木素纤维材料的酶水解预处理

摘要

本公开涉及处理含有木素纤维材料的生物质产生发酵性糖的方法，包括以下标准：处理生物质产生具有解聚的木质素的生物质，在所述处理步骤之前、期间或之后，将羰基清除剂加入到生物质以抑制木质素的再聚合，在加入羰基清除剂之后，将漆酶和纤维素酶中的至少一种加入到具有解聚的木质素的生物质，和由漆酶和纤维素酶对于所述具有解聚的木质素的生物质的作用，产生发酵性糖。

权利要求

1.处理含有木素纤维材料的生物质产生发酵性糖的方法，包括：处理所述生物质产生具有解聚的木质素的生物质；

在上述处理步骤之前、期间或之后，加入羰基清除剂到所述生物质抑制木质素的再聚合；

在加入羰基清除剂后，将漆酶和纤维素酶中的至少一种加入到具有解聚的木质素的生物质，和由漆酶和纤维素酶对于所述具有解聚的木质素的生物质的作用，产生发酵性糖；

其中所述羰基清除剂选自：2-萘酚、间二甲苯、对二甲苯、萘、苯酚、邻甲酚、间甲酚、对甲酚、2,5-二甲酚、3,5-二甲酚、3,4-二甲酚、2,3-二甲酚、2,6-二甲酚、2,4-二甲酚、邻苯二酚、间苯二酚、氢醌、5-甲基间苯二酚、1,3-萘二酚、1-萘酚蒽醌、2-乙基蒽醌、对羟基苯甲酸和其组合。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述处理步骤是稀释的酸蒸汽处理处理或者蒸汽汽爆处理。

3.根据权利要求1所述的方法，其中将漆酶和纤维素酶中的至少一种加入到具有解聚的木质素的生物质的步骤在所述处理步骤之后进行。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述处理步骤在所述羰基清除剂对于抑制所述木质素的再聚合仍然是活性时间里进行。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述漆酶和纤维素酶中的至少一种选自：纤维素酶，半纤维素酶，β1-4内切葡聚糖酶(E.C.3.2.1.4)，β1-4外切葡聚糖酶(EC3.2.1.9.1)，β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.2.1)，内切木聚糖酶，及其组合。

6.根据权利要求1所述的方法，其中当所述生物质在酶钝化温度以下的温度时，酶加入到所述生物质。

7.根据权利要求1所述的方法，其中当所述生物质在30℃-60℃、40℃-55℃、或

45℃-50℃的温度时，酶加入到所述生物质。

8.根据权利要求1所述的方法，其中在加入羰基清除剂之后24小时内加入酶。

9.根据权利要求1所述的方法，其中发酵性糖是葡萄糖、木糖或其组合。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法转化生物质中60-70％、70-80％、

80％-90％、82％-90％或85％-90％的纤维素成为发酵性糖。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法在没有加入酸的情况下进行。

说明书

木素纤维材料的酶水解预处理

[0001] 相关申请

[0002] 本申请要求在2011年8月18日提交的美国临时申请号61/524,967和2011年10月12日提交的美国临时申请号61/546,462的优先权，它们中每一个通过引用以其整体并入本文，好像在本文完全地说明。

技术领域

[0003] 本发明总体上涉及生物质诸如玉米秸秆、木片和其它木素纤维材料的转化为商业有用的产品诸如碳氢化合物和发酵性糖。

背景技术

[0004] 纤维素和木质素是两种最主要的可再生碳源。这两种生物分子在木素纤维材料中发现在一起，所述木素纤维材料包括所有的维管植物。木素纤维材料是适合国内地可再生的，和变为越来越宝贵的原料，因为石油原料已经变得更昂贵和更依赖于进口来源。

[0005] 木质素占木素纤维生物质的大约25%。它主要通过三种前体的聚合作用在植物中形成，形成分子量超过10,000的交联的大分子。因为木质素在其自身内聚合和与其它细胞壁成分聚合，其将纤维素和半纤维素对于微生物酶可使用减到最小。在其聚合形式中，木质素总体上与总的植物生物质的降低可消化性相关，这有助于防卫以免于病原体和害虫，但是这妨碍了其商业价值。

