蛋白分离为所述Gαolf及复合体，

[0046] 所述复合体由所述Gβ及所述Gγ构成，并且

[0047] 所述Gαolf将所述腺苷酸环化酶活化。

[0048] A5.根据A1所记载的方法，其中，所述脂质双层膜还具备离子通道，

[0049] 所述离子通道贯穿所述脂质双层膜，并且

[0050] 所述工序（b）中产生的所述cAMP将所述离子通道活化。

[0051] A6.根据A5所记载的方法，其中，所述离子通道为钙离子通道。

[0052] B1.一种判定试样溶液是否含有刺激嵌合性嗅觉受体的分子的方法，其具备以下的工序：

[0053] 准备具备第1层、脂质双层膜及第2层的反应体系的工序（a），

[0054] 这里，所述脂质双层膜被所述第1层及所述第2层夹持，

[0055] 所述第1层及所述第2层中的至少任一层含有离子，

[0056] 所述脂质双层膜具备所述嵌合性嗅觉受体、离子通道及腺苷酸环化酶，[0057] 所述嵌合性嗅觉受体贯穿所述脂质双层膜，

[0058] 所述腺苷酸环化酶贯穿所述脂质双层膜，

[0059] 所述离子通道贯穿所述脂质双层膜，

[0060] 所述第2层含有ATP及G蛋白，

[0061] 所述G蛋白配置在所述嵌合性嗅觉受体的一端附近，

[0062] 所述嵌合性嗅觉受体来自于由（N末端）-EC1结构域-TM1结构域-IC1结构域-TM2结构域-EC2结构域-TM3结构域-IC2结构域-TM4结构域-EC3结构域-TM5结构域-IC3结构域-TM6结构域-EC4结构域-TM7结构域-IC4结构域-（C末端）的氨基酸序列所构成的小鼠来源的嗅觉受体，

[0063] 所述嵌合性嗅觉受体的N末端被Rho标签（序列号01）-myc附加表位（序列号04）的氨基酸序列修饰，并且

[0064] 所述IC4结构域被置换成β1肾上腺素能受体的IC4结构域；

[0065] 将所述试样溶液供至所述第1层并对所述第1层及所述第2层中的至少任一层所含有的所述离子的浓度进行测定的工序（b）；以及

[0066] 在所述测定得到的离子的浓度发生变化时判定所述试样溶液含有所述刺激嵌合性嗅觉受体的分子的工序（c）。

[0067] B2.根据B1所记载的方法，其中，所述小鼠来源的嗅觉受体为小鼠来源的丁子香酚识别嗅觉受体，所述化学物质为丁子香酚。

[0068] B2-1.根据B1所记载的方法，其中，所述小鼠来源的嗅觉受体为小鼠来源的嗅觉受体Olfr168，所述化学物质为2-戊酮。

[0069] B2-2.根据B1所记载的方法，其中，所述小鼠来源的嗅觉受体为小鼠来源的嗅觉受体Olfr15，所述化学物质为环己酮。

[0070] B2-3.根据B1所记载的方法，其中，所述小鼠来源的嗅觉受体为小鼠来源的嗅觉受体Olfr609，所述化学物质为香草酸。

[0071] B3.根据B2所记载的方法，其中，所述嵌合性嗅觉受体由序列号36所表示的氨基酸序列构成。

[0072] B3-1.根据B2-1所记载的方法，其中，所述嵌合性嗅觉受体由序列号51所表示的氨基酸序列构成。

[0073] B3-2.根据B2-2所记载的方法，其中，所述嵌合性嗅觉受体由序列号60所表示的氨基酸序列构成。

[0074] B3-3.根据B2-3所记载的方法，其中，所述嵌合性嗅觉受体由序列号69所表示的氨基酸序列构成。

[0075] B4.根据B1所记载的方法，其中，所述G蛋白具备Gαolf、Gβ及Gγ，

[0076] 在所述工序（b）中，所述G蛋白分离成所述Gαolf及复合体，

[0077] 所述复合体由所述Gβ及所述Gγ构成，并且

[0078] 所述Gαolf将所述腺苷酸环化酶活化。

[0079] B5.根据B1所记载的方法，其中，所述脂质双层膜还具备离子通道，

[0080] 所述离子通道贯穿所述脂质双层膜，并且

[0081] 所述工序（b）中产生的所述cAMP将所述离子通道活化。

[0082] B6.根据B5所记载的方法，其中，所述离子通道为钙离子通道。

[0083] C1.一种对含有在试样溶液中且刺激嵌合性嗅觉受体的化学物质进行 定量的方法，其具备以下的工序（a）～工序（c）：

[0084] 准备具备第1层、脂质双层膜及第2层的反应体系的工序（a），

[0085] 这里，所述脂质双层膜被所述第1层及所述第2层夹持，

[0086] 所述第1层及所述第2层中的至少任一层含有离子，

[0087] 所述脂质双层膜具备所述嵌合性嗅觉受体、离子通道及腺苷酸环化酶，[0088] 所述嵌合性嗅觉受体贯穿所述脂质双层膜，

[0089] 所述腺苷酸环化酶贯穿所述脂质双层膜，

[0090] 所述离子通道贯穿所述脂质双层膜，

[0091] 所述第2层含有ATP及G蛋白，

[0092] 所述G蛋白配置在所述嵌合性嗅觉受体的一端附近，

[0093] 所述嵌合性嗅觉受体来自于由（N末端）-EC1结构域-TM1结构域-IC1结构域-TM2结构域-EC2结构域-TM3结构域-IC2结构域-TM4结构域-EC3结构域-TM5结构域-IC3结构域-TM6结构域-EC4结构域-TM7结构域-IC4结构域-（C末端）的氨基酸序列所构成的小鼠来源的嗅觉受体，

[0094] 所述嵌合性嗅觉受体的N末端被Rho标签（序列号01）-myc附加表位（序列号04）的氨基酸序列修饰，并且

[0095] 所述IC4结构域被置换成β1肾上腺素能受体的IC4结构域；

[0096] 将所述试样溶液供至所述第1层并对所述第1层及所述第2层中的至少任一层所含有的所述离子的浓度进行测定的工序（b）；以及

[0097] 在所述测定得到的离子的浓度发生变化时判定所述试样溶液含有所述刺激嵌合性嗅觉受体的分子的工序（c）。

[0098] B2.根据B1所记载的方法，其中，所述小鼠来源的嗅觉受体为小鼠来源的丁子香酚识别嗅觉受体，所述刺激嵌合性嗅觉受体的分子为丁子香酚。

[0099] B2-1.根据B1所记载的方法，其中，所述小鼠来源的嗅觉受体为小鼠来源的嗅觉受体Olfr168，所述刺激嵌合性嗅觉受体的分子为2-戊酮。

[0100] B2-2.根据B1所记载的方法，其中，所述小鼠来源的嗅觉受体为小鼠来源的嗅觉受体Olfr15，所述刺激嵌合性嗅觉受体的分子为环己酮。

[0101] B2-3.根据B1所记载的方法，其中，所述小鼠来源的嗅觉受体为小鼠来源的嗅觉受体Olfr609，所述刺激所述嵌合性嗅觉受体的分子为香草酸。

[0102] B3.根据B2所记载的方法，其中，所述嵌合性嗅觉受体由序列号36所表示的氨基酸序列构成。

[0103] B3-1.根据B2-1所记载的方法，其中，所述嵌合性嗅觉受体由序列号51所表示的氨基酸序列构成。

[0104] B3-2.根据B2-2所记载的方法，其中，所述嵌合性嗅觉受体由序列号60所表示的氨基酸序列构成。

[0105] B3-3.根据B2-3所记载的方法，其中，所述嵌合性嗅觉受体由序列号69所表示的氨基酸序列构成。

[0106] B4.根据B1所记载的方法，其中，所述G蛋白具备Gαolf、Gβ及Gγ，

[0107] 在所述工序（b）中，所述G蛋白分离成所述Gαolf及复合体，

[0108] 所述复合体由所述Gβ及所述Gγ构成，并且

[0109] 所述Gαolf将所述腺苷酸环化酶活化。

[0110] B5.根据B1所记载的方法，其中，所述脂质双层膜还具备离子通道，

[0111] 所述离子通道贯穿所述脂质双层膜，并且

[0112] 所述工序（b）中产生的所述cAMP将所述离子通道活化。

[0113] B6.根据B5所记载的方法，其中，所述离子通道为钙离子通道。

[0114] D1.由序列号36表示的嵌合性嗅觉受体。

[0115] D2.由序列号51表示的嵌合性嗅觉受体。

[0116] D3.由序列号60表示的嵌合性嗅觉受体。

[0117] D4.由序列号69表示的嵌合性嗅觉受体。

[0118] E1.一种脂质双层膜，其为用于对试样溶液中含有的化学物质进行检测或定量所使用的反应体系中具备的脂质双层膜，其中，

[0119] 所述脂质双层膜具备所述嵌合性嗅觉受体、离子通道及腺苷酸环化酶，[0120] 所述嵌合性嗅觉受体贯穿所述脂质双层膜，

[0121] 所述腺苷酸环化酶贯穿所述脂质双层膜，

[0122] 所述离子通道贯穿所述脂质双层膜，

[0123] 所述嵌合性嗅觉受体来自于由（N末端）-EC1结构域-TM1结构域-IC1结构域-TM2结构域-EC2结构域-TM3结构域-IC2结构域-TM4结构域-EC3结构域-TM5结构域-IC3结构域-TM6结构域-EC4结构域-TM7结构域-IC4结构域-（C末端）的氨基酸序列所构成的小鼠来源的嗅觉受体，

