具有β-木糖苷酶和β-葡萄糖苷酶活性的新的糖基水解酶及其应用

摘要

本发明提供了一种具有β-木糖苷酶和β-葡萄糖苷酶活性的新的糖基水解酶。该糖基水解酶能将7-木糖紫杉烷类化合物转化为7-羟基紫杉烷类化合物。

权利要求

1.一种糖基水解酶，其特征在于，所述糖基水解酶的氨基酸序列是SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

2.一种编码权利要求1中所述糖基水解酶的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列是SEQ ID NO:1或者SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。

4.一种含有权利要求2-3中任一项所述核苷酸序列的重组质粒。

5.一种含有权利要求2-3中任一项所述核苷酸序列的宿主细胞。

6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞可以是能够产生包括SEQ ID NO:2所示序列的同源产生菌，或者是异源宿主细胞。

7.根据权利要求6的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞的宿主生物选自细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌、植物细胞或动物细胞。

8.根据权利要求7的宿主细胞，其特征在于，

所述的细菌选自大肠埃希氏菌属(Escherichia species)、芽胞杆菌属(Bacillus species)；

所述的放线菌选自链霉菌属(Streptomyces species)；

所 述 的酵 母 菌 选 自 毕 赤 酵母 菌 属(Pichia species)、裂 殖 酵 母 菌 属(Schizosaccharomyce species)；

所述的丝状真菌选自曲霉属(Aspergillus species)、木霉属(Trichoderma species)、青霉属(Penicillium species)、口蘑属(Tricholoma species)、香菇属(Lentinula species)、伞菌属(Agaricus species)；

所述的植物细胞选自双子叶植物(dicotyledon)；

所述的动物细胞选自昆虫细胞。

9.根据权利要求7的宿主细胞，其特征在于，所述的酵母菌选自酵母菌属(Saccharomyce species)。

10.根据权利要求8或9所述的的宿主细胞，其特征在于，所述的大肠埃希氏菌属(Escherichia species)是大肠杆菌(E.coli)；

所述的芽胞杆菌属(Bacillus species)是枯草芽孢杆菌(B.subtilis)；

所述的链霉菌属(Streptomyces species)是变铅青链霉菌(S.lividans)；

所述的酵母菌属(Saccharomyce species)是酿酒酵母(Saccharomyce cerevisiae)；

所述的毕赤酵母菌属(Pichia species)是巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)；

所 述 的 裂 殖 酵 母 菌 属(Schizosaccharomyce species)是 粟 酒 裂 殖 酵 母(Schizosaccharomyce pombe)；

所述的曲霉属(Aspergillus species)是黑曲霉(A.niger)、米曲霉(A.oryzae)、构巢曲霉(A.nidulans)；

所述的木 霉属(Trichoderma species)是里氏 木霉(T.reesei)、绿色木 霉(T.viride)；

所述的青霉属(Penicillium species)是产黄青霉(Penicillium chrysogenum)；

所述的口蘑属(Tricholoma species)是口蘑(Trichoderma mongolicum)；

所述的香菇属(Lentinula species)是香菇(L.edodes)；

所述的伞菌属(Agaricus species)是双孢蘑菇(Agaricus bisporus)；

所述的双子叶植物(dicotyledon)是拟南芥(Arabidopsis thaliana)，所述的昆虫细胞是草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)Sf9细胞。

11.权利要求1中的糖基水解酶在水解底物去除木糖基和/或水解去除葡萄糖基中的应用。

12.权利要求5-10中任一项的宿主细胞在水解底物去除木糖基和/或水解去除葡萄糖基中的应用。

13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述的底物为糖苷化合物。

14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述的糖苷化合物选自含有木糖残基的化合物或含有葡萄糖残基的化合物。

15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述的含有木糖残基的化合物选自紫杉烷木糖苷类化合物。

16.根据权利要求15所述的应用，其特征在于，所述的含有紫杉烷木糖苷类化合物选自7-木糖紫杉烷类化合物。

17.根据权利要求16所述的应用，其特征在于，所述的7-木糖紫杉烷类化合物选自：

7-木糖紫杉醇、

7-木糖-10-去乙酰紫杉醇、

7-木糖三尖杉宁碱、

7-木糖-10-去乙酰三尖杉宁碱、

7-木糖紫杉醇C、

7-木糖-10-去乙酰紫杉醇C、

7-木糖巴卡亭III、

7-木糖-10-去乙酰巴卡亭III。

18.根据权利要求17所述的应用，其特征在于，所述的7-木糖紫杉烷类化合物经糖基水解酶水解去除木糖基后得到的产物为7-羟基紫杉烷类化合物，选自紫杉醇、

10-去乙酰紫杉醇、

三尖杉宁碱、

10-去乙酰三尖杉宁碱、

紫杉醇C、

10-去乙酰紫杉醇C、

巴卡亭III、

10-去乙酰巴卡亭III。

19.根据权利要求16所述的应用，其特征在于，所述的7-木糖紫杉烷类化合物选自带有木糖基的紫杉烷类的混合物。

20.根据权利要求19所述的应用，其特征在于，所述的紫杉烷类的混合物选自红豆杉属(Taxus)植物组织，红豆杉属植物细胞培养物，或者是能够产生7-木糖紫杉烷类化合物的微生物细胞培养物。

21.根据权利要求20所述的应用，其特征在于，所述的红豆杉属植物选自欧洲红豆杉(T.baccata)、短叶红豆杉(T.brevifolia)、喜马拉雅红豆杉(T.wallichiana)、曼地亚红豆杉(T.media)、中国红豆杉(T.chinensis)、云南红豆杉(T.yunnanensis)以及东北红豆杉(T.cuspidate)。

22.权利要求20所述的应用，其特征在于，所述的红豆杉属(Taxus)植物组织选自其根、针叶、树皮或整个苗木。

23.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述的糖基水解酶在水解底物去除木糖基和/或水解去除葡萄糖基中，水解反应时的溶剂选自：水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮、正己烷、氯仿、二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基亚砜(DMSO)。

