一种假单胞菌发酵上清液的应用

摘要

本发明公开了一种假单胞菌（Pseudomonassp.）发酵上清液的应用，将假单胞菌菌株平板划线活化，取平板上的单菌落接种到装有2216E培养基的三角瓶中，培养温度28℃；摇床转数180rpm；培养时间48h，8000rpm离心15min得到一种A316发酵上清液，该发酵上清液可用于南方根结线虫（Meloidogyneincognita）的防治；其上清在离体可拮抗由灰葡萄孢（Botrytiscinerea）引起的辣椒灰霉病，在温室活体实验中有较好防效；对于辣椒具有促生长的作用；具有良好的应用前景。

权利要求

1.一种假单胞菌发酵上清液在制备同时抗南方根结线虫、促进辣椒生长且抑制辣椒灰霉病菌生长的药物中的应用，所述的假单胞菌（Pseudomonas sp.），保藏在中国海洋微生物菌种保藏管理中心，保藏号为：MCCC NO.1A00316。

说明书

一种假单胞菌发酵上清液的应用

技术领域

[0001] 本发明属于农业微生物学技术领域，具体涉及一种假单胞菌发酵上清液在制备治疗或预防植物根结线虫病药物中的应用，还涉及一种假单胞菌发酵上清液在制备治疗或预防辣椒灰霉病药物中的应用，还涉及一种假单胞菌发酵上清液在辣椒促生长中的应用。

背景技术

[0002] 根结线虫病是一种世界性分布的土传病害，给许多国家的农林、园艺等产业造成很大损失。根结线虫（Meloidogyne.spp）遍布于各地的土壤,在较温暖的地域繁殖特别普遍。根结线虫是分布最广、为害最重的植物寄生线虫，已引起世界各国的关注。到目前为止，已报道的根结线虫有80多种，不仅为害许多经济作物如大豆、花生、柑桔、香蕉等，而且为害多种蔬菜作物如黄瓜、丝瓜、豇豆、菜豆、茄子、辣椒、番茄及十字花科蔬菜。一般年份减产10%～15%，严重时达30%～40%，甚至绝收。近年来，随着保护地蔬菜种植面积的扩大，受保护地密闭、高温、高湿和复种指数增加等因素影响，蔬菜根结线虫病呈逐年加重趋势，并上升为蔬菜生产上的重要病害，在黑龙江、辽宁、北京、河南、湖北、江苏、云南和海南等地都有过根结线虫病严重发生和流行的报道。目前，国内尚无大量推广应用的抗根结线虫病的番茄品种，对番茄根结线虫病缺乏有效的防治措施。因此，对番茄根结线虫病进行系统的研究势在必行。

[0003] 番茄根结线虫病的防治方法包括农业防治、物理防治、化学防治和生物防治。（1）农业防治：包括水旱轮作、嫁接、改良土壤、调节播种期、种植抗病品种等。（2）物理防治：主要有夏季进行土壤热处理（蒸气消毒、高温闷棚、日光暴晒及灌注热水消毒等）和种子汰选（利用汰选机或用盐水、泥浆水漂选，去除带虫的种子），另外还包括水淹两周以上、射线或超声波处理等。（3）化学防治：施用杀线虫剂仍然是目前防治根结线虫病的主要方法，其中溴甲烷土壤消毒在我国占有较大比例，对蔬菜根结线虫病防治效果优异。但溴甲烷对大气臭氧层具有破坏作用，目前一些发达国家已经禁止使用溴甲烷。另外，利用石灰氮土壤消毒，对番茄、西瓜根结线虫病防治有明显效果。（4）生物防治：生物防治是近年来发展较迅速的一种防治方法。根结线虫的天敌主要有真菌、细菌、病毒、立克氏体、放线菌、捕食性线虫、涡虫和原生动物等，其中对细菌和真菌的生物防治作用研究较多，如巴氏杆菌是一种菌丝型和内生孢子型的植物线虫专性寄生细菌，在温室试验中已被证实可作为一种有效的植物线虫生防因子，使农业有害线虫种群密度明显降低，其中尤以穿刺巴氏杆菌研究最为深入，并在番茄根结线虫病防治上取得良好的效果。虽然生物防治已经展现出可喜的应用前景，但开发出来的生防制剂还很少，离大规模推广应用还有距离。