[0124] 所述嵌合性嗅觉受体的N末端被Rho（序列号01）-myc（序列号04） 的氨基酸序列修饰，并且

[0125] 所述IC4被置换成β1肾上腺素能受体的IC4。

[0126] E2.根据E1所记载的脂质双层膜，其中，所述嵌合性嗅觉受体由序列号36所表示的氨基酸序列构成。

[0127] E3.根据E1所记载的脂质双层膜，其中，所述嵌合性嗅觉受体由序列号51所表示的氨基酸序列构成。

[0128] E4.根据E1所记载的脂质双层膜，其中，所述嵌合性嗅觉受体由序列号60所表示的氨基酸序列构成。

[0129] E5.根据E1所记载的脂质双层膜，其中，所述嵌合性嗅觉受体由序列号69所表示的氨基酸序列构成。

[0130] F1.一种用于对试样溶液中含有的化学物质进行检测或定量所使用的反应体系，其中，

[0131] 所述反应体系具备第1层、脂质双层膜及第2层，

[0132] 这里，所述脂质双层膜被所述第1层及所述第2层夹持，

[0133] 所述第1层及所述第2层中的至少任一层含有离子，

[0134] 所述脂质双层膜具备所述嵌合性嗅觉受体、离子通道及腺苷酸环化酶，[0135] 所述嵌合性嗅觉受体贯穿所述脂质双层膜，

[0136] 所述腺苷酸环化酶贯穿所述脂质双层膜，

[0137] 所述离子通道贯穿所述脂质双层膜，

[0138] 所述第2层含有ATP及G蛋白，

[0139] 所述G蛋白配置在所述嵌合性嗅觉受体的一端附近，

[0140] 所述嵌合性嗅觉受体来自于由（N末端）-EC1结构域-TM1结构域-IC1结构域-TM2结构域-EC2结构域-TM3结构域-IC2结构域-TM4结构域-EC3结构域-TM5结构域-IC3结构域-TM6结构域-EC4结构域-TM7结构域-IC4结构域-（C末端）的氨基酸序列所构成的小鼠来源的嗅觉受体，

[0141] 所述嵌合性嗅觉受体的N末端被Rho标签（序列号01）-myc附加表位（序列号04）的氨基酸序列修饰，并且

[0142] 所述IC4被置换成β1肾上腺素能受体的IC4。

[0143] F2.根据F1所记载的反应体系，其中，所述嵌合性嗅觉受体由序列号36所表示的氨基酸序列构成。

[0144] F3.根据F1所记载的反应体系，其中，所述嵌合性嗅觉受体由序列号51所表示的氨基酸序列构成。

[0145] F4.根据F1所记载的反应体系，其中，所述嵌合性嗅觉受体由序列号60所表示的氨基酸序列构成。

[0146] F5.根据F1所记载的反应体系，其中，所述嵌合性嗅觉受体由序列号69所表示的氨基酸序列构成。

[0147] 发明效果

[0148] 本发明提供使cAMP的产生量增加的嵌合性嗅觉受体。

附图说明

[0149] 图1表示将气味分子对细胞膜的刺激转换成电信号的机制。

[0150] 图2表示具有被Rho标签（Rho-tag）修饰过的N末端的嗅觉受体。

[0151] 图3表示具有被Rho标签及myc附加表位修饰过的N末端的嗅觉受体。

[0152] 图4表示IC4结构域被置换成β1肾上腺素能受体的IC4结构域、且N末端被Rho标签及myc附加表位修饰的嵌合性嗅觉受体。

[0153] 图5表示EC1结构域～IC1结构域及IC4结构域被置换成β1肾上腺素能受体的EC1结构域～IC1结构域及IC4结构域的嵌合性嗅觉受体。

[0154] 图6表示EC1结构域～IC1结构域及IC4结构域被置换成β1肾上腺素能受体的EC1结构域～IC1结构域及IC4结构域、且N末端被Rho标签及myc附加表位修饰的嵌合性嗅觉受体。

[0155] 图7表示TM7结构域及IC4结构域被置换成β1肾上腺素能受体的TM7结构域及IC4结构域、且N末端被Rho标签及myc附加表位修饰的嵌合性嗅觉受体。

[0156] 图8表示IC3结构域被置换成β1肾上腺素能受体的IC3结构域、且N末端被Rho标签及myc附加表位修饰的嵌合性嗅觉受体。

[0157] 图9表示IC3结构域及IC4结构域被置换成β1肾上腺素能受体的IC3结构域及IC4结构域、且N末端被Rho标签及myc附加表位修饰的嵌合性嗅觉受体。

[0158] 图10表示制备质粒（β1肾上腺素能受体）的步骤。

[0159] 图11表示制备质粒（Rho-mOREG）的步骤。

[0160] 图12表示制备质粒（Rho-myc-mOREG）的步骤。

[0161] 图13表示制备质粒（chimera1）的步骤。

[0162] 图14表示制备质粒（chimera2）的步骤。

[0163] 图15表示导入有β1肾上腺素能受体时的cAMP产生量及未导入β1肾上腺素能受体时的cAMP产生量。

[0164] 图16为表示实施例1-1及比较例1-1～比较例1-7的细胞内cAMP浓度增加量的曲线图。

[0165] 图17为表示Rho-mOREG、Rho-myc-mOREG及chimera1的相对于丁子香酚的浓度-应答曲线的曲线图。

[0166] 图18表示制备质粒（Rho-mycOlfr168）的步骤。

[0167] 图19表示制备质粒（Rho-mycOlfr15）的步骤。

[0168] 图20表示制备质粒（Rho-mycOlfr609）的步骤。

[0169] 图21表示制备质粒（chimera3）的步骤。

具体实施方式

[0170] （用语的定义）

[0171] 本说明书中使用的用语如下定义。

[0172] GPCR：G蛋白偶联受体

[0173] IC结构域：细胞内结构域

[0174] EC结构域：细胞外结构域

[0175] TM结构域：跨膜结构域

[0176] Gαolf：在嗅上皮中特异性表达的G蛋白α亚基

[0177] Gβ：G蛋白β亚基

[0178] Gγ：G蛋白γ亚基

[0179] AC：腺苷酸环化酶

[0180] ATP：三磷酸腺苷

[0181] cAMP：环状腺苷一磷酸

[0182] Rho标签：牛视紫红质的N末端侧开始至第20个的氨基酸。更详细地请参见序列号01（牛视神经视紫红质来源）。

[0183] β1AR：β1肾上腺素能受体

[0184] RTP1S：将RTP1（受体转运蛋白1）的N末端开始至第36个的氨基酸序列删除后的受体转运蛋白。详细地请参见序列号42及Matsunami et al.,J.Biol.Chem.,2007,282,15284。

[0185] CNG：环核苷酸门控型离子通道

[0186] 质粒（xx）：含有编码蛋白质xx的基因的质粒

[0187] 基因片段（xx）：含有编码蛋白质xx的基因的基因片段

[0188] mOREG：小鼠来源的丁子香酚识别嗅觉受体（GenBank注册号：AB061228.1）[0189] Olfr73：小鼠来源的丁子香酚识别嗅觉受体，与mOERG同样

[0190] Olfr168：小鼠来源的2-戊酮识别嗅觉受体（请参见序列号43）

[0191] Olfr15：小鼠来源的环己酮识别嗅觉受体（请参见序列号44）

[0192] Olfr609：小鼠来源的香草酸识别嗅觉受体（请参见序列号45）

[0193] 小鼠来源的嗅觉受体的例子为小鼠来源的丁子香酚识别嗅觉受体mOREG、小鼠来源的嗅觉受体Olfr168、小鼠来源的嗅觉受体Olfr15或小鼠来源的嗅觉受体Olfr609。

[0194] 小鼠来源的丁子香酚识别嗅觉受体mOREG识别丁子香酚。换而言之，小鼠来源的丁子香酚识别嗅觉受体mOREG被丁子香酚刺激。丁子香酚作为针对小鼠来源的丁子香酚识别嗅觉受体mOREG的气味分子发挥功能。小鼠来源的丁子香酚识别嗅觉受体mOREG被称作小鼠来源的嗅觉受体Olfr73。