说明书

具有β-木糖苷酶和β-葡萄糖苷酶活性的新的糖基水解

酶及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种新型的糖基水解酶(GH)、该酶的氨基酸序列及编码该酶的核苷酸序列。具体讲，该酶具有β-木糖苷酶-β-葡萄糖苷酶活性，并且能专一性地从7-木糖紫杉烷类化合物上水解去除木糖基，本发明涉及编码该7-木糖紫杉烷糖基水解酶的核苷酸序列、该酶的氨基酸序列以及该酶或者该酶产生菌的应用。

背景技术

[0002] 紫杉醇( ，Paclitaxel)主要由红豆杉属植物产生，作为二十世纪90年代抗癌药的重要成就之一，自问世以来，其独特的抗肿瘤机制和显著的抗肿瘤活性令世人瞩目(Kingston DGI，et al.The taxane diterpenoids.In：Herz W，et al.eds.Progress in the chemistry of organic natural products.New York：Springer-Verlag，1993，161-165)。它可以与微管蛋白结合，促进微管蛋白的聚合并抑制其解聚，阻止细胞有丝分裂过程中纺锤丝的形成，使细胞停滞于G2/M期(Horwitz SB.Taxol(paclitaxel)：mechanisms of action.Ann Oncol.1994a，5Suppl.)。目前紫杉醇在临床上被用作乳腺癌、卵巢癌和非小细胞肺癌等的一线药物。对头颈部癌症、黑色素瘤、结肠癌以及由HIV引起的卡波济肉瘤也有较好的疗效。

[0003] 紫杉醇在红豆杉植株中含量很低，即使是含量最高的部位树皮中也只有万分之二左右(美国专利US 6028206)。一颗生长百年的红豆杉老树可得到大约3公斤树皮，从中可制取300毫克左右的紫杉醇(Horwitz，SB.How to make taxol from scratch.Nature1994b，367：593-594)，因此，从树皮中每提取1公斤紫杉醇需要大约3000棵大树，而满足1例病人的用药量相当于毁掉3～4棵百年老树。有一种替代方法是从欧洲红豆杉(Taxus baccata L.)等的枝叶中提取含量较高的10-去乙酰巴卡亭III(含量可达0.1％左右)，以此为原料半合成紫杉醇或其结构类似物多西紫杉醇(taxotere)，后者的活性比紫杉醇稍强，水溶性也高于紫杉醇[Denis JN，et al.A highly efficient，practical approach to natural taxol.J Am Chem Soc.1988，110(17)：5917-5919；Horwitz RI.Studies with RP56976(Taxotere)：A semisynthet-ic analogue of taxol.J Nat Cancer Inst.1991，83(4)：288-291；美国专利US4814470]。灌木型红豆杉杂交种的苗圃栽培也被认为是已知的解决紫杉醇来源最简易、资源可再生、成本最低廉的方法。

[0004] 除了含量极低的紫杉醇以外，还从红豆杉树皮中分离到具有紫杉醇母核结构的C-7木糖紫杉烷类化合物(紫杉烷木糖苷)，包括7-木糖-10-去乙酰紫 杉 醇 (7-β-xylosyl-10-deacytyltaxol，XDT)、7-木 糖 -10-去 乙 酰 三 尖 杉 宁碱 (7-β-xylosyl-10-deacetylcepholomanine，XDC)、7- 木 糖 -10- 去 乙 酰 紫 杉醇C(7-β-xylosyl-10-deacytyltaxol C，XDTC)等，其中，7-木糖-10-去乙酰紫杉醇(7-β-xylosyl-10-deacytyltaxol，XDT)的含量最为丰富(Senilh V，et al.Mise en evidence de nouveaux analogues du taxol extraits de Taxus boccata.Nat Prod.1984，47：131-137；Rao KV.Taxol and related taxanes.I.Taxanes of Taxus brevifolia bark.Pharm Res.1993，10：521-524)。例如，XDT、XDC、XDTC的收率可以分别达到：0.5％，0.02％and0.0075％(欧洲专利EP0905130B1)。这些7-木糖紫杉烷类化合物可以用化学方法(美国专利US 6028206；欧洲专利EP 1298128B1)或生物方法(美国专利US 5700669；中国专利CN申请号No.200610046296.6；中国专利CN申请号No.200710012698.9)水解去除其上的木糖基，产生相应的7-羟基紫杉烷，后者可被用于化学半合成紫杉醇或多西紫杉醇，以提高红豆杉资源利用率和缓解红豆杉资源的供求矛盾。但比较而言，化学方法存在某些不足，如相对较低的收率、较为复杂的反应过程以及环境污染等，而生物方法则符合环保理念。

[0005] 美国及欧洲专利(US5700669A；EP0668360B1)及发表的相关论文(Hanson RL，et al.Enzymatic hydrolysis of7-xylosyltaxanes by xylosidase from Moraxella sp.Biotechnol Appl Biochem1997，26：153-158) 公 开 了 利 用 细 菌 Moraxella sp.(ATCC55475)、Bacillus macerans(ATCC55476)、Bacillus circulans(55477) 和Micrococcus sp.(ATCC55478)将C-7木糖紫杉烷转化为C-7羟基紫杉烷的水解方法，其中，Moraxella sp.的转化能力最强，在2ml细胞悬浮液中加入0.5mg7-木糖-10-去乙酰紫杉醇(XDT)(湿细胞91.5mg/ml；XDT0.25mg/ml)，28℃、12rpm条件下极向(end-over-end)混合21小时，用甲醇终止反应、HPLC检测，没有看到XDT剩余，产物DT的产率为0.23mg/ml。

[0006] 中国 专利 (申请 号200610046296.6)及 发表 的 相关 论文 (Hao DC，et al.Bacterial diversity of Taxus rhizosphere：culture-independent and culture-dependent approaches.FEMS Microbiol Lett2008，284：204-212)公开了利用放线菌Leifsonia shinshuensis DICP16(CCTCC No.M206026)将C-7木糖紫杉烷转化为C-7羟基紫杉烷的水解方法。利用类似于上述美国专利的培养及转化条件，在2ml菌体悬浮液中加入1mg XDT，在30℃、120rpm条件下反应21小时后用2ml甲醇终止反应，HPLC测得反应液中无XDT残留，产生0.4mg/ml DT。在另一个试验中，2ml反应液中湿细胞浓度为231.58mg/ml，7-木糖-10-去乙酰巴卡亭III以不同浓度(0.5，0.9，1.95，3.1，4.4，5.2，和6.75mg/ml)分别加入，在31℃、120rpm条件下反应40h以上，10-去乙酰巴卡亭III的收率在底物浓度为1.95mg/ml时达到最高(Hao DC，et al.Bacterial diversity of Taxus rhizosphere：cul-ture-independent and culture-dependent approaches.FEMS Microbiol Lett2008，284：204-212)。