发明内容

[0006] 已经设计处理生物质的方法来产生发酵性糖。本发明的方法包括蒸汽预处理步骤，其中生物质用稀释的酸蒸汽处理的预处理步骤或者蒸汽汽爆处理，使得生物质中的木质素解聚。在蒸汽预处理步骤之前、期间或之后，加入羰基清除剂(正碳离子清除剂)以阻止解聚的或者将解聚的木质素的再聚合。然后，加入至少一种酶诸如纤维素酶以转化纤维素和半纤维素成为单体糖成分，同时羰基清除剂对于抑制木质素的再聚合仍然是能起作用的。任选地，也可以加入另外一种酶诸如漆酶以作用于纤维素中残余的羰基清除剂。

[0007] 本公开的一种实施方式涉及处理生物质产生发酵性糖的方法。处理包括木素纤维材料的生物质产生发酵性糖的方法包括：处理生物质产生具有解聚的木质素的生物质；在处理步骤之前、期间或之后将羰基清除剂加入生物质以抑制木质素的再聚合；在加入羰基清除剂后，将漆酶和纤维素酶中的至少一种或两种酶都加入到具有解聚的木质素的生物质，和由漆酶和纤维素酶对于具有解聚的木质素的生物质的作用产生发酵性糖。将漆酶和纤维素酶中的至少一种或两种酶都加入到生物质可以在所述处理步骤之后进行。

[0008] 生物质可以是任何木素纤维材料或者可以是含有木素纤维材料的混合物(例如，(工业)过程或混合废品的副产物)。木素纤维材料指包括(1)纤维素、半纤维素、或组合和(2)木质素的材料。在该整个公开中，应该理解纤维素可以指纤维素、半纤维素、或其组合。纤维素酶可以指纤维素酶、半纤维素酶、或其组合。

[0009] 可以用本公开的方法处理的生物质或木素纤维材料的实例包括含有以下的材料：玉米秸秆、生物能源作物、农业残留物、都市固体废物、工业固体废物、庭院废物、木材和林业废料、甘蔗、柳枝、麦秸、干草、大麦、大麦秸秆、稻草、草、废纸、污泥或从纸制造、玉米副产品粮食、玉米棒子、玉米皮、草、小麦、麦秸、干草、稻草、甘蔗渣、高粱、大豆、树木、树枝、木片、木屑和其任何组合。

[0010] 在本方法的第一步骤中，蒸汽处理，诸如将稀释的酸蒸汽处理处理或者蒸汽汽爆处理施加于生物质。蒸汽处理的一个目的是解聚生物质中的木质素到足以允许酶或酶的混合物转化生物质中的纤维素和半纤维素成为随后步骤中更小复杂糖的程度。

[0011] 在蒸汽处理之前、与蒸汽处理联系(即，在蒸汽处理期间)、或在蒸汽处理之后，将羰基清除剂加入到生物质以阻止由蒸汽处理产生的解聚的木质素的再聚合。羰基清除剂例如可以是2-萘酚、或任何其它羰基清除剂。合适的羰基清除剂的其它实例包括间二甲苯、对二甲苯、萘、苯酚、邻甲酚、间甲酚、对甲酚、2,5-二甲酚、3,5-二甲酚、3,4-二甲酚、2,3-二甲酚、2,6-二甲酚、2,4-二甲酚、邻苯二酚、间苯二酚、氢醌、5甲基间苯二酚、1,3-萘二酚、1-萘酚蒽醌、2乙基蒽醌、对羟基苯甲酸、或SO2(二氧化硫)。清除剂可以单独地或者以任何组合地使用。