[0195] 小鼠来源的嗅觉受体Olfr168识别2-戊酮。换而言之，小鼠来源的嗅觉受体Olfr168被2-戊酮刺激。2-戊酮作为针对小鼠来源的嗅觉受体Olfr168的气味分子发挥功能。

[0196] 小鼠来源的嗅觉受体Olfr15识别环己酮。换而言之，小鼠来源的嗅觉受体Olfr15被环己酮刺激。环己酮作为针对小鼠来源的嗅觉受体Olfr15的气味分子发挥功能。

[0197] 小鼠来源的嗅觉受体Olfr609识别香草酸。换而言之，小鼠来源的嗅觉受体Olfr609被香草刺激。香草酸作为针对小鼠来源的嗅觉受体Olfr609的气味分子发挥功能。

[0198] 小鼠来源的嗅觉受体由7个跨膜结构域（TM1-TM7）、4个细胞外结 构域（EC1-EC4）及4个细胞内结构域（IC1-IC4）构成。即，小鼠来源的嗅觉受体的氨基酸序列由（N末端）-EC1结构域-TM1结构域-IC1结构域-TM2结构域-EC2结构域-TM3结构域-IC2结构域-TM4结构域-EC3结构域-TM5结构域-IC3结构域-TM6结构域-EC4结构域-TM7结构域-IC4结构域-（C末端）的氨基酸序列构成。

[0199] 如图2所示，细胞外EC1结构域的N末端用Rho标签进行修饰。该Rho标签由MNGTEGPNFYVPFSNKTGVV（序列号01）所表示的氨基酸序列构成。Rho标签已知会促进小鼠来源的嗅觉受体在细胞膜上的表达（Krautwust D.,Yau K.W.,Reed R.R.,（1999）,Cell,95,917-925）。

[0200] 小鼠来源的丁子香酚识别嗅觉受体（mOREG）由序列号02所表示的氨基酸序列（小鼠嗅球来源）构成。

[0201] 小鼠来源的丁子香酚识别嗅觉受体（mOREG）的各区域的氨基酸序列如下所示。氨基酸序列以从N末端向C末端的方向来记载。

[0202] EC1：MTLSDGNHSGΑVFTLLGFSDY

[0203] TM1：PELTIPLFLIFLTIYSITVVGNIGMIVIIRI

[0204] IC1：NPKLHI

[0205] TM2：PMYFFLSHLSFVDFCYSSIVAPKMLVNLVT

[0206] EC2：MNRG

[0207] TM3：ISFVGCLVQFFFFCTFVVTESFLLGVMAYDRFVAI

[0208] IC2：RNPLLYTVAMS

[0209] TM4：QRLCAMLVLGSYAWGVVCSLILTC

[0210] EC3：SALNLSFYGFNMINHFFCEFSSLLSLSRSDTS

[0211] TM5：VSQLLLFVFATFNEISTLLIILLSYVLI

[0212] IC3：VVTILKMKSASGR

[0213] TM6：RKAFSTCASHLTAITIFHGTILFLYCVPNSKN

[0214] EC4：SRHT

[0215] TM7：VKVASVFYTVVIPMLNPLIYSLRNKD

[0216] IC4：VKDTVKKIIGTKVYSS

[0217] 小鼠来源的嗅觉受体Olfr168由序列号43所表示的氨基酸序列构成。

[0218] 小鼠来源的嗅觉受体Olfr的各区域的氨基酸序列如下所示。氨基酸序 列以从N末端向C末端的方向来记载。

[0219] EC1：MEKWNQSSSDFILLGLLPQ

[0220] TM1：NQTGLLLMMLIILVFFLALFGNSAMIHLIRV

[0221] IC1：DPRLHT

[0222] TM2：PMYFLLSQLSLMDLMYISTTVPKMAFNFLS

[0223] EC2：GQKN

[0224] TM3：ISFLGCGVQSFFFLTMAGSEGLLLASMAYDRF

[0225] IC2：VAICHPLHYPIRMS

[0226] TM4：KIMCLKMIIGSWILGSINSLAHSI

[0227] EC3：YALHIPYCHSRSINHFFCDVPAMLPLACMDTW

[0228] TM5：VYEYMVFVSTSLFLLLPFLGITASYGRV

[0229] IC3：LFAVFHMRSKEGK

[0230] TM6：KKAFTTCSTHLTVVTFYYAPFVYTYLRPRSLR

[0231] EC4：SPT

[0232] TM7：EDKILTVFYTILTPMLNPIIYSLRNK

[0233] IC4：EVLGΑMTRVLGTFSSMKP

[0234] 小鼠来源的嗅觉受体Olfr15由序列号44所表示的氨基酸序列构成。

[0235] 小鼠来源的嗅觉受体Olfr15的各区域的氨基酸序列如下所示。氨基酸序列以从N末端向C末端的方向来记载。

[0236] EC1：MEVDSNSSSGSFILMGVSDH

[0237] TM1：PHLEIIFFAVILASYLLTLVGNLTIILLSRL

[0238] IC1：DARLHT

[0239] TM2：PMYFFLSNLSSLDLAFTTSSVPQMLKNLWG

[0240] EC2：PDKT

[0241] TM3：ISYGGCVTQLYVFLWLGΑTECILLVVMAFDRY

[0242] IC2：VAVCRPLHYMTVMN

[0243] TM4：PRLCWGLAAISWLGGLGNSVIQST

[0244] EC3：FTLQLPFCGHRKVDNFLCEVPAMIKLACGDTS

[0245] TM5：LNEAVLNGVCTFFTVVPVSVILVSYCFI

[0246] IC3：AQAVMKIRSVEGR

[0247] TM6：RKAFNTCVSHLVVVFLFYGSAIYGYLLPAKSS

[0248] EC4：NQS

[0249] TM7：QGKFISLFYSVVTPMVNPLIYTLRNK

[0250] IC4：EVKGΑLGRLLGKGRGΑS

[0251] 小鼠来源的嗅觉受体Olfr609由序列号45所表示的氨基酸序列构成。

[0252] 小鼠来源的嗅觉受体Olfr609的各区域的氨基酸序列如下所示。氨基酸序列以从N末端向C末端的方向来记载。

[0253] EC1：MSYSNHSSTSFFLTGLPGL

[0254] TM1：ETVYLWLSIPLCTMYIASLAGNGLILWVVKS

[0255] IC1：EPSLHQ

[0256] TM2：PMYYFLSMLAVTDLGLSVSTLPTMLTIYMMG

[0257] EC2：VSE

[0258] TM3：VALDMCLAQLFFIHTFSIMESSVLLTMAFDRVVAI

[0259] IC2：SSPLHYATILT

[0260] TM4：NPRVASLGMVILVRSIGLHIPAPI

[0261] EC3：MLKKLPYCQKRHLSHSYCLHPDVMKLACTDTR

[0262] TM5：INSAYGLFVVLSTLGVDSVLIVLSYGLI

[0263] IC3：LYTVLSIASKTER

[0264] TM6：LKALNTCVSHICSVLLFYTPMIGLSMIHRFG

[0265] EC4：KWASPC

[0266] TM7：SRVLLSYLHFLTPPVLNPVVYTIKTK

[0267] IC4：QIRQRIWRIFRCGGRSIGHIQGH

[0268] β1肾上腺素能受体（β1AR）由序列号3所表示的氨基酸序列构成。

[0269] 与小鼠来源的嗅觉受体同样，β1肾上腺素能受体（β1AR）也由7个跨膜区域（TM1-TM7）、4个细胞外区域（EC1-EC4）及4个细胞内区域（IC1-IC4）构成。

[0270] β1肾上腺素能受体（β1AR）的各区域的氨基酸序列如下所示。

[0271] EC1：MGΑGΑLALGΑSEPCNLSSAAPLPDGΑATAARLLVLASPPASLLPPASEGSAPLS[0272] TM1：QQWTAGMGLLLALIVLLIVVGNVLVIVAIAK

[0273] IC1：TPRLQTL

[0274] TM2：TNLFIMSLASADLVMGLLVVPFGΑTIVVW

[0275] EC2：GRWEYG

[0276] TM3：SFFCELWTSVDVLCVTASIETLCVIALDRYLAIT

[0277] IC2：LPFRYQSLL

[0278] TM4：TRARARALVCTVWAISALVSFLPILM

[0279] EC3：HWWRAESDEARRCYNDPKCCDFVTN

[0280] TM5：RAYAIASSVVSFYVPLCIMAFVYLRVFREAQ

[0281] IC3：KQVKKIDSCERRFLTGPPRPPSPAPSPSPGPPRPADSLANGRSSKRRPSRLVALRE[0282] TM6：QKALKTLGIIMGVFTLCWLPFFLANVVKAF

[0283] EC4：HRDLV

[0284] TM7：PDRLFVFFNWLGYANSAFNPIIYCRSPD

[0285] IC4：FRKAFQRLLCCARRAACRRRAAHGDRPRASGCLARAGPPPSPGΑPSDDDDDDAGΑTPPARLLEPWAGCNGGTTTVDSDSSLDEPGRQGFSSESKV

[0286] 与小鼠来源的嗅觉受体及β1AR同样，嵌合性嗅觉受体也由EC1～IC4的15个结构域构成。

[0287] 嵌合性嗅觉受体的各结构域从小鼠来源的嗅觉受体所含的相对应的结构域或者β1AR所含的相对应的结构域的任一者中选择。例如，嵌合性嗅觉受体的EC1结构域从小鼠来源的嗅觉受体所含的EC1结构域或β1AR所含的EC1结构域的任一者中选择。同样，嵌合性嗅觉受体的TM1、IC1、TM2、EC2、TM3、IC2、TM4、EC3、TM5、IC3、TM6，EC4、TM7及IC4结构域从小鼠来源的嗅觉受体所含的TM1、IC1、TM2、EC2、TM3、IC2、TM4、EC3、TM5、IC3、TM6，EC4、TM7及IC4结构域或者β1AR所含的TM1、IC1、TM2、EC2、TM3、IC2、TM4、EC3、TM5、IC3、TM6，EC4、TM7及IC4结构域的任一者中分别选择。