[0007] 另一份中国专利(申请号200710012698.9)公开了放线菌纤维化纤维单孢菌(Cellulosimicrobium cellulans，XZ-5CCTCC No.M207130)、水解酶及其在紫杉烷转化方面的用途：将10ml XDT(浓度为5mg/ml)加入到90ml粗酶液(100ml培养液加入1ml30℃培养2天的纤维化纤维单孢菌种子液，150rpm，30℃摇瓶培养5天，离心收集上清即为粗酶液)，50rpm、30℃下反应20小时，产生40mg DT。

[0008] 总的来看，上述生物方法在水解7-木糖紫杉烷方面均有潜在的应用价值，但由于现存技术中的细胞酶量普遍偏低、底物在水中的溶解度不高等因素，导致产率不高，难以满足规模化工业生产的要求。

[0009] 有一些β-木糖苷酶已从真菌和其他生物中分离得到[Tuohy MG，et al.The xylan-degrading enzyme system of Talaromyces emersonii：novel enzymes with ac-tivity against aryl beta-D-xylosides and unsubstituted xylans.Biochem J.1993，290(Pt2)：515-523；Golubev AM，et al.Purification，crystallization and preliminary X-ray study of β-xylosidase from Trichoderma reesei.Acta Crystallogr D Biol Crystallogr.2000，56(Pt8)：1058-1060；Pan I，et al.Effective extraction and purifi-cation of beta-xylosidase from Trichoderma koningii fermentation culture by aqueous two-phase partitioning.Enzyme Microb Technol.2001，28(2-3)：196-201；Rizzatti ACS，et al.Purification and properties of a thermostable extracellular β-D-xylosidase produced by a thermotolerant Aspergillus phoenicis.J Ind Microbiol Biotechnol.2001，26(3)：156-160；Saha BC.Purification and characterization of an extracellular β-xylosidase from a newly isolated Fusarium verticillioides.J Ind Microbiol Biotechnol.2001，27(4)：241-245；Gargouri M，et al.Fungus be-ta-glycosidases：immobilization and use in alkyl-beta-glycoside synthesis.J Mol Catal B：Enzym.2004，29，Issues 1-6：
89-94；Lama L，et al.Purification and characterization of thermostable xylanase and β-xylosidase by the thermophilic bacterium Bacillus thermantarcticus.Res Microbiol.2004，155(4)：283-289；Belfaquih N & Penninckx MJ.A bifunctional β-xylosidase-xylose isomerase from Streptomyces sp.EC 10.Enzyme Microb Technol.2000，27(1-2)：114-121]，还成功克隆并鉴定了一些β-木糖苷酶基因(如几种真菌来源的β-木糖苷酶基因)[Margolles-Clark E，et al.Cloning of genes encoding alpha-L-arabinofuranosidase and beta-xylosidase from Trichoder-ma reesei by expression in Saccharomyces cerevisiae.Appl Environ Microbiol.1996，
62(10)：3840-3846.；van Peij NN，et al.β-Xylosidase activity，encoded by xlnD，is essential for complete hydrolysis of xylan by Aspergillus niger but not for induction of the xylanolytic enzyme spectrum.Eur J Biochem.1997，245(1)：
164-173；Perez-Gonzalez JA，et al.Molecular cloning and transcriptional regulation of the As-pergillus nidulans xlnD gene encoding a β-xylosidase.Appl Environ Microbiol.1998，64(4)：1412-1419；Kitamoto N，et al.Sequence analysis，overexpression，and anti-sense inhibition of a β-xylosidase gene，xylA，from Aspergillus oryzae KBN6l6.Appl Environ Microbiol.1999，65(1)：20-24；Berrin JG，et al.High-level production of re-combinant fungal endo-β-1，4-xylanase in the methylotrophic yeast Pichia pastoris.Protein Expr Purif.2000，19(1)：
179-187；Reen FJ，et al.Molecular characterisation and expression analysis of the first hemicellulase gene(bxll)encoding β-xylosidase from the thermophilic fungus Talaromyces emersonii.Biochem Biophys Res Commun.2003，305(3)：579-585；
Kurakake M，et al.Characteristics of transxylosylation by beta-xylosidase from Aspergillus awamori K4.Biochim Biophys Acta.2005，1726(3)：272-279；Wakiyama M，et al.Purification and properties of an extracellular β-Xylosidase from Aspergillus japonicus and sequence analysis of the encoding gene.J Biosci Bioeng.2008，106(4)：398-404]。然而，所有这些β-木糖苷酶(天然的或重组的)尚未见到能专一性水解7-木糖紫杉烷，因此有理由认为，迄今为止能够对7-木糖紫杉烷类化合物具有专一性催化活性的β-木糖苷酶的基因尚未见到克隆，更谈不上对其进行功能分析。事实上，有许多商品化的木糖苷酶、木聚糖酶和其他的糖苷酶根本不具备从
7-木糖紫杉烷上水解去除木糖基的能力(Hanson RL，et al.Enzymatic hydrolysis of
7-xylosyltaxanes by xylosidase from Moraxella sp.Bio-technol Appl Biochem1997，
26：153-158)。