[0012] 在蒸汽处理和加入羰基清除剂之后，加入至少一种酶消化生物质中的纤维素和半纤维素。酶例如可以是纤维素酶；半纤维素酶；β1-4内切葡聚糖酶(E.C.3.2.1.4)，β1-4外切葡聚糖酶，（EC3.2.1.9.1），β-葡萄糖苷酶（EC3.2.1.2.1），内切木聚糖酶，及其组合。这些酶的组合可以是含有纤维素酶、β-葡萄糖苷酶和半纤维素酶的酶组合物；酶的组合物含有内切木聚糖酶和纤维素酶。在所述处理步骤之后，可以进行加入至少一种酶，所述酶包括在以下描述的漆酶。

[0013] 进一步地，可以加入漆酶以消化在解聚的生物质中保持游离或结合到生物质的羰基清除剂。

[0014] 在蒸汽处理之后和在加入酶之前，生物质的温度可以是超过酶钝化温度。由于高温可以通过使其氨基酸链变性来钝化酶，酶可以在酶钝化温度以下的点加入到生物质。酶可以在酶的功能温度(一个或多个)或最佳温度(一个或多个)之内加入。为了节省能量，酶可以在生物质已经冷却到钝化温度以下之后加入，并且在温度已经下降到酶的最佳功能温度以下之前，酶过程充分地完成。自然，通过冷却或加热生物质维持期望的温度也是选项。加入稀释的液体，诸如在一定温度的水，可以用于冷却生物质。

[0015] 进一步地，可以加入酶，同时羰基清除剂仍然是活性的。加入漆酶可以作用于清除剂。

[0016] 在一种实施方式中，酶预处理过程可以在特定温度完成，诸如，例如在30℃-60℃；40℃-55℃；或45℃-50℃，或在室温或更低。

[0017] 对于方法的任何部分，如果需要，可以保持、增加或降低温度，通过加热或冷却，通过混合不同温度的批次，或通过加入可以是较高温度或较低温度的溶剂(例如，水)。

[0018] 可以完成酶消化，例如，在加入羰基清除剂之后的24小时之内。酶消化可以尽可能快地完成或紧接在生物质已经冷却到期望的温度之下。

[0019] 生物质与酶接触可以在多至一天的时间段中完成。虽然更长的酶消化是可能的，但是由于实施或经济的原因可以使用更短的时间段，诸如60分钟，10小时，20小时，30小时，40小时，60小时或72小时，或小于这些值的任何时间，或在任一的这些值的两个之间的任何时间。参见，例如，实施例部分。在一个实施方式中，酶接触的优选时间段是约3天或更短。

[0020] 公开的方法产生发酵性一种或多种糖，其可以是单体糖。单体糖的实例包括葡萄糖、木糖和其组合。

[0021] 要求保护方法的一种出人意料益处是，就效率而言相对于现有方法显著提高。也就是，本公开的方法可以转化木素纤维材料中的80%-90%、82%-90%、85%-90%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%的纤维素成为发酵性糖。这比目前已知的是更高水平的效率。

[0022] 根据以下说明书和权利要求书和对其概况，本发明的进一步方面对于本领域技术人员将是明显的。

[0023] 附图描述

[0024] 图1是显示处理生物质产生发酵性糖的示例性方法的流程图。

[0025] 图2描述用SO2和2.5%酶剂量浸渍、非酸催化的预处理的玉米秸秆的酶糖化收率(%)。

[0026] 图3描述用SO2和6%酶剂量浸渍、非酸催化的预处理的玉米秸秆的酶糖化收率(%)。

具体实施方式

[0027] 如在背景部分中讨论，聚合的木质素保护植物免于病原体和害虫并提供硬度。不幸地是，由于使其难于完全地利用纤维素，相同性质降低了木素纤维生物质的实用性。纤维素实用性不如所期望的高，因为虽然木质素可以在加工期间解聚，但是它可以在加工期间也同时地再聚合。我们已经发现避免对于纤维素充分利用的木质素的不期望障碍的方法。