[0288] 因此，嵌合性嗅觉受体的理论上的个数为2＾15（2的15次方、32768）。

[0289] 已知β1肾上腺素能受体（β1AR）会使环状腺苷一磷酸（cAMP）的产生量增加。因此，期待如上获得的嵌合性嗅觉受体使cAMP的产生量增加。 但是，本发明人等发现，与上述期待不同，绝大多数的嵌合性嗅觉受体会减少cAMP的产生量。

[0290] 本发明人等发现，只有满足了以下（1）和（2）条件的嵌合性嗅觉受体才会使环状腺苷一磷酸（cAMP）的产生量增加。

[0291] （1）在Rho标签和EC1结构域之间插入EQKLISEEDL（序列号04，以下称作“myc附加表位”）的氨基酸序列；和

[0292] （2）将小鼠来源的嗅觉受体的IC4结构域置换成β1肾上腺素能受体（β1AR）的IC4结构域。

[0293] 请参见图4。

[0294] 由图4可知，嵌合性嗅觉受体的IC4结构域含有β1肾上腺素能受体的氨基酸序列的C末端。

[0295] （实验例）

[0296] 以下说明支持上述事项的实验例。

[0297] 表1及表2表示实验例中使用的引物。

[0298] 表1

[0299]

[0300] 表2

[0301]

[0302] （质粒（Gαolf）及质粒（RTP1S）的制备）

[0303] 首先制备质粒（Gαolf）及质粒（RTP1S）。

[0304] （质粒（Gαolf）的制备）

[0305] 已知Gαolf（GenBank注册号：AY179169.1）集中存在于嗅球中。因此，编码Gαolf的基因也由嗅球制备。由小鼠分离出嗅球。由该分离出的嗅球制备cDNA。通过使用该cDNA、引物22及引物23的PCR法来扩增Gαolf基因。

[0306] 将扩增后的Gαolf基因连接在克隆用的质粒上。实施使用了该克隆用质粒、引物24及引物25的PCR法。引物24具有限制酶位点EcoRI。引物25具有限制酶位点SalI。

[0307] 这样，获得在5’末端及3’末端具有限制酶位点EcoRI及SalI的Gαolf基因。

[0308] 利用限制酶EcoRI及SalI对所得的Gαolf基因进行处理。处理后，将 Gαolf基因连接在预先用限制酶EcoRI及SalI进行过处理的哺乳动物表达用质粒上。这样，获得质粒（Gαolf）。

[0309] （质粒（RTP1S）的制备）

[0310] 与Gαolf同样，已知小鼠来源的RTP1S（GenBank注册号：EU070411）也集中存在于嗅球中。因此，编码RTP1S的基因也与Gαolf的情况同样地由小鼠的嗅球制备。除了以下方面之外与质粒（Gαolf）的制备同样地制备质粒（RTP1S）：

[0311] 代替由引物22及引物23构成的引物组件而使用由引物26及引物27构成的引物组件；

[0312] 代替由引物24及引物25构成的引物组件而使用由引物28及引物29构成的引物组件。

[0313] （参考例1：β1AR）

[0314] 参考例1中，利用β1AR测定所提供的cAMP的浓度。参考例1大致分为3个工序，即工序1：质粒（β1AR）的制备、工序2：β1AR在细胞膜上的表达及工序3：利用激动剂测定cAMP的变化量。

[0315] （工序1：质粒（β1肾上腺素能受体）的制备）

[0316] 通过使用将大鼠心脏来源的RNA进行逆转录而获得的cDNA的PCR法，对β1肾上腺素能受体的基因进行扩增。参见图10来说明其制备步骤。图10表示制备用于表达β1肾上腺素能受体的质粒、即质粒（β1肾上腺素能受体）的步骤。如图10所示，根据上述PCR法，将靶基因（即编码β1肾上腺素能受体的基因）分割成2个基因片段。

[0317] 作为用于获得2个基因片段的引物，使用引物1～4。图10的左侧所示的一个基因片段是通过使用上述cDNA、引物1及引物2的PCR法获得的。图10的右侧所示的另一个基因片段是通过使用上述cDNA、引物3及引物4的PCR法获得的。如图10所示，cDNA具有限制酶位点HindIII。

[0318] 将所得的2个基因片段分别连接在质粒上。使用这2个质粒进行PCR反应。在用于一个基因片段的PCR反应中，使用引物5及引物2。引物5具有限制酶位点EcoRI。在用于另一个基因片段的PCR反应中，使用引物3及引物6。引物6具有限制酶位点SalI。

[0319] 分别用限制酶EcoRI及HindIII处理所扩增的一个基因片段的5’末端及 3’末端。分别用限制酶HindIII及SalI处理所扩增的另一个基因片段的5’末端及3’末端。将这2个基因片段连接在预先用限制酶EcoRI及SalI处理过的表达载体上。这样，获得质粒（β1AR）。

[0320] （工序2：β1AR在细胞膜上的表达）

[0321] 将质粒（Gαolf）、质粒（RTP1S）及质粒（β1AR）导入到HEK293T细胞中。

[0322] 具体地说，在各含有DMEM培养基（Sigma-Aldrich）的3个Petri培养皿中分别添加HEK293T细胞。DMEM培养基含有10%FBS（由life technologies invitrogen获得）、30units/mL青霉素（明治制果）及30mg/mL硫酸链霉素（明治制果）。

[0323] 添加后，HEK293T细胞主动地粘附在Petri培养皿的内壁上。将HEK293T细胞培养一晩。

[0324] 之后，利用脂质体转染法使用上述3个质粒将HEK293T细胞进行转化。之后将HEK293T细胞培养48小时，使由序列号03所表示的蛋白质（大鼠心脏来源）构成的β1AR在HEK293T细胞的细胞膜上表达。

[0325] （工序3：利用激动剂测定cAMP的变化量）

[0326] 含有经表达的β1AR的DMEM培养基被含有1mM IBMX（Calbiochem）的DMEM培养基置换。之后，在37℃的温度下将HEK293T细胞培养30分钟。简写“IBMX”是指3-异丁基-1-甲基黄嘌呤。IBMX是磷酸二酯酶抑制剂之一。IBMX会使不稳定的cAMP稳定。

[0327] 之后，将含有1mM IBMX的DMEM培养基置换成含有1mM IBMX的Opti-MEM培养基（由life technologies invitrogen获得）。

[0328] 在上述Opti-MEM培养基中添加有表3所示浓度的异丙基肾上腺素水溶液作为激动剂。在37℃的温度下将含有表达β1AR的HEK293T细胞的Opti-MEM培养基放置15分钟。

[0329] 将Opti-MEM培养基除去，在Petri培养皿的内壁上残留有HEK293T细胞。向Petri培养皿中添加0.1M HCl，在室温下放置10分钟。如此，使HEK293T细胞溶出，获得溶出液。将该溶出液以600g离心分离10分钟，获得上清作为样品溶液。

[0330] 样品溶液中所含的cAMP的量通过EIA（酶免疫测定，enzyme immuno assay）法来测定。

[0331] 为了将3个Petri培养皿中含有的细胞数量之差标准化，通过BCA（二喹啉甲酸，bicinchoninic acid）法测定所得上清中含有的蛋白质的量。

[0332] 根据下式计算cAMP的浓度。

[0333] cAMP的浓度＝所测得的cAMP的量/所测得的上清的蛋白质的量

[0334] （参考例2）

[0335] 参考例2中除了不使用质粒（β1AR）以外，进行与参考例1同样的实验。

[0336] 表3表示参考例1及参考例2中算出的cAMP的浓度。图15表示基于表3作成的曲线图。

[0337] 表3

[0338]