发明内容

[0010] 鉴于现有技术中存在的上述问题，本发明的目的是提供一种新型的、高效的、能专一性地水解7-木糖紫杉烷木糖基的水解酶，及其基因序列。

[0011] 为解决上述技术问题，本发明的发明人进行了潜心的研究。首先，从具有专一性β-木糖苷酶活性、能够转化7-木糖紫杉烷为7-羟基紫杉烷的真菌M95.33中纯化专一性的7-木糖紫杉烷糖基水解酶(GH)，对纯化的酶进行LC-MS/MS De novo测序，得到一些寡肽的氨基酸序列。根据这些寡肽的氨基酸序列设计出一系列简并引物，通过巢式PCR、RACE和Genome Walking等分子生物学技术克隆该酶的cDNA及其结构基因。将编码该酶的开放阅读框(open reading frame，ORF)之cDNA片段与适当表达载体连接，构建重组质粒，后者被导入相应的宿主细胞，如生长快并能进行高密度发酵的毕赤酵母。重组菌能够高效催化7-木糖紫杉烷的糖基水解反应，产生7-羟基紫杉烷。发明人还发现该酶是一种双功能酶，能水解去除葡萄糖苷上的葡萄糖残基。

[0012] 该核苷酸序列与GenBank中已注册的所有核苷酸序列几乎没有同源性，最为接近者也多为假定蛋白基因序列，且两者的覆盖率仅3～7％；由其核苷酸序列推定的氨基酸序列与玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)的假定蛋白序列(GenBank accession：XP_760179)最为接近，可比较范围内两者的一致性为43％，相似性为59％。

[0013] 本发明包含了如下的发明：

[0014] 提供了一种新的7-木糖紫杉烷糖基水解酶，代号为Lxyl-p1。

[0015] 本发明的第二发明目的在于提供编码该酶的核苷酸序列。

[0016] 本发明的第三发明目的在于提供含有该核苷酸序列的重组质粒。

[0017] 本发明的第四发明目的在于提供含有该重组质粒或该核苷酸序列的宿主细胞。

[0018] 本发明的第五发明目的在于提供该酶的应用。

[0019] 为了实现本发明之目的，采用的技术方案为：

[0020] 本发明提供一种7-木糖紫杉烷的糖基水解酶(一种双功能的β-木糖苷酶-β-葡萄糖苷酶)，该酶代号为LXYL-P1。

[0021] 所述7-木糖紫杉烷糖基水解酶(LXYL-P1)的氨基酸序列包括SEQ ID NO：2所示序列的至少30％一致性的氨基酸序列；

[0022] 优选包括具有SEQ ID NO：2至少40％一致性的氨基酸序列；

[0023] 更优选包括具有SEQ ID NO：2至少50％一致性的氨基酸序列；

[0024] 进一步优选包括具有SEQ ID NO：2至少60％一致性的氨基酸序列；

[0025] 进一步优选包括具有SEQ ID NO：2至少70％一致性的氨基酸序列；

[0026] 进一步优选包括具有SEQ ID NO：2至少80％一致性的氨基酸序列；

[0027] 进一步优选包括具有SEQ ID NO：2至少90％一致性的氨基酸序列。

[0028] 进一步优选包括具有SEQ ID NO：2至少95％一致性的氨基酸序列。

[0029] 或者是SEQ ID NO：2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID NO：2衍生的蛋白质。

[0030] 本发明还提供了一种编码所述7-木糖紫杉烷糖基水解酶(LXYL-P1)的核苷酸序列或编码基因，代号为Lxyl-p1，其核苷酸序列具有SEQ ID NO：1或者SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的至少至少30％一致性的核苷酸序列；

[0031] 优选包括具有SEQ ID NO：1或者SEQ ID NO：3至少40％一致性的核苷酸序列；

[0032] 更优选包括具有SEQ ID NO：1或者SEQ ID NO：3至少50％一致性的核苷酸序列；

[0033] 进一步优选包括具有SEQ ID NO：1或者SEQ ID NO：3至少60％一致性的核苷酸序列；

[0034] 进一步优选包括具有SEQ ID NO：1或者SEQ ID NO：3至少70％一致性的核苷酸序列；

[0035] 进一步优选包括具有SEQ ID NO：1或者SEQ ID NO：3至少80％一致性的核苷酸序列；

[0036] 进一步优选包括具有SEQ ID NO：1或者SEQ ID NO：3至少90％一致性的核苷酸序列。

[0037] 进一步优选包括具有SEQ ID NO：1或者SEQ ID NO：3至少95％一致性的核苷酸序列。

[0038] 来自丝状真菌的基因，其与SEQ ID NO：1或者SEQ ID NO：3所示的DNA的全部或部分，或与和SEQ ID NO：1或者SEQ ID NO：3所示序列互补的DNA的全部或部分在严格条件下杂交，并且编码具有水解7-木糖紫杉烷木糖基活性的蛋白质。

[0039] 本发明还提供含有该核苷酸序列、编码Lxyl-p1的重组质粒，该质粒能够被导入到适当宿主细胞中。

[0040] 本发明还提供适当的宿主细胞，该宿主细胞可携带Lxyl-p1基因序列，该基因序列具有SEQ ID NO：1或者SEQ ID NO：3所示的至少30％一致性的核苷酸序列。其宿主生物可以是所述肽(LXYL-P1)的同源产生菌，该肽具有SEQ ID NO：2所示的至少30％一致性的氨基酸序列，也可以是异源宿主细胞。

[0041] 适宜的宿主生物选自细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌、植物细胞或动物细胞。

[0042] 优选的细菌选自大肠埃希氏菌属(Escherichia species)、芽胞杆菌属(Bacillus species)；

[0043] 优选的放线菌选自链霉菌属(Streptomyces species)；

[0044] 优选的酵母菌选自酵母菌属(Saccharomyce species)、毕赤酵母菌属(Pichia species)、裂殖酵母菌属(Schizosaccharomyce species)；

[0045] 优选的丝状真菌选自曲霉属(Aspergillus species)、木霉属(Trichoderma species)、青霉属(Penicillium species)、口蘑属(Tricholoma species)、香菇属(Lentinula species)、伞菌属(Agaricus species)；

