焦磷酸测序技术检测隐孢子虫的方法

摘要

本发明公开了一种焦磷酸测序技术检测隐孢子虫的方法，先依据隐孢子虫18S rRNA设计特异性引物及焦磷酸测序引物；再提取待测样品的脱氧核糖核酸(DNA)，然后分别以18SrRNA基因的特异性引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增；用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，若引物扩增片段长度为201bp，则制备焦磷酸测序单链模板，再进行焦磷酸测序反应，最后根据PCR扩增结果和焦磷酸测序结果来判定样品中是否含有贾第鞭毛虫。本发明适用于对隐孢子虫进行快速检测确证，可广泛应用于环境中的水质监控、人体粪便中卵囊检测及进出口贸易中该类原虫的确证，操作极为简便，所需样品量小。

权利要求

1.一种焦磷酸测序技术检测隐孢子虫的非诊断方法，其特征在于，首先依据隐孢子虫

18SrRNA设计特异性引物及焦磷酸测序引物；再提取待测样品的脱氧核糖核酸（DNA），然后分别以18S rRNA基因的特异性引物进行聚合酶链式反应（PCR）扩增；用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，若引物扩增片段长度为201bp，则制备焦磷酸测序单链模板，再进行焦磷酸测序反应，最后根据PCR扩增结果和焦磷酸测序结果来判定样品中是否含有隐孢子虫；PCR反应为阳性的，进行焦磷酸测序分析，测序片段与18S rRNA基因目标片段完全相同的，确定为隐孢子虫；PCR反应为阳性的，测序片段与目标片段有一个以上碱基不同判定为非隐孢子虫；PCR反应为阴性的判定为非隐孢子虫；

所述的设计隐孢子虫的特异性引物及焦磷酸测序引物是根据该虫的18S rRNA基因序列，选取保守序列，通过Assay Design SW软件设计特异性引物序列，以扩增出特异性单一条带，再根据扩增区域中包含的特异核苷酸序列设计焦磷酸测序引物以确证是否为隐孢子虫；隐孢子虫PCR及测序引物为：

18S rRNA基因上游引物5’-CTTGAATACTCCAGCATGGAATAA-3’，5’进行生物素标记

18S rRNA基因下游引物5’-TCCCCTAACTTTCGTTCTTGATT-3’，

18S rRNA基因测序引物5’-ATACAAATGCCCCCA-3’；

隐孢子虫18S rRNA基因的目标序列：ACTGTCCCTA TTAATCATTA TTCTT；扩增片段长度为

201bp。

2.根据权利要求1所述的焦磷酸测序技术检测隐孢子虫的非诊断方法，其特征在于，所述的以该虫18S rRNA引物进行PCR扩增：其中，上下游引物扩增是将提取的待测样品DNA进行PCR扩增，扩增溶液中加入2×PCR buffer12.5μL,10pmol/μL上游引物和下游引物各0.5μL，DEPC水补足体积至25μL，PCR循环条件为：94℃预变性5min后，进入94℃变性

30s，46℃退火30s，72℃延伸30s，共循环50次；然后72℃再延伸10min。

3.根据权利要求1所述的焦磷酸测序技术检测隐孢子虫的非诊断方法，其特征在于，所述的PCR扩增产物电泳检测：取2g琼脂糖，于100mL电泳缓冲液中加热，充分溶化，加入溴化乙锭贮存液至终浓度为0.5μg/mL，制胶，在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶；将3μL～6μL PCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样；9V/cm恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部；紫外检测仪下观察电泳结果并记录。

4.根据权利要求1所述的焦磷酸测序技术检测隐孢子虫的非诊断方法，其特征在于，所述的制备焦磷酸测序单链模板：使用50μl标记有生物素的PCR产物与200μg链霉亲和素包被的磁珠，在室温25℃下孵育20分钟，用vacuum prep tool将与磁珠结合后的PCR产物吸起，然后在70%乙醇中清洗5s；denatureation buffer(变性缓冲液)洗5s；最后移到washing buffer（冲洗缓冲液）中清洗10s；然后将vaccum prep tool放入含有测序引物的板中，摇动，释放磁珠，将样品放入80℃烘箱2分钟，再冷却到室温。