[0339] 由表3及图15可知，未导入β1AR时，细胞内cAMP浓度几乎未增加。而β1AR被异丙基肾上腺素刺激，使细胞内的cAMP浓度显著地增加。

[0340] （实验例1）

[0341] 实验例1中，产生了小鼠来源的丁子香酚识别嗅觉受体（mOREG）的基因重组蛋白。

[0342] 实验例1包含1个实施例（实施例1-1）及7个比较例（比较例1-1～比较例1-7）。

[0343] （比较例1-1：Rho-mOREG）

[0344] 图11表示制备用于表达小鼠来源的丁子香酚识别嗅觉受体 Rho-mOREG的质粒、即质粒（Rho-mOREG）的方法。该质粒（Rho-mOREG）用于表达图2所示的小鼠来源的丁子香酚识别嗅觉受体Rho-mOREG。以下将该嗅觉受体简记为“Rho-mOREG”。

[0345] （工序1：质粒（Rho-mOREG）的制备）

[0346] 首先，将编码mOREG的基因（GenBank注册号：AB061228.1）通过使用小鼠基因组DNA作为模板的PCR法进行扩增。该PCR法中，使用引物7及引物8。将扩增后的基因连接在克隆用的质粒上，将编码mOREG的基因进行克隆。

[0347] 接着，通过PCR法，在编码mOREG的基因的5’末端附加编码Rho标签的基因序列。编码Rho标签的基因序列由于具有60个碱基，因此编码Rho标签的基因序列的附加分为2个工序（即第1工序及第2工序）。

[0348] 在第1工序中，进行使用编码上述mOREG的质粒、引物8及引物9的PCR反应，获得在编码mOREG的基因的5’末端附加了31个碱基的基因片段。引物9具有该31个碱基。

[0349] 同样，在第2工序中，进行使用通过第1工序获得的基因片段、引物8及引物10的PCR反应，将添补的29个碱基附加在5’末端。引物10具有该添补的29个碱基。引物10还具有限制酶位点EcoRI。

[0350] 如此，将编码Rho标签（序列号01）的基因序列（60个碱基）附加在mOREG基因的5’末端上，获得Rho-mOERG基因片段。将该Rho-mOERG基因片段连接在哺乳动物表达质粒的EcoRI/SalI位点上。该哺乳动物表达质粒如图11所示，具有3个限制酶位点NheI、EcoRI及SalI。如此，获得质粒（Rho-mOREG）。该质粒（Rho-mOREG）不仅具有2个限制酶位点EcoRI及SalI，还具有限制酶位点NheI。

[0351] （工序2：Rho-mOREG在细胞膜上的表达）

[0352] 代替质粒（β1AR）而使用质粒（Rho-mOREG），除此之外与参考例1的工序2同样地进行表达。如此，使Rho-mOREG（序列号34）在细胞膜上表达。

[0353] （工序3：利用激动剂测定cAMP的变化量）

[0354] 代替异丙肾上腺素水溶液而使用具有300μM浓度的丁子香酚水溶液作为激动剂，除此之外与参考例1的工序3同样地测定cAMP浓度。

[0355] 根据所测得的cAMP浓度，根据以下等式计算浓度增加值。

[0356] 浓度增加值＝（丁子香酚的浓度为300μM时测得的cAMP浓度）-（丁子香酚的浓度为0μM时测得的cAMP浓度）

[0357] 丁子香酚的浓度为0μM时所测得的cAMP浓度为6.33×10-3pmol/μg。

[0358] （比较例1-2：Rho-myc-mOREG）

[0359] 图12表示制备用于表达小鼠来源的丁子香酚识别嗅觉受体Rho-myc-mOREG的质粒、即质粒（Rho-myc-mOREG）的步骤。该质粒（Rho-myc-mOREG）用于表达图3所示的小鼠来源的丁子香酚识别嗅觉受体Rho-myc-mOREG。该嗅觉受体简记为“Rho-myc-mOREG”。

[0360] （工序1：质粒（Rho-myc-mOREG）的制备）

[0361] 如图12所示，使用通过比较例1获得的质粒（Rho-mOREG）及2个引物组件，将2个基因片段扩增。

[0362] 其中一个基因片段通过使用质粒（Rho-mOREG）、引物11及引物12的PCR法进行扩增。引物12具有编码myc附加表位的基因序列的反义链及限制酶位点EcoRI。如此，将在Rho标签的3’末端附加有编码myc附加表位（序列号04）的基因序列的反义链的该一个基因片段进行了扩增。

[0363] 另一个基因片段通过使用质粒（Rho-mOREG）、引物13及引物14的PCR法进行扩增。引物13具有myc附加表位的一部分及限制酶位点EcoRI。如此，将在编码mOREG的基因的5’末端附加有编码myc附加表位（序列号04）的基因序列的一部分的该另一个基因片段进行了扩增。

[0364] 将如此扩增后的这2个基因片段混合。通过使用引物11及引物14的重叠延伸PCR法将这2个基因片段连接。将连接后的基因片段连接在预先用限制酶NheI及限制酶SalI进行过处理的哺乳动物表达用质粒上。如此，获得质粒（Rho-myc-mOREG）。

[0365] （工序2：Rho-myc-mOREG在细胞膜上的表达）

[0366] 代替质粒（β1AR）而使用质粒（Rho-myc-mOREG），除此之外与参考例1的工序2同样地进行表达。如此，使Rho-myc-mOREG（序列号35）在细胞膜上表达。

[0367] （工序3：使用激动剂测定cAMP的变化量）

[0368] 与比较例1-1的Rho-mOREG的工序3同样地计算浓度增加值。将算 出的浓度增加值示于表4及图16。

[0369] （实施例1-1：chemera1）

[0370] （工序1：质粒（chimera1）的制备）

[0371] 如图4所示，嵌合性嗅觉受体chimera1由Rho-myc-mOREG的IC4结构域被置换成β1肾上腺素能受体的IC4结构域的氨基酸序列构成。

[0372] 图13表示制备表达嵌合性嗅觉受体chimera1的质粒、即质粒（chemera1）的手法。该质粒（chemera1）用于表达图4所示的嵌合性嗅觉受体chimera1。以下将该嵌合性嗅觉受体简记为“chimera1”。

[0373] （工序1：质粒（chemera1）的制备）

[0374] 如图13所示，将编码不含IC4结构域的Rho-myc-mOREG的基因片段通过使用质粒（Rho-myc-mOREG）、引物11及引物15的PCR进行扩增。如图13的左上所示，夹在限制酶位点SalI及引物15之间的基因序列对应于mOREG的IC4结构域。实施例1-1中，未扩增mOREG的IC4结构域。

[0375] 另一方面，将编码β1肾上腺素能受体的IC4结构域的基因片段通过使用质粒（β1AR）、引物16及引物17的PCR进行扩增。如图13的右上所示，夹在限制酶位点SalI及引物16之间的基因序列对应于β1AR的IC4结构域。实施例1中，未扩增β1肾上腺素能受体的除IC4结构域以外的β1肾上腺素能受体结构域。

[0376] 将这2个基因片段通过使用引物11及引物17的重叠延伸PCR进行连接。

[0377] 将连接后的基因片段使用限制酶NheI及SalI进行处理。之后，将连接后的基因片段连接在预先用限制酶NheI及SalI进行过处理的哺乳动物表达用质粒上。如此，获得质粒（chimera1）。

[0378] （工序2：chimera1在细胞膜上的表达）

[0379] 代替质粒（β1AR）而使用质粒（chimera1），除此之外，与参考例1的工序2同样地进行表达。如此，使chimera1（序列号36）在细胞膜上表达。

[0380] （工序3：使用激动剂测定cAMP的变化量）

[0381] 与比较例1-1的Rho-mOREG的工序3同样地计算浓度增加值。将算出的浓度增加值示于表4及图16。

[0382] （比较例1-3：chimera2）

[0383] 如图5所示，嵌合性嗅觉受体chimera2由β1AR的EC1～IC1结构域、mOREG的TM2～TM7结构域及β1AR的IC4结构域构成。换而言之，嵌合性嗅觉受体chimera2由mOREG的EC1结构域、TM1结构域、IC1结构域及IC4结构域被置换成β1肾上腺素能受体的EC1结构域、TM1结构域、IC1结构域及IC4结构域的氨基酸序列构成。

[0384] 图14表示制备表达嵌合性嗅觉受体chimera2的质粒、即质粒（chemera2）的步骤。该质粒（chemera2）用于表达图5所示的嵌合性嗅觉受体chimera2。以下将该嵌合性嗅觉受体简记为“chimera2”。

[0385] （工序1：质粒（chimera2）的制备）

[0386] 如图14的左侧所示，通过使用质粒（β1AR）、引物11及引物18的PCR法将编码β1AR的EC1～IC1结构域的基因片段进行扩增。引物18具有限制酶位点MluI。

[0387] 同样，如图14的左侧所示，通过使用质粒（β1AR）、引物19及引物17的PCR法将编码β1AR的IC4的基因片段进行扩增。引物19具有限制酶位点XbaI。