[0046] 优选的植物细胞选自双子叶植物(dicotyledon)；

[0047] 动物细胞选自昆虫细胞。

[0048] 优选的大肠埃希氏菌属(Escherichia species)优选大肠杆菌(E.coli)；

[0049] 优选的芽胞杆菌属(Bacillus species)优选枯草芽孢杆菌(B.subtilis)；

[0050] 优选的链霉菌属(Streptomyces species)优选变铅青链霉菌(S.lividans)；

[0051] 优选的酵母菌属(Saccharomyce species)优选酿酒酵母(Saccharomyce cerevisiae)；

[0052] 优选的毕赤酵母菌属(Pichia species)优选巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)；

[0053] 优选的裂殖酵母菌属(Schizosaccharomyce species)优选粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyce pombe)；

[0054] 优选的曲霉属(Aspergillus species)优选黑曲霉(A.niger)、米曲 霉(A.oryzae)、构巢曲霉(A.nidulans)；

[0055] 优选的木霉属(Trichoderma species)优选里氏木霉(T.reesei)、绿色木霉(T.viride)；

[0056] 优 选 的 青 霉 属 (Penicillium species)优 选 产 黄 青 霉 (Penicillium chrysogenum)；

[0057] 优选的口蘑属(Tricholoma species)优选口蘑(Trichoderma mongolicum)；

[0058] 优选的香菇属(Lentinula species)优选香菇(L.edodes)；

[0059] 优选的伞菌属(Agaricus species)优选双孢蘑菇(Agaricus bisporus)；

[0060] 优选的双子叶植物(dicotyledon)优选拟南芥(Arabidopsis thaliana)；

[0061] 优选的昆虫细胞优选草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)Sf9细胞。

[0062] 本发明还提供了本发明的核苷酸序列、本发明的7-木糖紫杉烷糖基水解酶，以及含有本发明核苷酸序列的宿主细胞的应用。

[0063] 具体而言，所述的应用如下，使用本领域常规的方法将该DNA转化合适的宿主细胞，转化后的重组细胞，通过其产生的重组酶，水解各种底物，特别是糖苷化合物。

[0064] 优选的作为底物的糖苷化合物选自含有木糖残基的化合物或含有葡萄糖残基的化合物；即本发明的应用为从这类糖苷化合物上水解去除木糖基和/或葡萄糖基。

[0065] 优选的含有木糖残基的化合物选自紫杉烷木糖苷类化合物；所述的底物优选含7-木糖残基的紫杉烷类化合物，即，7-木糖紫杉烷，可以是天然形成的、或是非天然产生的，如化学或生物合成的、或半合成的。

[0066] 本发明的7-木糖紫杉烷糖基水解酶的应用优选是用于7-木糖紫杉烷的生物转化或生物催化制备7-羟基紫杉烷。

[0067] 作为底物7-木糖紫杉烷包括但不限于如下化合物：7-木糖-10-去乙酰紫杉醇、7-木糖-10-去乙酰三尖杉宁碱、7-木糖-10-去乙酰紫杉醇C、7-木糖-10-去乙酰巴卡亭III、7-木糖紫杉醇、7-木糖三尖杉宁碱、7-木糖紫杉醇C、7-木糖巴卡亭III；水解去除木糖基后得到的产物包括但不限于：10-去乙酰紫杉醇、10-去乙酰三尖杉宁碱、10-去乙酰紫杉醇C、10-去乙酰巴卡亭III、紫杉醇、三尖杉宁碱、紫杉醇C、巴卡亭III。

[0068] 这些底物单独或彼此混合或与其他紫杉烷相混合。

[0069] 所述的底物也可选自含木糖残基的紫杉烷类化合物的混合物，这类混合物包括但不限于红豆杉属(Taxus)植物组织，优选的红豆杉属植物选自欧洲红豆杉(T.baccata)、短叶红豆杉(T.brevifolia)、喜马拉雅红豆杉(T.wallichiana)、曼地亚红豆杉(T.media)、中国红豆杉(T.chinensis)、云南红豆杉(T.yunnanensis)、以及东北红豆杉(T.cuspidate)，或者是这些植物的细胞培养物，或者是能够产生7-木糖紫杉烷类化合物的微生物细胞培养物。这里所述的植物组织包括植物的根、针叶、树皮以及整个苗木。

[0070] 本发明提供的方法中制备的紫杉醇或其类似物(产物)，以及所用的C-7-木糖紫杉烷原料(底物)，其结构特征如通式I所示。

[0071]

[0072]

[0073]

[0074] 注：Ph为苯基，Bz为苯甲酰基，Ac为乙酰基

[0075] 溶解底物的溶剂可以选自：水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮、正己烷、氯仿、二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)。

[0076] 本发明的应用还包括将本发明的糖基水解酶用于改善面包特性，改善动物饲料特性，生产D-木糖用于制造木糖醇，和再生纸脱墨等。本发明的糖基水解酶还可与纤维素酶(cellulases)及半纤维素酶(hemicellulases)等合用，水解木质纤维获取单糖进而制备乙醇、丁醇等生物燃料。本发明的糖基水解酶还可从其它糖苷类化合物上释放出生物活性分子，应用于医药领域。

[0077] 本发明还提供了一种紫杉醇及其类似物的生物转化制备方法：以7-木糖紫杉烷为原料，利用含有本发明基因序列的宿主细胞或其产生的酶水解除去原料上的木糖基，得到紫杉醇或其类似物。优选的宿主细胞为口蘑科的真菌或重组菌，更优选的为毕赤酵母属的巴斯德毕赤酵母(简称毕赤酵母)。

[0078] 总而言之，本发明的双功能的糖基水解酶，其氨基酸序列包括SEQ ID NO：2所示序列的至少30％一致性的氨基酸序列，能被用于从7-木糖紫杉烷或其他糖苷化合物上去除木糖或葡萄糖。本发明亦涉及含有上述核苷酸序列的重组质粒、以及含有上述核苷酸序列的宿主细胞。本发明还涉及7-木糖紫杉烷糖基水解酶或含有7-木糖紫杉烷糖基水解酶的宿主细胞在水解去除木糖基和/或水解去除葡萄糖基方面的应用。

[0079] 本发明提供的一种能明确其氨基酸序列的双功能的β-木糖苷酶-β-葡萄糖苷酶——7-木糖紫杉烷糖基水解酶，系由一种口蘑科(Tricholomareceae)真菌香菇(Lentinula edodes M95.33)、或由含有该酶编码基因的重组细胞产生，可位于细胞内或分泌到细胞外，用于转化7-木糖紫杉烷为紫杉醇或其类似物。