5.根据权利要求1所述的焦磷酸测序技术检测隐孢子虫的非诊断方法，其特征在于，所述的焦磷酸测序反应：测序反应在室温下于焦磷酸测序仪上检测，加样使用600毫巴/8毫秒的加样压力和时间，每轮反应时间65秒，引物链随着不同dNTP的加入而延伸，随着核酸的结合，CCD摄像机检测到发出的光信号，读出DNA序列。

说明书

焦磷酸测序技术检测隐孢子虫的方法

技术领域：

[0001] 本发明属于食源性寄生虫的检测技术领域，涉及一种采用焦磷酸测序（Pyrosequencing）技术检测隐孢子虫的方法。背景技术：

[0002] 隐孢子虫（Cryptosporidium）为体积微小的球虫类寄生虫。广泛存在多种脊椎动物体内，寄生于人和大多数哺乳动物的主要为微小隐孢子虫（C.parvum），由微小隐孢子虫引起的疾病称隐孢子虫病（cryptosporidiosis），是一种以腹泻为主要临床表现的人畜共患性原虫病。呈世界性分布，其发病率与空肠弯曲菌、沙门氏菌、志贺氏菌、致病性大肠埃希氏菌相近，在寄生虫性腹泻中占首位或第二位。

[0003] 1984年，美国得克萨斯州SanAntonio地区约6000名居民中连续发生了两次大规模腹泻，共计2006人受到隐孢子虫感染，发病率约34%，是世界上第一起被证实的由供水系统引起的隐孢子虫病大规模暴发流行。1993年美国威斯康辛州Milwaukee市84万人口中，约有40.13万人发生了腹泻，有4400人住院治疗，69人死亡，经调查确认为市政供水系统被隐孢子虫污染所致，这是历史上规模最大、持续时间最长、危害最严重的水体隐孢子虫病暴发流行事件。我国于1987年在南京市区首次发现了隐孢子虫病例，随后在徐州、安徽、内蒙古、福建、山东和湖南等省市均报道发现了病例。因此不少地区开展了贾第虫和隐孢子虫感染情况的调查。湖南省的资料显示，门诊腹泻患者感染率为3.84%，且雨季为高发季节；青海省调查的牧民中感染率高达4.63%，推测可能与人畜共用相同的水源有关；云南省的资料显示，部分地区学龄前儿童感染率达8.51%，中小学生达6.25%，这与当地少数民族饮生水的习惯密切相关。上述资料提示，介水传播的隐孢子虫病在我国的潜在流行不容忽视。

[0004] 目前，对隐孢子虫疫最传统的确定性实验室诊断方法是采用美国环保局EPA制定的1623的密度检测法，该方法将免疫磁珠分离技术、染色技术、显微镜检技术有机结合起来，达到检测该虫的目标。然而，这一经典方法检测程序复杂，周期长，耗时费力，检测试剂昂贵，显微镜检须由经验丰富的专业人操作，结果判定主观性强。非常不适合在各基层确证使用。

[0005] 焦磷酸测序技术是近年发展起来的新技术，它是目前唯一得到定量序列结果的检测技术，具有极高的准确性，且重现性极佳，是一种通用型技术平台，功能多样，应用领域广泛，具有高通量、低成本的特点，聚合酶链式反应产物即可直接用于测序，不需进行产物纯化等二次处理，操作极为简便，所需样品量小，符合出入境检验检疫的要求，鉴于隐孢子虫等原虫危害的严重性，加强环境中的的监控，提高检测效率和确证的准确度，对有效控制隐孢子虫的传播在现阶段具有重要的实际意义。发明内容：

[0006] 本发明的目的在于克服现有技术在确证隐孢子虫上存在的缺点，寻求提供一种隐孢子虫的焦磷酸测序技术确证方法，以克服现有检测技术的不足，为人体感染者及环境中的水质监控提供一种快速、简便、高效、实用的确证隐孢子虫虫的检测方法。