[0028] 在生物质的加工中，通常使用蒸汽处理作为第一步骤，提高起始产物的可用性。在玉米秸秆以及其它形式的生物质(木片等等)稀释的酸蒸汽处理期间，包括蒸汽汽爆处理，木质素的解聚和再聚合发生。通常，再聚合可以比解聚慢的速度发生，在那一段时间点保留显著部分的解聚状态的木质素。当加热时，木质素丧失β-O-4’结构，而形成C-C缩合结构。随着处理的材料冷却，木质素的再聚合出现(缩合)。解聚和再聚合两个反应认为通过共同的中间体碳正离子调节，碳正离子由木质素中的苄醇结构形成。

[0029] 木质素的再聚合在生物质的加工中是不期望的，因为木质素的解聚和再聚合产生更紧密的木质素，且其对于纤维素酶比在天然形成木质素更小可穿透的。我们试验证据显示纤维素穿透性对于允许酶进入到它们的底物(纤维素)是重要的，因为酶(例如，纤维素)转化纤维素成为糖或单根纤维，它遵循纤维素减少的扩散导致这些生产方法中的降低的效率。

[0030] 已知将碳正离子清除剂化合物诸如2-萘酚加入到蒸汽处理相在消除木质素的再聚合是有用的(参见，“Lignin depolymerization/repolymerization and its critical role for delignification of aspen wood by steam explosion”,Jeibing Li,Gunnar Henriksson, Gellerstedt,Science Direct,2006年12月1日)。但是，碳正离子清除剂对于纤维素的酶降解的作用没有进行研究或者重视。

[0031] 所期望的是提高生物质的酶糖化收率的方法，生物质包括玉米秸秆，同时抑制在蒸汽汽爆方法中的木质素的再聚合。为了提高酶糖化收率，我们已经研究了羰基清除剂与酶的相互作用。

[0032] 朝向提高收率的目的，已经发展了在蒸汽汽爆的预处理阶段，正碳离子(羰基)清除剂(2-萘酚)或任何其它羰基清除剂与生物质-具体是玉米秸秆-的酶处理结合使用的方法。这种组合产生了出人意料高的发酵性糖的收率，这通过常规方法没有实现。

[0033] 加入羰基清除剂化合物在避免木质素的再聚合是有用的，同时加入酶诸如纤维素酶和酶混合物有助于断裂纤维素和半纤维素分子成为在生产乙醇中有用的糖。合适的酶实例至少包括纤维素酶；半纤维素酶；β1-4内切葡聚糖酶(E.C.3.2.1.4)，β1-4外切葡聚糖酶，（EC3.2.1.9.1），β-葡萄糖苷酶（EC3.2.1.2.1），内切木聚糖酶，及其组合。

[0034] 根据Li的文章可知，通过加入羰基清除剂化合物诸如2-萘酚，可以阻止木质素的再聚合，或者至少使得最小至足够程度。已经发现，当预处理生物质(玉米秸秆、木片、等等)，加入酶，经历随后糖化收率的增加，如果在羰基清除剂存在的情况下加入酶。我们需要说明的是Li文章涉及木质素的生产，而Li文章没有意识到羰基清除剂对于纤维素和半纤维素对于酶降解的可用性的作用，虽然这些材料仍然是在木质素的混合物中。

[0035] 如以上示出，我们已经发现纤维素和半纤维素在羰基清除剂的存在下对于酶降级是出人意料地可用的，并且不需要木质素与纤维素和半纤维素的物理分离。而且，我们出人意料地发现在高收率羰基清除剂对于酶的活性或酶转化纤维素至发酵性糖的能力没有显著的影响，即使在木质素存在的情况下。这通过现有的技术没有实现或成功。

[0036] 羰基清除剂和酶的组合已经实现提高糖化收率的出人意料的结果：从没有羰基清除剂加入的75%-80%到羰基清除剂加入的80%-90%(即，要求保护的方法)。即，断裂成为其单糖成分的复合糖(如淀粉或纤维素)的量从75%-80%提高至80%-90%比例。即，本公开的方法可以提高糖化收率至80%-90%、82%-90%或85%-90%。可选地，可以减少使用的酶的量。例如，到小于3%诸如2.5%。在这种情况下，糖化收率可以多于50%提高，多于100%提高或多于115%提高。参见实施例。