[0080] 本发明的编码该糖基水解酶的核苷酸序列，包括完整的开放阅读框架(ORF)可以用来构建各种不同类型的重组表达质粒，后者被转移到原来的真菌或其他真菌宿主、或者被转移到原核细胞(包括大肠杆菌、放线菌)、植物细胞和动物细胞等宿主细胞，由于该糖基水解酶基因的表达可以使这些宿主获得水解7-木糖紫杉烷为7-羟基紫杉烷的能力。重组的宿主还可以用于其他含糖化合物的生物转化。

[0081] 本发明的应用还包括将本发明的糖基水解酶用于改善面包特性，改善动物饲料特性，生产D-木糖进而用于制造木糖醇，和再生纸脱墨等。本发明的糖基水解酶还可与纤维素酶(cellulases)及半纤维素酶(hemicellulases)等合用，水解木质纤维获取单糖进而制备乙醇、丁醇等生物燃料。本发明的糖基水解酶还可从其它糖苷类化合物上释放出生物活性分子，应用于医药领域。

[0082] 有益技术效果

[0083] 本发明首次克隆并异源表达了能专一性地催化7-木糖紫杉烷为7-羟基紫杉烷的糖基水解酶的基因，制备出具有该酶活性的生物工程菌，为大规模制备7-羟基紫杉烷提供了新的、有效的途径。

[0084] 术语和简称

[0085] CDS是指一个基因中编码蛋白的序列，从起始密码子到终止密码子。

附图说明

[0086] 图1.真菌M95.33蛋白提取物中β-木糖苷酶-β-葡萄糖苷酶的Phenyl Sepharose疏水柱层析(A)和XDT转化的薄层层析(TLC)(B)。

[0087] A：P1，LXYL-P1的活性洗脱峰；P2，LXYL-P2的活性洗脱峰。横坐标为不同流份(不同分部收集管序号)，纵坐标为A405(405nm)时的吸光值

[0088] B：1，XDT(对照)；2，DT(对照)；3，LXYL-P1生物转化XDT；4.LXYL-P2生物转化XDT。

[0089] 图2.LXYL-P1的SDS-PAGE电泳图。1，蛋白质分子量标记；2，LXYL-P1还原处理；3，LXYL-P1非还原处理。箭头表示用于LC-MS/MS分析的蛋白条带。

[0090] 图3.重组酵母菌落PCR鉴定琼脂糖凝胶电泳。M，分子量标记；1，重组菌GS115-9K(对照，转入pPIC9K)；2，重组菌GS115-9K-P1-2(转入pPIC9K-P1-2)；3，重组质粒pPIC9K-P1-2(对照)。

[0091] 图4.重组菌GS115-9K-P1-2和GS115-9K(对照)β-木糖苷酶活性的比较。

[0092] 图5.重组菌GS115-9K-P1-2转化XDT的HPLC分析。A，转化前；B，转化后。

[0093] 图6.重组菌GS115-3.5K-P1-2转化7-木糖紫杉烷混合物的HPLC分析。，A为混合底物(对照)；B为导入空载体的重组酵母+混合底物(对照)；C为导入Lxyl-p1基因的重组菌+混合底物。1、2、3分别代表7-木糖-10-去乙酰三尖杉宁碱(XDC)、7-木糖-10-去乙酰紫杉醇(XDT)、7-木糖-10-去乙酰紫杉醇C(XDTC)；1′、2′和3′分别为各自对应的7-羟基紫杉烷产物10-去乙酰三尖杉宁碱(DC)、10-去乙酰紫杉醇(DT)、10-去乙酰紫杉醇C(DTC)。

[0094] 图7.重组菌GS115-3.5K-P1-2转化7-木糖-10-去乙酰巴卡亭III的HPLC分析(保留时间为2min的溶剂峰在XDT之前)。

[0095] 图8.PCR扩增过程示意如图。

具体实施方式

[0096] 本发明通过下列实施例予以进一步阐明，这些实施例是仅用于说明性的，而不是以任何方式限制本发明权利要求的范围。

[0097] 实施例1：香菇β-木糖苷酶-β-葡萄糖苷酶(LXYL-P1)的纯化

[0098] 真菌M95.33的培养：从培养好的菌种斜面挑取约1cm2见方的菌苔，接种到100ml无菌的麦麸液体培养基中[麦麸培养基成分，每升含：麦麸50.00g(加适量水，煮沸30min，过滤去渣)，蛋白胨20.00g，KH2PO41.50g，MgSO40.75g，自然pH～6.3]，25～26℃、160rpm摇瓶培养6-8d。

[0099] 糖基水解酶的分离纯化与分析：过滤收集菌丝，加入液氮研磨后，按照3～5倍体积加入50mM Tris-HCl(pH8.0)蛋白裂解液，冰浴超声处理5min(130W，10秒/次，间隔10秒)。离心(12000rpm，10min)后收集上清为粗酶液，用于进一步分离纯化。

[0100] 以对硝基苯基-β-D-木糖苷(PNP-Xyl)作为特异性生色底物对有β-木糖苷酶活性的蛋白进行跟踪。一个酶单位定义为在50℃，pH5.0，以PNP-Xyl为底物，1min内催化产生1nmol对硝基酚所需要的酶量。

[0101] DEAE Sepharose FF阴离子交换柱(1.6cm×20cm)，用Tris-HCl缓冲液(50mM，pH8.0)平衡，将上述粗酶液(80～90ml/次)上柱，用含有0、0.1、0.25和2.0M NaCl的50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)阶段梯度洗脱(流速2ml/min)，收集有酶活性的0.1～0.25M NaCl洗脱组分并加入1M(NH4)2SO4用于下一步层析。

[0102] Phenyl Sepharose疏水柱(1.6cm×20cm)用含有1M(NH4)2SO4的(50mM，pH8.0)平衡，将上一步洗脱组分上柱，用含有1.0～0M(NH4)2SO4的Tris-HCl缓冲液(50mM，pH8.0)线性梯度洗脱(流速2ml/min)，收集有活性的酶活组分，用Tris-HCl缓冲液(50mM，pH8.0)透析。