[0007] 为了实现上述目的，本发明的主要原理是利用焦磷酸测序技术，通过测序引物和聚合酶链式反应扩增单链脱氧核糖核酸模板杂交，与脱氧核糖核酸聚合酶、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶和底物（APS）、荧光素孵育，逐一加入四种三磷酸碱基脱氧核苷酸（dNTPs）:（三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸dATP；三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸dTTP；三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸dCTP；三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸dGTP），如与模板配对，此三磷酸碱基脱氧核苷酸与引物的末端形成共价键，释放焦磷酸基团（PPi）；腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)硫酸化酶在底物（APS）存在的情况下催化焦磷酸形成腺嘌呤核苷三磷酸，腺嘌呤核苷三磷酸驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素转化，氧化荧光素发出与腺嘌呤核苷三磷酸量成正比的可见光信号；光信号由电荷耦合器件(CCD)收集并由软件转化为峰；每个光信号的峰高与反应中掺入的核苷酸数目成正比，腺嘌呤核苷三磷酸和未掺入的三磷酸碱基脱氧核苷酸由三磷酸腺苷双磷酸酶降解，淬灭光信号，并再生反应体系，利用光信号转化得到的峰图，对样品中的隐孢子虫进行准确的检测。

[0008] 本发明的实现，首先依据隐孢子虫18S rRNA设计特异性引物及焦磷酸测序引物；再提取待测样品的脱氧核糖核酸（DNA），然后分别以18S rRNA基因的特异性引物进行聚合酶链式反应（PCR）扩增；用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，若引物扩增片段长度为
201bp，则制备焦磷酸测序单链模板，再进行焦磷酸测序反应，最后根据PCR扩增结果和焦磷酸测序结果来判定样品中是否含有隐孢子虫。

[0009] 本发明所述的设计隐孢子虫的特异性引物及焦磷酸测序引物是根据该虫的18S rRNA基因序列，选取保守序列，通过Assay Design SW软件设计特异性引物序列，以扩增出特异性单一条带，再根据扩增区域中包含的特异核苷酸序列（目标序列）设计焦磷酸测序引物以确证是否为隐孢子虫；隐孢子虫PCR及测序引物为：

[0010] 18S rRNA基因上游引物5’-CTTGAATACTCCAGCATGGAATAA-3’，5’进行生物素标记[0011] 18S rRNA基因下游引物5’-TCCCCTAACTTTCGTTCTTGATT-3’，

[0012] 18S rRNA基因测序引物5’-ATACAAATGCCCCCA-3’。

[0013] 隐孢子虫18S rRNA基因的目标序列：ACTGTCCCTA TTAATCATTA TTCTT；扩增片段长度为201bp。

[0014] 本发明所述的提取待测样品的DNA是利用隐孢子虫包囊的粪便经100目系统网过滤，滤液用酚-氯仿法抽提而得；亦可用商业化的DNA提取试剂盒提取。

[0015] 本发明所述的以该虫18S rRNA引物进行PCR扩增：其中，上下游引物扩增是将提取的待测样品DNA进行PCR扩增，扩增溶液中加入2×PCR buffer(10倍聚合酶链式Mix反应液)12.5μL,10pmol/μL上游引物和下游引物各0.5μL，DEPC水补足体积至25μL，PCR循环条件为：94℃预变性5min后，进入94℃变性30s，46℃退火30s，72℃延伸30s，共循环50次；然后72℃再延伸10min。

[0016] 本发明所述的PCR扩增产物电泳检测：取2g琼脂糖，于100mL电泳缓冲液中加热，充分溶化，加入溴化乙锭贮存液至终浓度为0.5μg/mL，制胶，在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶；将3μL～6μL PCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样；9V/cm恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部；紫外检测仪下观察电泳结果并记录。