[0388] 将如此获得的2个基因片段通过使用引物11及引物17的重叠延伸PCR法连接。

[0389] 将连接后的基因片段使用限制酶EcoRI及SalI进行处理。之后，将连接后的基因片段连接在预先用限制酶EcoRI及SalI进行过处理的哺乳动物表达用质粒上，获得图14的左下所示的质粒。

[0390] 另一方面，如图14的右侧所示，通过使用质粒（Rho-mOREG）、引物20及引物21的PCR法将编码mOREG的TM2～TM7结构域的基因片段进行扩增。引物20具有限制酶位点MluI。引物21具有限制酶位点XbaI。

[0391] 将所得基因片段利用限制酶MluI及XbaI进行处理。之后，将基因片段连接在图14的左下所示的质粒上。如此，获得图14的右下所示的质粒（chimera2）。

[0392] （工序2：chimera2在细胞膜上的表达）

[0393] 代替质粒（β1AR）而使用质粒（chimera2），除此之外与参考例1的工序2同样地进行表达。如此，使chimera2（序列号37）在细胞膜上表达。

[0394] （工序3：使用激动剂测定cAMP的变化量）

[0395] 与比较例1-1的Rho-mOREG的工序3同样地计算浓度增加值。将算出的浓度增加值示于表4及图16。

[0396] （比较例1-4：chimera3）

[0397] 如图6所示，嵌合性嗅觉受体chimera3由Rho标签、myc附加表位、β1AR的EC1～IC1结构域、mOREG的TM2～TM7结构域及β1AR的IC4结构域构成。换而言之，嵌合性嗅觉受体chimera3由Rho-myc-mOREG的EC1～IC1结构域及IC4结构域被置换成β1肾上腺素能受体的EC1～IC1结构域及IC4结构域的氨基酸序列构成。

[0398] （工序1：质粒（chimera3）的制备）

[0399] 如图21的左侧所示，使用质粒（β1肾上腺素能受体）、引物11及引物18将编码β1AR的EC1～IC1结构域的基因片段进行扩增。引物18具有限制酶位点MluI。

[0400] 同样，如图21的左侧所示，使用质粒（β1肾上腺素能受体）、引物17及引物19将编码β1AR的IC4结构域的基因片段进行扩增。引物19具有限制酶位点XbaI。引物19具有与引物18的基因序列的一部分互补的基因序列。

[0401] 将如此获得的2个基因片段通过使用引物11及引物17的重叠延伸PCR法连接，获得连接后的基因片段。

[0402] 另一方面，如图21的左下所示，将通过比较例1-2获得的质粒（Rho-myc-mOREG）使用限制酶EcoRI及SalI进行处理，获得除去了编码mOREG的基因序列的质粒。

[0403] 将连接在该质粒上的上述基因片段连接于上述质粒上，获得质粒（Rho-myc N-C）。

[0404] 如图21的右侧所示，使用质粒（Rho-mOREG）、引物20及引物21将编码mOREG的TM2～TM7结构域的基因片段进行扩增。引物20具有限制酶位点MluI。引物21具有限制酶位点XbaI。

[0405] 将扩增后的基因片段连接在上述质粒（Rho-myc N-C）上，获得质粒（chimera3）。

[0406] （工序2：chimera3在细胞膜上的表达）

[0407] 代替质粒（β1AR）而使用质粒（chimera3），除此之外与参考例1的工序2同样地进行表达。如此，使chimera3（序列号38）在细胞膜上表达。

[0408] （工序3：使用激动剂测定cAMP的变化量）

[0409] 与比较例1-1的Rho-mOREG的工序3同样地计算浓度的增加量。将算出的浓度的增加量示于表4及图16。

[0410] （比较例1-5：chimeraTM7）

[0411] 如图7所示，嵌合性嗅觉受体chimeraTM7由Rho标签、myc附加表位、mOREG的EC1～EC4结构域及β1AR的TM7～IC4结构域构成。换而言之，嵌合性嗅觉受体chimeraTM7由Rho-myc-mOREG的TM7结构域及IC4结构域被置换成β1肾上腺素能受体的TM7结构域及IC4结构域的氨基酸序列构成。

[0412] （工序1：质粒（chimeraTM7）的制备）

[0413] 以序列号39所示的氨基酸序列为基础，Takara-bio株式会社合成了chimeraTM7的基因片段。将合成后的chimeraTM7的基因片段连接在哺乳动物表达用质粒的EcoRI/SalI位点上。如此，获得质粒（chimeraTM7）。

[0414] （工序2：chimeraTM7在细胞膜上的表达）

[0415] 代替质粒（β1AR）而使用质粒（chimeraTM7），除此之外与参考例1的工序2同样地使chimeraTM7（序列号39）在细胞膜上表达。

[0416] （工序3：使用激动剂测定cAMP的变化量）

[0417] 与比较例1-1的Rho-mOREG的工序3同样地计算浓度的增加量。将算出的浓度的增加量示于表4及图16。

[0418] （比较例1-6：chimeraIC3）

[0419] 如图8所示，嵌合性嗅觉受体chimeraIC3由Rho标签、myc附加表位、mOREG的EC1～TM5结构域、β1AR的IC3结构域及mOREG的TM6～IC4结构域构成。换而言之，嵌合性嗅觉受体chimeraIC3具有Rho-myc-mOREG的IC3结构域被置换成β1肾上腺素能受体的IC3结构域的氨基酸序列。

[0420] （工序1：质粒（chimeraIC3）的制备）

[0421] 以序列号40表示的氨基酸序列为基础，Takara-bio株式会社合成了chimeraIC3的基因片段。将合成后的chimeraIC3的基因片段连接在哺乳动 物表达用质粒的EcoRI/SalI位点上。如此，获得质粒（chimeraIC3）。

[0422] （工序2：chimeraIC3在细胞膜上的表达）

[0423] 代替质粒（β1AR）而使用质粒（chimeraIC3），除此之外与参考例1的工序2同样地进行表达。如此，使chimeraIC3（序列号40）在细胞膜上表达。

[0424] （工序3：使用激动剂测定cAMP的变化量）

[0425] 与比较例1-1的Rho-mOREG的工序3同样地计算浓度的增加量。将算出的浓度的增加量示于表4及图16。

[0426] （比较例1-7：chimeraIC3-IC4）

[0427] 如图9所示，嵌合性嗅觉受体chimeraIC3-IC4由Rho标签、myc附加表位、mOREG的EC1～TM5结构域、β1AR的IC3结构域、mOREG的TM6～IC7结构域及β1AR的IC4结构域构成。换而言之，嵌合性嗅觉受体chimeraIC3-IC4由Rho-myc-mOREG的IC3结构域及IC4结构域被置换成β1肾上腺素能受体的IC3结构域及IC4结构域的氨基酸序列构成。

[0428] （工序1：质粒（chimeraIC3-IC4）的制备）

[0429] 以序列号41表示的氨基酸序列为基础，Takara-bio株式会社合成了编码chimeraIC3-IC4的基因片段。将合成后的chimeraIC3-IC4的基因片段连接在哺乳动物表达用质粒的EcoRI/SalI位点上。如此，获得质粒（chimeraIC3-IC4）。

[0430] （工序2：chimeraIC3-IC4在细胞膜上的表达）

[0431] 代替质粒（β1AR）而使用质粒（chimeraIC3-IC4），除此之外与参考例1的工序2同样地进行表达。如此，使chimeraIC3-IC4（序列号41）在细胞膜上表达。

[0432] （工序3：使用激动剂测定cAMP的变化量）

[0433] 与比较例1-1的Rho-mOREG的工序3同样地计算浓度的增加量。将算出的浓度的增加量示于表4及图16。

[0434] 表4表示实施例1-1及比较例1-1～1-7中算出的浓度增加值。图16是以表4为基础作成的曲线图。

[0435] 表4

[0436]

[0437] 由表4可知，使用chimera1时测定的cAMP的浓度增加值比使用其他mOREG来源的嗅觉受体时测定的cAMP的浓度增加值高得多。

[0438] （丁子香酚浓度依赖性）

[0439] 表5表示比较例1-1、比较例1-2及实施例1-1中使用具有30μM、300μM及1000μM浓度的丁子香酚水溶液时的浓度增加值。图17为以表5为基础作成的曲线图。

[0440] 表5

[0441]

[0442] 由表5可知，无论作为激动剂使用的丁子香酚的浓度如何，使用chimeral时测定的cAMP的浓度增加值都高于使用其他嗅觉受体时测定的cAMP的浓度增加值。