[0103] 透析后的溶液上DEAE Sepharose FF阴离子交换柱[1.6cm×20cm，用Tris-HCl缓冲液(50mM，pH8.0)平衡]，用含有0.1～0.25M NaCl的Tris-HCl缓冲液(50mM，pH8.0)线性梯度洗脱(流速2ml/min)，收集酶活最高的组分，

[0104] 浓缩后上Sephacryl S200HR分子筛层析柱[1.6cm×60cm，用含有0.1M NaCl的Tris-HCl缓冲液(50mM，pH8.0)平衡]，用含有0.1M NaCl的Tris-HCl缓冲液(50mM，pH8.0)洗脱(流速2ml/min)，收集酶活最高的组分，最终得到纯化的酶。

[0105] 以上纯化过程可归纳为：

[0106]

[0107] P1的各个阶段纯化结果归纳于表1。

[0108] 表1：

[0109]

[0110] 用Phenyl Sepharose疏水柱线性梯度洗脱时得到两个独立的具有β-木糖苷酶活性的峰，分别命名为LXYL-P1(或P1)和LXYL-P2(或P2)。P1和P2均能水解7-木糖-10-去乙酰紫杉醇(XDT)为10-去乙酰紫杉醇(DT)(如图1所示)。其中，在图1中，A.为层析得到的酶活峰；B.为P1、P2酶活样品对底物XDT转化的薄层层析(TLC)。B中的1为XDT对照品，2为DT对照品，3为P1转化XDT，4为P2转化XDT。后经LC-MS/MS De novo测序结果分析，推定P1与P2具有相同的氨基酸残基序列，但为不同的糖基化类型。

[0111] 以下为水解XDT生成DT和木糖的反应方程式：

[0112]

[0113] 实施例2：LXYL-P1(或P1)蛋白水解不同糖苷类底物的特异性实验：

[0114] 除了具有β-木糖苷酶活性，尤其是具有水解7-木糖紫杉烷的活性以外，LXYL-P1(或P1)对其他糖苷化合物的特异性也进行了试验：选取4种生色底物：

[0115] 对硝 基 苯基-β-D- 葡萄 糖苷 (p-Nitrophenyl-beta-D-glucopyranoside，PNP-Glc)、

[0116] 对硝 基 苯基-β-D- 半乳 糖苷 (p-Nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，PNP-Gal)、

[0117] 对硝基苯基-α-L-阿拉伯糖苷(p-Nitrophenyl a-L-arabinopyranoside，PNP-Ara)和

[0118] 对硝基苯基-β-D-木糖苷(p-Nitrophenyl beta-D-xylopyranoside，PNP-Xyl)(对照)，

[0119] 均用50mM的醋酸缓冲液配制成5mM、pH5.0的溶液。

[0120] 取实施例1得到的25μl纯化的P1蛋白稀释液，加100μl生色底物，50℃，20min，用2ml饱和硼酸钠溶液终止反应，在405nm处检测对硝基苯酚(p-nitrophenol)释放情况(吸光值)。结果显示：P1蛋白能水解PNP-Glc和PNP-Xyl，不能水解PNP-Gal和PNP-Ara，结果见表2。

[0121] 表2：

[0122]

[0123]

[0124] 实施例3：糖基水解酶LXYL-P1编码基因(Lxyl-p1)的克隆

[0125] 将实施例1得到的LXYL-P1经SDS-PAGE电泳(见附图2)后，回收样品经还原处理、表观分子量在110KDa处的电泳条带，进行LC-MS/MS分析，挑选5个峰值最高的肽段进行De novo测序，获得5个肽段的氨基酸残基序列，分别为：

[0126] 1.LPWTWGK

[0127] 2.QSGSLPLQHPQR

[0128] 3.HWLAYEQETSR

[0129] 4.DLPVGDSAVVTYPPR

[0130] 5.TLTPLEALQK(其中I和L无法区分，K和Q无法区分)

[0131] 应用生物信息学手段对这5个肽段所处的相对位置进行评估，确定了其在LXYL-P1上的前后顺序为：3，2，5，1，4。根据肽段3和5分别设计上、下游简并引物：

[0132] 3F1：CTTGCGTACGAGCARGARAC

[0133] 3F2：CACTGGCTTGCGTAYGARCA

[0134] 3F3：CACTGGCTTGCNTAYG

[0135] 5R1：AGCCTCCAGTGGCGTNAGNGT

[0136] 5R2：CTGCAGAGCCTCCAGNGGNGT

[0137] 5R3：TTCTGCAGAGCCTCNAGNGG

[0138] 以真菌M95.33总RNA为模板，应用上述简并引物进行nest-PCR扩增。PCR产物经证实含有肽段3，2和5编码序列后，再利用RACE技术向两端扩增得到包含上述5个肽段编码区的cDNA片段，该片段含有2412bp的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF，或称为CDS，命名为Lxyl-p1)，编码803个氨基酸。该cDNA序列SEQ ID NO：3及其编码的氨基酸序列SEQ ID NO：2如附录所示。其PCR扩增过程如图8所示：

[0139] 根据此cDNA序列设计特异性引物，以真菌M95.33基因组DNA为模板，进行PCR扩增和染色体步移(Genome Walking)，获得LXYL-P1的结构基因序列(G-lxyl-pl)。在基因组水平，该基因含有19个外显子和18个内含子，从起始密码子ATG到终止密码子TGA共有3608bp，其核苷酸序列SEQ ID NO：1如附录所示。