[0017] 本发明所述的制备焦磷酸测序单链模板：使用50μl标记有生物素的PCR产物与200μg链霉亲和素包被的磁珠，在室温25℃下孵育20分钟，用vacuum prep tool将与磁珠结合后的PCR产物吸起，然后在70%乙醇中清洗5s；denatureation buffer(变性缓冲液)洗5s；最后移到washingbuffer（冲洗缓冲液）中清洗10s；然后将vaccum prep tool放入含有测序引物的板中，摇动，释放磁珠。将样品放入80℃烘箱2分钟，再冷却到室温。

[0018] 本发明所述的焦磷酸测序反应：测序反应在室温下于焦磷酸测序仪上检测，加样使用600毫巴/8毫秒的加样压力和时间，每轮反应时间65秒，引物链随着不同dNTP的加入而延伸，随着核酸的结合，CCD摄像机检测到发出的光信号，读出DNA序列。

[0019] 本发明所述的关于根据PCR扩增结果和焦磷酸测序结果来判定样品中是否含有隐孢子虫：PCR反应为阳性的，进行焦磷酸测序分析，测序片段与18S rRNA基因目标片段完全相同的，确定为隐孢子虫；PCR反应为阳性的，测序片段与目标片段有一个以上碱基不同判定为非隐孢子虫；PCR反应为阴性的判定为非隐孢子虫。

[0020] 本发明适用于对隐孢子虫进行快速检测确证，可广泛应用于环境中的水质监控、人体粪便中卵囊检测及进出口贸易中该类原虫的确证；与现有技术相比，其应用焦磷酸测序技术可以快速、准确地进行短DNA序列分析，便于构建标准化操作流程；具有高通量、低成本的特点，PCR产物即可直接用于测序，不需进行产物纯化等二次处理，操作极为简便，所需样品量小。附图说明：

[0021] 图1为本发明对粪便样品中18S rRNA基因的扩增图谱，其中M：DL2000，1：粪便样品。

[0022] 图2为本发明对粪便样品中18S rRNA基因焦磷酸测序结果。具体实施方式：

[0023] 下面通过具体实施例并结合附图进一步阐述本发明。

[0024] 实施例1：检测感染者粪便样品中是否含有隐孢子虫

[0025] 1、设计特异性引物序列

[0026] 通过Internet登陆美国国立生物信息技术中心（NCBI），查询检索已公布的隐孢子虫18SrRNA的核苷酸序列，不包含不明碱基成分序列，对同源性较近的同年份同地点的虫株只选取一株，用DNAStar7.1软件包中的Editseq和MegAlign软件对所选样本的18S rRNA基因核苷酸序列进行编辑，逐一比对，用Clustal W Method(软件)默认参数对所选的18S rRNA核苷酸序列进行同源性比较，找到表征该虫的特异核苷酸序列（目标检测序列）。

[0027] PCR扩增引物设计和测序引物设计均可以通过Assay Design SW软件来进行，使用得分较高的一组引物进行实验，根据DNASTAR的同源性分析结果，选取样本基因中较保守的序列区域，设计扩增引物，以便于扩增出特异性单一条带，为后续测序奠定基础。同时为各个扩增区域中包含的特异核苷酸序列(目标序列)设计测序引物，18S rRNA扩增片段长度为201bp。

[0028] 隐孢子虫PCR及测序引物为：

[0029] 18S rRNA基因上游引物5’-CTTGAATACTCCAGCATGGAATAA-3’，5’进行生物素标记，[0030] 18S rRNA基因下游引物5’-TCCCCTAACTTTCGTTCTTGATT-3’，

[0031] 18S rRNA基因测序引物5’-ATACAAATGCCCCCA-3’。

[0032] 2、提取待测样品的DNA

[0033] 将含隐孢子虫包囊的粪便经100目细铜网过滤，滤液离心（2000r/min,10min），弃上清，沉淀加水至2mL～3mL；取另一离心管，加入0.85mol/L蔗糖5mL；将上述包囊液加入到蔗糖上层，离心（2000r/min,5min），缓慢吸取蔗糖上层含包囊悬液2mL，洗2次。用血球计数板计数纯化包囊数目。向上述纯化的包囊沉淀中加入400μL裂解液（含蛋白酶K200μg/mL），重悬包囊，56℃温育63h,期间混匀多次；用酚-氯仿法分别抽提隐孢子虫包囊DNA。