[0443] 本领域技术人员可根据激动剂适当地选择激动剂的浓度。

[0444] （实验例2）

[0445] 实验例2中，产生小鼠来源的2-戊酮识别嗅觉受体Olfr168的基因重组蛋白。

[0446] 实验例2包含1个实施例（实施例2-1）及1个比较例（比较例2-1）。

[0447] （比较例2-1：Rho-myc-Olfr168）

[0448] 图18表示制备用于表达小鼠来源的2-戊酮识别嗅觉受体Rho-myc-Olfr168的质粒、即质粒（Rho-myc-Olfr168）的步骤。该质粒（Rho-myc-Olfr168）用于表达小鼠来源的2-戊酮识别嗅觉受体Rho-myc-Olfr168。以下，将该嗅觉受体简记为“Rho-myc-Olfr168”。
与图2所示情况相同，嗅觉受体Rho-myc-Olfr168由Rho标签、myc附加表位及Olfr168的EC1～IC4结构域构成。嗅觉受体Rho-myc-Olfr168由序列号49所示的氨基酸序列构成。

[0449] （工序1：质粒（Rho-myc-Olfr168）的制备）

[0450] 如图18所示，作为具有编码Olfr168的基因（GenBank注册号：BC127969.1）的质粒，从Mammalian Gene Collection购入ID：40135070。将编码Olfr168的基因通过使用上述质粒、引物30（序列号46）及引物31（序列号47）的PCR法进行扩增。引物30及引物31分别具有限制酶位点EcoRI及SalI。如此，获得由序列号48表示的基因片段。

[0451] 另一方面，将通过比较例1-2获得的质粒（Rho-myc-mOREG）使用限制酶EcoRI及SalI进行处理，获得除去了编码mOREG的基因序列的质粒。将上述基因片段连接在该质粒上，获得质粒（Rho-myc-Olfr168）。质粒（Rho-myc-Olfr168）含有由序列号57表示的基因序列。

[0452] （工序2：Rho-myc-Olfr168在细胞膜上的表达）

[0453] 代替质粒（β1AR）而使用质粒（Rho-myc-Olfr168），除此之外与参考例1的工序2同样地进行表达。如此，使Rho-myc-Olfr168（序列号49）在细胞膜上表达。

[0454] （工序3：使用激动剂测定cAMP的变化量）

[0455] 代替丁子香酚水溶液而使用具有30、100、300、1000及3000μM浓度的2-戊酮水溶液作为激动剂，除此之外与比较例1-1的工序3同样地测定cAMP的浓度。将结果示于表6。

[0456] （实施例2-1：chimeraOlfr168）

[0457] 与图4所示情况同样，嵌合性嗅觉受体chimeraOlfr168由Rho标签、myc附加表位、Olfr168的EC1～TM7结构域及β1AR的IC4结构域构成。换而言之，嵌合性嗅觉受体chimeraOlfr168由Rho-myc-Olfr168的IC4结构 域被置换成β1肾上腺素能受体的IC4结构域的氨基酸序列构成。

[0458] （工序1：质粒（chimeraOlfr168）的制备）

[0459] 以序列号50所示的基因序列为基础，Takara-bio株式会社合成了编码chimeraOlfr168的基因片段（序列号67）。将chimeraOlfr168的所合成的该基因片段连接在哺乳动物表达用质粒的EcoRI/SalI位点上。如此，获得质粒（chimeraOlfr168）。

[0460] （工序2：chimeraOlfr168在细胞膜上的表达）

[0461] 代替质粒（β1AR）而使用质粒（chimeraOlfr168），除此之外与参考例1的工序2同样地进行表达。如此，使chimeraOlfr168（序列号51）在细胞膜上表达。

[0462] （工序3：通过激动剂对chimeraOlfr168的刺激来测定cAMP的变化量）[0463] 与比较例2-1的工序3同样地测定cAMP的浓度。

[0464] 表6表示实施例2-1及比较例2-1中测得的cAMP的浓度。

[0465] 表6

[0466]

[0467] 由表6可知，使用chimeraOlfr168测定的cAMP的浓度比使用Rho-myc-Olfr168测定的cAMP的浓度高得多。

[0468] （实验例3）

[0469] 实验例3中，产生小鼠来源的环己酮识别嗅觉受体Olfr15的基因重组蛋白。

[0470] 实验例3包含1个实施例（实施例3-1）及1个比较例（比较例3-1）。

[0471] （比较例3-1：Rho-myc-Olfr15）

[0472] C1.一种对含有在试样溶液中且刺激嵌合性嗅觉受体的化学物质进行（Rho-myc-Olfr15）用于表达图3所示小鼠来源的环己酮识别嗅觉受体Rho-myc-Olfr15。以下将该嗅觉受体简记为“Rho-myc-Olfr15”。如图3所示，嗅觉受体Rho-myc-Olfr15由Rho标签、myc附加表位、Olfr15的EC1～IC4结构域构成。嗅觉受体Rho-myc-Olfr15由序列号58所表示的氨基酸序列构成。

[0473] （工序1：质粒（Rho-myc-Olfr15）的制备）

[0474] 首先，将编码Olfr15的基因（GenBank注册号：BC146531）通过使用使用小鼠基因组DNA作为模板的PCR法进行扩增。该PCR法中，使用引物32（序列号52）及引物33（序列号53）。如此，获得由序列号56表示的基因片段。

[0475] 将该基因片段连接在克隆用质粒上，获得质粒。

[0476] 通过使用了该质粒、引物34（序列号54）及引物35（序列号55）的PCR法将该基因片段进行扩增。引物34（序列号54）及引物35（序列号55）分别具有限制酶部位EcoRI及SalI。

[0477] 另一方面，将通过比较例1-2获得的质粒（Rho-myc-mOREG）使用限制酶EcoRI及SalI进行处理，获得除去了编码mOREG的基因序列的质粒。将上述基因片段连接在该质粒上，获得质粒（Rho-myc-Olfr15）。质粒（Rho-myc-Olfr15）含有由序列号70表示的基因序列。

[0478] （工序2：Rho-myc-Olfr15在细胞膜上的表达）

[0479] 代替质粒（β1AR）而使用质粒（Rho-myc-Olfr15），除此之外与参考例1的工序2同样地进行表达。如此，使Rho-myc-Olfr15（序列号58）在细胞膜上表达。

[0480] （工序3：利用激动剂测定cAMP的变化量）

[0481] 代替丁子香酚水溶液而使用具有30μM、100μM、300μM、1000μM及3000μM浓度的环己酮水溶液作为激动剂，除此之外与比较例1-1的工序3同样地测定cAMP的浓度。将结果示于表7。

[0482] （实施例3-1：chimeraOlfr15）

[0483] 如图4所示，嵌合性嗅觉受体chimeraOlfr15由Rho标签、myc附加表位、Olfr15的EC1～TM7结构域及β1AR的IC4结构域构成。换而言之，嵌合性嗅觉受体chimeraOlfr15由Rho-myc-Olfr15的IC4结构域被置换成β1 肾上腺素能受体的IC4结构域的氨基酸序列构成。

[0484] （工序1：质粒（chimeraOlfr15）的制备）

[0485] 以序列号59所示的基因序列为基础，Takara-bio株式会社合成了编码chimeraOlfr15的基因片段（序列号68）。将合成的基因片段chimeraOlfr15连接在哺乳动物表达用质粒的EcoRI/SalI位点上。如此获得质粒（chimeraOlfr15）。

[0486] （工序2：chimeraOlfr15在细胞膜上的表达）

[0487] 代替质粒（β1AR）而使用质粒（chimeraOlfr15），除此之外与参考例1的工序2同样地进行表达。如此，使chimeraOlfr15（序列号60）在细胞膜上表达。

[0488] （工序3：通过激动剂对chimeraOlfr15的刺激来测定cAMP的变化量）

[0489] 与比较例3-1的工序3同样地测定cAMP的浓度。

[0490] 表7表示实施例3-1及比较例3-1中测得的cAMP的浓度。

[0491] 表7

[0492]

[0493] 由表7可知，使用chimeraOlfr15测定的cAMP的浓度比使用Rho-myc-Olfr15测定的cAMP的浓度高得多。

[0494] （实验例4）

[0495] 实验例4中，产生小鼠来源的香草酸识别嗅觉受体Olfr609的基因重组蛋白。

[0496] 实验例4包含1个实施例（实施例4-1）及1个比较例（比较例4-1）。

[0497] （比较例4-1：Rho-myc-Olfr168）

[0498] 图20表示制备用于表达小鼠来源的香草酸识别嗅觉受体Rho-myc-Olfr609的质粒、即质粒（Rho-myc-Olfr609）的方法。该质粒（Rho-myc-Olfr609）用于表达图3所示的小鼠来源的香草酸识别嗅觉受体 Rho-myc-Olfr609。以下将该嗅觉受体简记为“Rho-myc-Olfr609”。如图3所示，嗅觉受体Rho-myc-Olfr609由Rho标签、myc附加表位、Olfr609的EC1～IC4结构域构成。嗅觉受体Rho-myc-Olfr609由序列号64所表示的氨基酸序列构成。

[0499] （工序1：质粒（Rho-myc-Olfr609）的制备）

[0500] 首先，作为具有编码小鼠来源的香草酸识别嗅觉受体Olfr609的基因的质粒，从Mammalian Gene Collection购入ID：40135990。编码Olfr609的基因通过使用上述质粒、引物36（序列号61）及引物37（序列号62）的PCR法进行扩增。该PCR法中，使用引物36（序列号61）及引物37（序列号62）。引物36（序列号61）及引物37（序列号62）分别具有限制酶位点EcoRI及SalI。如此，获得由序列号63表示的基因片段。