[0037] 不希望被理论所约束，我们推断，在公开的方法中，羰基清除剂化合物阻止木质素的再聚合，导致纤维素的更好反应性，因此保持木质素纤维打开或未反应的，由此允许酶(纤维素酶、半纤维素酶、或其组合)附着到纤维素聚合物和“结合”纤维素聚合物，然后分解纤维素分子成为单体糖成分。这些单体糖成分诸如葡萄糖、木糖或其组合然后作为发酵性糖是有用的。

[0038] 从生物质释放的发酵性糖通过合适的微生物可以用于产生多种目标化学制品。例如，发酵糖例如可以用于作为发酵液的成分，占成品发酵培养基的10%-约100%之间。

[0039] 通过发酵可以产生的目标化学制品例如包括酸、醇、烷烃、烯烃、芳烃、醛、酮、生物高分子、蛋白质、多肽、氨基酸、维生素、抗生素和药品。醇至少可以包括甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、乙二醇、丙二醇、丁二醇、丙三醇、赤藓醇、木糖醇、和山梨糖醇。酸包括醋酸、乳酸、丙酸、3-羟基丙酸、丁酸、葡萄糖酸、衣康酸、柠檬酸，琥珀酸和乙酰丙酸。氨基酸包括谷氨酸、天门冬氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、甘氨酸、精氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。另外的目标化学制品包括也可以产生的甲烷、乙烯、丙酮，并且也可以生产工业酶。

[0040] 糖发酵到目标化学制品可以通过一种或多种合适的生物催化剂在单个或多个步骤发酵中完成，使用微生物诸如野生型或重组细菌、丝状真菌和酵母。这种微生物至少包括埃希氏菌属(Escherichia)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、酵母属(Saccharomyces)、假丝酵母属(Candida)、毕赤氏酵母属(Pichia)、链霉菌属(Streptomyces)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、和梭菌属(Clostridium)。作为具体实例，例如发酵性糖使用酵母、或运动发酵单胞菌可以用于生产乙醇，或者使用大肠杆菌用于生产1,3-丙二醇。

[0041] 图1显示在转化木材(木素纤维材料)成为乙醇和木质素的工艺中使用羰基清除剂以及漆酶和纤维素酶的示例性工艺流程。木材或其它木素纤维材料10用羰基清除剂12化合物诸如2-萘醇处理，然后蒸汽汽爆木材或其它木素纤维材料。与羰基清除剂12在一起的木材或其它木素纤维材料进行蒸汽汽爆14处理或解聚生物质中的木质素的其它处理。蒸汽汽爆的产物进行冷却16，诸如至约50℃。应该理解，蒸汽汽爆可以用产生解聚木质素的另外方法所替代。这些方法例如可以是稀释的酸蒸汽处理。当冷却蒸汽汽爆了的材料冷却时，稀释水18，诸如在大约50℃的温度，加入蒸汽汽爆的材料。

[0042] 冷却蒸汽汽爆的材料，诸如，具有解聚木质素的生物质，可以包括羰基清除剂12，其中一些附着于木材或其它木素纤维材料，而另一些不附着于该材料。为了解决生物质中残留羰基，漆酶或纤维素酶20或两者都可以加入到冷却的蒸汽汽爆材料。术语“或(or)”指任一个或两个。例如，稀释水18可以包括漆酶或纤维素酶，当稀释水加入到改材料时，它们与蒸汽汽爆材料混合。可选地和如在图1中示出，可以加入漆酶或纤维素酶，在稀释水加入到诸如在稀释水连接器和反应容器22之间的运输管道支之间的蒸汽汽爆产物或到反应容器之后。