[0034] 3、以隐孢子虫18S rRNA引物进行PCR扩增

[0035] 扩增溶液中加入2×PCR buffer(10倍聚合酶链式Mix反应液)12.5μL,10pmol/μL上游引物和下游引物各0.5μL，将提取的待测样品DNA加入反应体系中，DEPC水补足体积至25μL，PCR循环条件为：94℃预变性5min后，进入94℃变性30s，46℃退火30s，72℃延伸30s，共循环50次；然后72℃再延伸10min.

[0036] 4、进行琼脂糖凝胶电泳

[0037] 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，取2g琼脂糖，于100mL电泳缓冲液中加热，充分溶化，加入溴化乙锭贮存液至终浓度为0.5μg/mL，制胶。在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶；将3μL～6μL PCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样；9V/cm恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部；紫外检测仪下观察电泳结果，待检隐孢子虫样品能够扩增出特异性条带，扩增条带为165bp，电泳结果见图1。

[0038] 5、制备焦磷酸测序单链模板

[0039] 使用50μl标记有生物素的PCR产物与200μg链霉亲和素包被的磁珠，在室温25℃下孵育20分钟，用vacuum prep tool将与磁珠结合后的PCR产物吸起，然后在70%乙醇中清洗5s；denatureation buffer洗5s；最后移到washing buffer中清洗10s；vaccum prep tool放入含有18S rRNA基因测序引物的板中，摇动，释放磁珠。将样品放入80℃烘箱2分钟，再冷却到室温。

[0040] 6、焦磷酸测序

[0041] 在焦磷酸测序仪（PYROMARK ID）上进行反应，室温条件下，加样使用600毫巴/8毫秒的加样压力和时间，每轮反应时间65秒，引物链随着不同dNTP的加入而延伸；随着核酸的结合，CCD摄像机检测到发出的光信号，18S rRNA基因焦磷酸测序结果见图2，读取的序列为ACTGTCCCTA TTAATCATTA TTCTT。

[0042] 7、结果判定

[0043] 粪便样品的18S rRNA基因扩增片段长度为201bp，与预期一致；经过焦磷酸测序，测定的18S rRNA序列与隐孢子虫目标序列一致，为：ACTGTCCCTA TTAATCATTA TTCTT，因此判定样品中含有隐孢子虫。

[0044] 实施例2：检测某水域中是否含有隐孢子虫

[0045] 1、设计特异性引物序列

[0046] 同实施例1。

[0047] 2、提取待测样品的DNA：

[0048] 采集一定体积水样（水源水10L，滤后水50L），经1μm孔径滤膜过滤后，依次用PBS+0.1%Tween80、乙醇、超纯水清洗容器，滤膜用40mL丙酮溶解，在3000r/min下离心去上清液后，再次加入40mL丙酮溶液并离心去上清液，得到相应沉淀。

[0049] 向浓缩得到的沉淀中加入6mL的PBS+0.1%Tween80，用振荡器振荡2min，混合均匀后将溶液均匀分至4个15mL离心管中，向每个离心管中加入3mL离心介质Percoll-蔗糖，于20℃、3000r/min下离心10min，此时溶液分成3层，取出中间层放入新的离心管中。采用DNA提取试剂盒(TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver3.0)，按照说明书进行中间层DNA的提取。

[0050] 3、以隐孢子虫18S rRNA引物进行PCR扩增

[0051] 同实施例1。

[0052] 4、进行琼脂糖凝胶电泳：

[0053] 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，取2g琼脂糖，于100mL电泳缓冲液中加热，充分溶化，加入溴化乙锭贮存液至终浓度为0.5μg/mL，制胶，在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶；将3μL～6μL PCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样；9V/cm恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部；紫外检测仪下观察电泳结果。