[0140] 实施例4：重组质粒的构建和重组酵母菌的筛选

[0141] 将实施例3得到的P1编码区的ORF(Lxyl-p1)通过PCR方法在其5′-、3′-端分别引入SnaB I和Not I酶切位点，SnaB I/Not I双酶切后将其连接到同样用SnaB I/Not I双酶切的毕赤酵母表达载体pPIC9K(分泌型表达载体)或pPIC3.5K(非分泌型表达载体)上，形成重组表达质粒pPIC9K-P1-2或pPIC3.5K-P1-2。重组质粒通过Sac I单酶切线性化，电转入毕赤酵母GS115感受态细胞，同时，以空载体pPIC9K或pPIC3.5K用同样方法电转入毕赤酵母GS115感受态细胞作为对照。将转化后的酵母细胞涂布到MD平板[每升含：葡萄糖20.00g，无氨基酵母氮源(YNB)13.40g，生物素0.4mg，琼脂15.00g]上，28℃培养2～3天后挑取单菌落接种到 抗性平板上(每升含：酵母提取物10.00g，蛋白胨20.00g，葡萄糖20.00g，琼脂15.00g，抗生素G418≤4.00g)，继续培养2～3天后筛选抗性菌落，并对抗性菌落进行菌落PCR鉴定。以pPIC9K和pPIC9K-P1-2的转化子为例(附图3)：

[0142] PCR引物分别与pPIC9K载体上克隆位点两侧的AOX1序列相匹配：

[0143] 正向：5′GACTGGTTCCAATTGACAAGC 3′；

[0144] 反向：5′GGCAAATGGCATTCTGACATCC 3′。

[0145] 空载体pPIC9K转化菌株扩增出492bp的片段，而重组质粒pPIC9K-P1-2及其转化菌株均能扩增出2910bp的片段。其中，图3中1为导入空载体pPIC9K的重组酵母基因组对照扩增结果；2为导入pPIC9K-P1-2的重组酵母基因组扩增结果；3为pPIC9K-P1-2重组质粒对照扩增结果。

[0146] 用于培养重组酵母菌的种子和发酵培养基分别为BMGY(每升含：酵母提取物10.00g，蛋白胨20.00g，磷酸钾缓冲液100mM，pH6.0，甘油10ml)和BMMY(用10ml甲醇代替BMGY中的10ml甘油作为碳源)培养基。将筛选到的抗性菌株接种到10ml种子培养基中，
30℃，220rpm培养18h，离心洗涤菌体2次，并将菌体转入50ml发酵培养基，30℃，220rpm培养，每隔24h补加1％的甲醇诱导重组蛋白的表达，定时取样观察重组菌的酶活力。菌体经蒸馏水离心洗涤两遍后用同样体积蒸馏水悬浮，取50μl悬浮液加入100μl5mM PNP-Xyl，
30～55℃反应20min，可见到重组菌具有水解底物PNP-Xyl的能力，而转入空载体的对照菌没有酶活性(见附图4)，另外，重组菌的发酵液上清部分尚未检测到明显活性，说明重组酶主要位于细胞内。

[0147] 实施例5：重组酵母菌水解7-木糖-10-去乙酰紫杉醇(XDT)

[0148] 将实施例4得到的重组酵母菌GS115-9K-P1-2(分泌型表达重组质粒转化子)按照实施例4的方法诱导培养5天，离心收集并洗涤细胞，直接或冷干后用pH3.5～7.5的50mM醋酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液悬浮细胞(65mg湿细胞/ml，或16mg干细胞/ml)，作为水解反应液。在20ml菌体反应液中加入0.5ml的7-木糖-10-去乙酰紫杉醇(XDT)溶液，至XDT终浓度为0.625mg/ml，30～55℃水浴，往返震荡12h。

[0149] 反应结束后用乙酸乙酯萃取，经TLC分析底物已完全转化，HPLC[条件：色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18(4.6×150mm，5μm)，流动相：乙睛(38％～52％)，流速：1ml/min，柱温：28℃，检测波长：230nm]分析萃取物中底物XDT和产物DT含量，转化率为
98.80％。

[0150] 重组酵母菌水解XDT反应结果的HPLC分析如图5所示，其中A为转化前，B为转化后。

[0151] 实施例6：重组酵母菌水解7-木糖紫杉烷混合物

[0152] 将实施例4得到的重组酵母菌GS115-3.5K-P1-2(非分泌型表达重组质粒转化子)进行如下生物转化反应，转化底物为7-木糖紫杉烷混合物，主要成分含量为：7-木糖-10-去乙酰紫杉醇62.12％，7-木糖-10-去乙酰三尖杉宁碱12.75％，7-木糖-10-去乙酰紫杉醇C17.04％，其它成分约占8.09％。

[0153] 重组菌培养方法同实施例5。在200ml重组菌反应液中加入16ml浓度为100mg/ml的7-木糖紫杉烷混合物，至7-木糖紫杉烷混合物终浓度为8mg/ml(过饱和状态)。以导入空载体的重组酵母作为阴性对照。30～55℃、磁力搅拌混合24h。反应结束后按照实施例5的方法用HPLC分析转化体系中底物和产物含量(附图6)，转化率分别为：7-木糖-10-去乙酰紫杉醇(XDT)92.45％，7-木糖-10-去乙酰三尖杉宁碱(XDC)93.60％，7-木糖-10-去乙酰紫杉醇C(XDTC)92.00％。三种主要产物的产率分别为：10-去乙酰紫杉醇(DT)3.27mg/ml，10-去乙酰三尖杉宁碱(DC)0.74mg/ml，10-去乙酰紫杉醇C(DTC)0.92mg/ml，三者之和为4.93mg/ml；而对照则不具备上述活性(附图6)。

[0154] 附图6中，A为混合底物(对照)；B为导入空载体的重组酵母+混合底物(对照)；C为导入Lxyl-p1基因的重组菌+混合底物。1为7-木糖-10-去乙酰三尖杉宁碱；2为
7-木糖-10-去乙酰紫杉醇；3为7-木糖-10-去乙酰紫杉醇C；1′、2′和3′分别为对应的7-羟基紫杉烷产物。

[0155] 实施例7：重组酵母菌水解7-木糖巴卡亭III(XDB)

[0156] 菌株同实施例6，底物为7-木糖-10-去乙酰巴卡亭III(XDB)。在1.5ml菌体反应液中含有16mg干细胞/ml，8mg XDB/ml，30～55℃水浴，往返震荡24h。HPLC分析结果显示：XDB的转化率为86.54％，10-去乙酰巴卡亭III(DB)的产率为5.57mg/ml(附图7)。