[0501] 另一方面，将通过比较例1-2获得的质粒（Rho-myc-mOREG）使用限制酶EcoRI及SalI进行处理，获得除去了编码mOREG的基因序列的质粒。将上述基因片段连接在该质粒上，获得质粒（Rho-myc-Olfr609）。质粒（Rho-myc-Olfr609）含有由序列号71表示的基因序列。

[0502] （工序2：Rho-myc-Olfr609在细胞膜上的表达）

[0503] 代替质粒（β1AR）而使用质粒（Rho-myc-Olfr609），除此之外与参考例1的工序2同样地进行表达。如此，使Rho-myc-Olfr609（序列号64）在细胞膜上表达。

[0504] （工序3：利用激动剂测定cAMP的变化量）

[0505] 代替丁子香酚水溶液而使用具有0.3μM、1μM、3μM、10μM及30μM浓度的香草酸水溶液作为激动剂，除此之外与比较例1-1的工序3同样地测定cAMP的浓度。将结果示于表8。

[0506] （实施例4-1：chimeraOlfr609）

[0507] 如图4所示，嵌合性嗅觉受体chimeraOlfr609由Rho标签、myc附加表位、Olfr609的EC1～TM7结构域及β1AR的IC4结构域构成。换而言之，嵌合性嗅觉受体chimeraOlfr609由Rho-myc-Olfr609的IC4结构域被置换成β1肾上腺素能受体的IC4结构域的氨基酸序列构成。

[0508] （工序1：质粒（chimeraOlfr609）的制备）

[0509] 以序列号65表示的基因序列为基础，Takara-bio株式会社合成了chimeraOlfr609的基因片段（序列号66）。将所合成的基因片段chimeraOlfr609连接在哺乳动物表达用质粒的EcoRI/SalI位点上。如此，获得质粒（chimeraOlfr609）。

[0510] （工序2：chimeraOlfr609在细胞膜上的表达）

[0511] 代替质粒（β1AR）而使用质粒（chimeraOlfr609），除此之外与参考例1的工序2同样地进行表达。如此，使chimeraOlfr609（序列号69）在细胞膜上表达。

[0512] （工序3：通过激动剂对chimeraOlfr609的刺激来测定cAMP的变化量）[0513] 与比较例4-1的工序3同样地测定cAMP的浓度。

[0514] 表8表示实施例4-1及比较例4-1中测得的cAMP的浓度。

[0515] 表8

[0516]

[0517] 由表8可知，使用chimeraOlfr609测定的cAMP的浓度比使用Rho-myc-Olfr609测定的cAMP的浓度高得多。

[0518] 以上详细地说明了本发明，但前述的说明在所有方面都不过是本发明的示例，并非意欲限定其范围。在不脱离本发明范围的情况下当然可以进行各种改良或变形。可以理解本发明应仅通过权利要求书的范围来解释其范围。另外，可以理解本领域技术人员由本发明的具体实施方式的记载基于本发明的记载及技术常识可实施均等的范围。另外，整个本说明书中，单数形式的表现只要无特别说明，则也可以理解为还包含其复数形式的概念。因此，单数形式的冠词或形容词（例如英语情况下的“a”、“an”、“the”）只要无特别说明则也可以理解为还包含其复数形式的概念。另外，本说明书中使用的用语只要无特别说明，则可理解为以该领域中通常使用

[0519] 产业上的可利用性

[0520] 本发明提供使cAMP的产生量增加的嵌合性嗅觉受体。使用本发明的嵌合性嗅觉受体，可高灵敏度地对气味分子等化学物质进行检测或定量。

[0521] 序列表自由内容

[0522] 序列号1：牛视神经来源的视紫红质N末端片段

[0523] 序列号2：小鼠来源的丁子香酚识别嗅觉受体（小鼠嗅球来源）

[0524] 序列号3：β1肾上腺素能受体（β1AR；大鼠心脏来源）

[0525] 序列号4：抗体标记用标签

[0526] 序列号5：用于制备表达β1肾上腺素能受体的质粒的引物

[0527] 序列号6：用于制备表达β1肾上腺素能受体的质粒的引物

[0528] 序列号7：用于制备表达β1肾上腺素能受体的质粒的引物

[0529] 序列号8：用于制备表达β1肾上腺素能受体的质粒的引物

[0530] 序列号9：用于制备表达β1肾上腺素能受体的质粒的引物

[0531] 序列号10：用于制备表达β1肾上腺素能受体的质粒的引物

[0532] 序列号11：用于制备表达小鼠Rho-mOREG的质粒的引物

[0533] 序列号12：用于制备表达小鼠Rho-mOREG的质粒的引物

[0534] 序列号13：用于制备表达小鼠Rho-mOREG的质粒的引物

[0535] 序列号14：用于制备表达小鼠Rho-mOREG的质粒的引物

[0536] 序列号15：用于制备表达小鼠Rho-myc-mOREG的质粒的引物

[0537] 序列号16：用于制备表达小鼠Rho-myc-mOREG的质粒的引物

[0538] 序列号17：用于制备表达小鼠Rho-myc-mOREG的质粒的引物

[0539] 序列号18：用于制备表达小鼠Rho-myc-mOREG的质粒的引物

[0540] 序列号19：用于制备表达小鼠chimera1的质粒的引物

[0541] 序列号20：用于制备表达小鼠chimera1的质粒的引物

[0542] 序列号21：用于制备表达小鼠chimera1和2的质粒的引物

[0543] 序列号22：用于制备表达小鼠chimera2的质粒的引物

[0544] 序列号23：用于制备表达小鼠chimera2的质粒的引物

[0545] 序列号24：用于制备表达小鼠chimera2的质粒的引物

[0546] 序列号25：用于制备表达小鼠chimera2的质粒的引物

[0547] 序列号26：用于制备表达Gαolf的质粒的引物

[0548] 序列号27：用于制备表达Gαolf的质粒的引物

[0549] 序列号28：用于制备表达Gαolf的质粒的引物

[0550] 序列号29：用于制备表达Gαolf的质粒的引物

[0551] 序列号30：用于制备表达RTP1S的质粒的引物

[0552] 序列号31：用于制备表达RTP1S的质粒的引物

[0553] 序列号32：用于制备表达RTP1S的质粒的引物

[0554] 序列号33：用于制备表达RTP1S的质粒的引物

[0555] 序列号34：Rho-mOREG

[0556] 序列号35：Rho-myc-mOREG

[0557] 序列号36：chimera1

[0558] 序列号37：chimera2

[0559] 序列号38：chimera3

[0560] 序列号39：chimera TM7

[0561] 序列号40：chimera IC3

[0562] 序列号41：chimera IC3-IC4

[0563] 序列号42：小鼠来源的蛋白质RTP1S

[0564] 序列号43：小鼠来源的嗅觉受体Olfr168

[0565] 序列号44：小鼠来源的环己酮识别嗅觉受体

[0566] 序列号45：小鼠来源的香草酸识别嗅觉受体

[0567] 序列号46：用于制备表达Rho-myc-Olfr168的质粒的引物序列号47：用于制备表达Rho-myc-Olfr168的质粒的引物序列号48：小鼠来源的基因片段

[0568] 序列号49：Rho-myc-olfr168

[0569] 序列号50：用于制备表达ChimeraOlfr168的片段

[0570] 序列号51：ChimeraOlfr168

[0571] 序列号52：用于制备表达Rho-myc-Olfr15的质粒的引物

[0572] 序列号53：用于制备表达Rho-myc-Olfr15的质粒的引物

[0573] 序列号54：用于制备表达Rho-myc-Olfr15的质粒的引物

[0574] 序列号55：用于制备表达Rho-myc-Olfr15的质粒的引物

[0575] 序列号56：小鼠来源的基因片段

[0576] 序列号57：编码Rho-myc-Olfr168的片段

[0577] 序列号58：Rho-myc-Olfr15

[0578] 序列号59：用于制备ChimeraOlfr15的片段

[0579] 序列号60：ChimeraOlfr15

[0580] 序列号61：用于制备表达Rho-myc-Olfr609的质粒的引物序列号62：用于制备表达Rho-myc-Olfr609的质粒的引物序列号63：小鼠来源的基因片段

[0581] 序列号64：Rho-myc-olfr609

[0582] 序列号65：用于制备ChimeraOlfr609的片段

[0583] 序列号66：编码ChimeraOlfr609的片段

[0584] 序列号67：编码ChimeraOlfr168的片段

[0585] 序列号68：编码ChimeraOlfr15的片段

[0586] 序列号69：ChimeraOlfr609

[0587] 序列号70：编码Rho-myc-Olfr15的片段

[0588] 序列号71：编码Rho-myc-Olfr609的片段