[0004] 灰霉病是露地、保护地作物常见且比较难防治的一种真菌性病害，属低温高湿型病害，病原菌生长温度为2～30℃，温度20～25℃、湿度持续90%以上时为病害高发期。灰霉病由灰葡萄孢菌侵染所致，该病菌寄主广泛，可侵染黄瓜、茄子、菜豆番茄，在温室、大棚较易发生，尤其以侵染辣椒严重，具有发病时间早，面积大，危害重的特点。发病严重时，发病率达70%～90%，病叶率达30%以上，严重者达到60%以上，造成落叶、落果或果实腐烂。目前生产上主要依赖于杀菌剂防治灰霉病，由于病菌能在相对较短的时间里对一些系菌剂产生抗性，加之化学农药本身具有黔高污染特点，一些农业措施如升温降湿，遇到连续阴雨天时无法实施，人工加温又大大增加生产成本；长期以米，病害防治中仍以化学防治为主，依赖于多菌灵、腐酶利等化学农药，导致其抗药性的迅速产生以及对人类对环境产生不良影响，生物农药有许多互补优势，它能降低灰霉病菌对杀菌剂的选择性，降低蔬菜中的农药残留量，同时也降低了生产成本，因此生物防治灰霉病已成为病原菌综合治理的重要措施之一，特别是用拮抗微生物防治病害具有重要意义。生物防治由于其低污染、低残留的特性成为近年研究的重点。

[0005] 无致病假单胞菌是活跃在植物根际的一类微生物，属Plant Growth-promoting Rhizobacteria(PGPR)一大类，假单胞菌的促生长作用机理一是产生活性物质或改善矿质营养直接促进植物生长；二是产生代谢物质或竞争作用抑制或阻碍根区病原微生物的发展，间接促进植物的生长。其生防作用机理包括有效的根部定殖、抗生作用、根际营养竞争(特别是对Fe的竞争)、诱导植物抗性和分泌降解微生物的酶等。最近研究发现类产碱假单胞菌(Pseudomonas pseodoalcaligenes)还具有杀虫作用。从类产碱假单胞菌代谢分泌物中分离到1种杀虫蛋白，含1种亚基，其分子量为25100道尔顿，等电点5.16，含17种氨基酸(其中谷氨酸含量最高，胱氨酸含量最低)，最大吸收峰为278，在pH值为6.0～10及40℃以下杀虫蛋白的活性稳定，对胃蛋白酶敏感，对胰蛋白酶不敏感，不具溶血性。

[0006] 美国、英国、瑞士、日本、印度、中国等均有人报道分离到可抗植物病害的荧光假单胞菌，而且常是一株菌能产生几种活性物质抗多种植物病害。美国棉花病理研究所国家实验室的Howell-CR(1980)分离到Pseudomonas fluorescent Pf-5可产生藤黄绿脓素(pyolutorin Plt)，吡咯菌素(pyrrolnitrin Prn)，2,4-二乙酰基间苯三酚(2,4-diacetylphlorglucinol PhlD)，噬铁素(Siderophores)，氢氰酸(HCN)等抗生素及其它活性物质可抗Pythium ultimum等重要植物病原菌。荧光假单胞菌的抗病机理主要是通过产生抗生素等生物活性物质来抑制病原菌的生长。假单胞菌具有杀虫、改善植物营养、降解有毒物质、产生抗生素和植物生长调节物质、改善植物微环境和诱导系统抗性等生物防治作用，其产品开发对象包括微生物活菌制剂、抗生素及其基因等。

发明内容

[0007] 本发明的一个目的是提供了一种假单胞菌发酵上清液在制备治疗或预防植物根结线虫病药物中的应用，该发酵上清液对南方根结线虫有很强的抑制作用，离体防治效果为100%，活体防效为71.3%。而已知的有防治效果的假单胞菌CHA0发酵上清液防治效果为52.01%。

[0008] 本发明还有一个目的是提供了一种假单胞菌发酵上清液在制备治疗或预防辣椒灰霉病药物中的应用，该发酵上清液液对辣椒灰霉病的防治效果达85.7%，阳性对照多菌灵防治效果为71.4%，说明本发明的A316发酵上清液对辣椒灰霉病有更好的抑制作用。

[0009] 本发明还有一个目的是提供了一种假单胞菌发酵上清液在辣椒促生长中的应用，本发明制备的发酵上清液液对植物有显著的促生长作用。

[0010] 为了达到以上目的，本发明采用以下技术措施：

[0011] 一种假单胞菌发酵上清液，其制备步骤如下：

[0012] 申请人于2010年9月从国家海洋局第三海洋研究所，中国海洋微生物菌种保藏管理中心（MCCC）获得了一株假单胞菌Pseudomonas sp.MCCC NO.1A00316；经形态观察，生理生化和16S rDNA鉴定，该菌株在分类学上属于假单胞菌(Pseudomonas sp.)，将该假单胞菌菌株A316（以下简称A316）平板划线活化，取平板上的单菌落接种到装有2216E培养基的三角瓶中，培养温度28℃；摇床转数180rpm；培养时间48h（OD600=1.85），8000rpm离心15min得到假单胞菌A316发酵上清液，（以下简称A316发酵上清液）；