[0054] 待检样品PCR扩增未扩增出特异性条带，因此判定某水域中的样品中不含有隐孢子虫。

[0055] 实施例3：检测不同原虫样品中是否含有隐孢子虫基因

[0056] 1、设计特异性引物序列

[0057] 同实施例1。

[0058] 2、提取待测样品的DNA

[0059] 2.1隐孢子虫虫株来源

[0060] 用于本实验的隐孢子虫虫株购自澳大利亚BTF公司，用小白鼠保种。

[0061] 2.2对照DNA样本

[0062] 日本血吸虫（Schistosoma japonicum）、刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）、溶组织内阿米巴虫（Entamoeba histolytica）DNA样本为上海兽医研究所提供。隐孢子虫（Giardia lamblia）样本为本室制备

[0063] 2.3隐孢子虫的分离纯化及DNA制备

[0064] 将含隐孢子虫包囊的样品经100目细铜网过滤，滤液离心（3000r/min,10min），弃上清，沉淀加生理盐水至2mL；取另一离心管，配制蔗糖梯度层，上下层分别为1:5和1:2稀释的Sheather’s蔗糖；将上述卵囊悬液缓慢加入到蔗糖最上层，离心（2000r/min,5min），缓慢吸取上下梯度间含卵囊的悬液，水洗2次。用血球计数板计数纯化包囊数目。向上述纯化的包囊沉淀中加入400μL裂解液，2～3次冻融循环；加入蛋白酶K（终浓度2mg/mL），混匀，56℃温育2h,期间混匀多次；用酚-氯仿法分别抽提隐孢子虫包囊DNA。

[0065] 3、以隐孢子虫18S rRNA引物进行PCR扩增

[0066] 扩增溶液中加入2×PCR buffer(10倍聚合酶链式Mix反应液)12.5μL,10pmol/μL上游引物和下游引物各0.5μL，将提取的待测样品DNA和对照DNA样本分别加入到反应体系中，DEPC水补足体积至25μL，PCR循环条件为：94℃预变性5min后，进入94℃变性30s，46℃退火30s，72℃延伸30s，共循环50次；然后72℃再延伸10min.[0067] 4、进行琼脂糖凝胶电泳

[0068] 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，取2g琼脂糖，于100mL电泳缓冲液中加热，充分溶化，加入溴化乙锭贮存液至终浓度为0.5μg/mL，制胶。在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶；将3μL～6μL PCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样；9V/cm恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部；紫外检测仪下观察电泳结果，待检隐孢子虫样品能够扩增出特异性条带，扩增条带为165bp，其他原虫DNA样本均未检测到条带。

[0069] 5、制备焦磷酸测序单链模板

[0070] 使用扩增出条带的PCR产物50μl与200μg链霉亲和素包被的磁珠，在室温25℃下孵育20分钟，用vacuum prep tool将与磁珠结合后的PCR产物吸起，然后在70%乙醇中清洗5s；denatureation buffer洗5s；最后移到washing buffer中清洗10s；vaccum prep tool放入含有18SrRNA基因测序引物的板中，摇动，释放磁珠。将样品放入80℃烘箱2分钟，再冷却到室温。

[0071] 6、焦磷酸测序

[0072] 在焦磷酸测序仪（PYROMARK ID）上进行反应，室温条件下，加样使用600毫巴/8毫秒的加样压力和时间，每轮反应时间65秒，引物链随着不同dNTP的加入而延伸；随着核酸的结合，CCD摄像机检测到发出的光信号，读取的序列为ACTGTCCCTA TTAATCATTATTCTT。

[0073] 7、结果判定

[0074] 粪便样品的18S rRNA基因扩增片段长度为201bp，与预期一致；经过焦磷酸测序，测定的18S rRNA序列与隐孢子虫目标序列一致，为：ACTGTCCCTA TTAATCATTA TTCTT，因此判定样品中含有隐孢子虫。