[0043] 在反应容器22中，蒸汽汽爆的材料与漆酶和纤维素酶保持足够时间，以允许酶作用于木材或其它木素纤维材料之上。当该反应完成后，浆冷却24至35-40℃范围的温度。在冷却之后，将发酵添加剂26加入到冷却蒸汽汽爆的材料，诸如反应容器的下游。发酵添加剂可以包括但不限于酵母。与发酵添加剂在一起的冷却蒸汽汽爆材料发酵28产生乙醇和木质素30。乙醇和木质素在此之后可以分开，而使得乙醇和木质素从该工艺中分开地排出。

[0044] 在蒸汽汽爆和羰基清除剂处理的木素纤维材料上进行的酶糖化试验显示较高的纤维素到葡萄糖较高水平的转化，与在没有加入这些羰基清除剂添加剂相比。这些添加剂对于木素纤维材料的作用认为与在暴露于提高其酶消化需要的高温和压力期间的木质素的解聚和再聚合反应相关。在文献中已知羰基清除剂作为木质素再聚合的阻断剂。假定如果消除再聚合，材料的纤维素部分更多暴露于酶的作用。

[0045] 用酿酒酵母(saccharomyces cereviciae)在酶水解形成乙醇期间得到的糖的发酵已经显示残留羰基清除剂对于生长是有害的。在该研究中使用的羰基清除剂是2-萘酚。萘酚是苯酚的萘同系物，其中羟基比在苯酚中更化学性质活泼的。萘酚认为是高度亲核的，并与木质素反应阻断苯酚化合物的其它接近分支的重新缩合。

[0046] 并排地，漆酶是在多种植物、真菌和微生物中发现的含有铜的氧化酶。漆酶作用于苯酚和类似的分子之上，进行单电子氧化，其保持不佳固定。表明漆酶通过促进木质醇-天然形成苯酚家族-的氧化偶联在木质素形成中起作用。

[0047] 已经阐明假想，在预处理期间在羰基清除剂反应之后通过使用漆酶，这些分子的毒性降低或消除。使用在蒸汽汽爆之后加入的漆酶和连同在蒸汽汽爆之前的加入的羰基清除剂可以用于提高纤维素糖化和预处理的木素纤维材料的发酵。

[0048] 虽然本发明已经连同现在认为是最佳实施和优选的实施方式进行了描述，应该理解的是本发明不限于公开的实施方式，而是相反，意欲涵盖包括在附加权利要求的精神和范围内的各种修改和等同的安排。

[0049] 实施例

[0050] 实施例1:用SO2和2.5%酶剂量浸渍、非酸催化预处理的玉米秸秆的酶糖化收率(%)。

[0051] 试验如以上描述进行和结果在图2中用图形表示。在该图中，葡聚糖到葡萄糖收率(%)是糖化收率的度量，并应该认为与糖化收率相同。SPR是标准参照纸浆(硫酸盐纸浆)。ASE是深度蒸汽汽爆。ASE以两个步骤进行，预水解步骤和蒸汽汽爆步骤。在图标题中，第一步骤(参见，图2，“35/170”)代表ASE的第一步骤，其是预水解，其在170摄氏度进行35分钟。第二步骤是蒸汽汽爆。在此，“0/0”表示第二步骤不进行，而“2/195”表示在195℃2分钟。提及“自水解”指试验没有加入另外的酸进行。收率72和收率168分别指酶接触72小时和168小时的试验。SRP栏是阳性对照试验，主要保证酶是活性的。

[0052] 实施例2:用SO2和2.5%酶剂量浸渍、非酸催化的预处理的玉米秸秆的酶糖化收率(%)。

[0053] 试验如以上描述进行和结果在图3中用图形表示。实施例2在与实施例1相同条件下进行，除了使用6%的酶。图3中的标题具有与图2中标题相同含义。

[0054] 如在实施例1和2中都可以看见，本公开的方法显著提高了反应的收率。参见，图2，其中提高是至少60%(61.25%/38.18%)、29%(75.75%/58.44%)、115%(67.14%/31.17%)和38%(82.26%/59.36%)。 也 参 见 图 3，其 中 提 高 是 至 少42%(82.21%/57.69%)、18%(83.84%/70.61%)、20%(90.73%/75.08%)和14%(98.18%/86.07%)。