[0013] 一种假单胞菌发酵上清液在制备治疗或预防植物根结线虫病药物中的应用，其应用过程是：

[0014] 1、A316发酵上清液对南方根结线虫的离体实验

[0015] 1）用96孔板进行毒力测定，每孔吸取实验用二龄线虫30头；

[0016] 2）加入上述制得的A316发酵上清液160ul，用无菌水补充至约200ul；

[0017] 3）实验设置三组：处理组（M+A）：A316发酵上清液+南方根结线虫；阳性对照（CK(+)）：已知有防效的假单胞菌CHA0（Imran A.Siddiqui,S.Shahid Shaukat,Suppression of root-knot disease by Pseudomonas fluorescens CHA0 in tomato:importance of bacterial secondary metabolite,2,4-diacetylpholoroglucinol.Soil Biology&Biochemistry(2003)35:1615-1623）发酵上清液+南方根结线虫；阴性对照（CK(-)）：清水+南方根结线虫；；

[0018] 4）20℃温育24h统计死亡率；12h观察一次；

[0019] 5）根据目测观察以及染色观察确定死虫数量。

[0020]

[0021] 2、A316假单胞菌发酵上清液对南方根结线虫病的温室实验

[0022] 1）番茄种子灭菌处理，70%（v/v）酒精消毒1min，2%(w/w)次氯酸钠消毒10min，无菌水洗涤三次；

[0023] 2）番茄种子在吸满水的滤纸上萌发；

[0024] 3）将萌发的种子种植至无菌的培养土中1000g（土:沙=1:1），每盆接种一颗番茄；

[0025] 4）长出四片子叶后再接种，接种时用玻璃棒在番茄苗的周围均匀插3个小孔，把线虫悬浮液（300头/孔）和（或）发酵上清液（2ml/孔）分别从小孔注入，然后覆好灭菌土，接种后3d内不浇水，用喷壶适当叶面土面保湿，以免线虫被冲走，3d后进行正常浇水管理。在温室内培养30天后小心拔出番茄植株，用清水将根部的土壤洗净，计数所有植株的根结数量；（彭双，杨茹，闫淑珍，陈双林.杀线虫植物内生细菌和根际放线菌对根结线虫的防治，,植物保护学报,.2012,39(1):63-69）

[0026] 5）实验设2组处理：处理组（M+A）：A316发酵上清液+南方根结线虫；阴性对照（CK(-)）：清水+南方根结线虫；每个处理三个重复；

[0027] 6）每盆接种二龄线虫300条。

[0028] 7）根结指数参照Negron和Acosta的方法分0～5级。（Negron J.A,Acosta,N.The Fusarium oxysporum f sp.Coffeae Meloidogyne incognita complex in Bourbon coffee［J］.Nematropica，1989，19：161-168.）

[0029] 0级：无根结或卵块；

[0030] 1级：1～2个根结或卵块／株；

[0031] 2级：3～10个根结或卵块／株；

[0032] 3级：11～30个根结或卵块／株；

[0033] 4级：31～100个根结或卵块／株；

[0034] 5级：100个以上根结或卵块／株。

[0035] 实验结果采用SPSS18.0统计分析软件统计（2010）。

[0036] 结合实验1，2，证明A316发酵上清液对南方根结线虫病有很强的抑制作用，对南方根结线虫病有很好的防效，离体防治效果达100%，活体防效为71.3%。

[0037] 一种假单胞菌发酵上清液在制备治疗或预防辣椒灰霉病药物中的应用，其应用过程是：

[0038] 1）辣椒种子灭菌处理，70%（v/v）酒精消毒1min，2%(w/w)次氯酸钠消毒10min，无菌水洗涤三次；

[0039] 2）辣椒种子在吸满水的滤纸上萌发；

[0040] 3）萌发后的辣椒幼苗移植到花盆中，每个苗盆种辣椒苗3株，每个处理做4个重复，每个重复设置4个苗盆，即每个样品处理16个苗盆；

[0041] 4）制备灰葡萄孢孢子悬液，28℃下培养1d，再转入PDB液体培养基培养2d，将发酵液5000rpm离心10min，取沉淀加适当蒸馏水稀释成菌悬浮液，备用；

[0042] 5）待辣椒长出四片子叶用A316发酵上清液以及0.1%农药多菌灵（W/W）5ml分别装入小喷壶中喷洒一次定植，每个苗盆喷撒接种5ml（除去损耗实际接种量约4ml），喷洒距7
离5cm，定植一天后即喷洒孢子悬液500ul（孢子数为1×10/ml）（除去损耗实际接种量约
400ul）使做染病处理，

[0043] 实验设置如下：处理组（B+A）：接种灰葡萄孢孢子悬液+A316发酵上清液；阳性对照（CK(+)）：接种灰葡萄孢孢子悬液+农药多菌灵；阴性对照（CK（-））：接种灰葡萄孢孢子悬液；

[0044] 6）待CK（-）组开始出现病症开始记录实验数据，按照病级指数对发病况进行统计，预计统计时间为两周；若CK（-）组两周内全部死亡则可提前终止实验录。

[0045] 7）数据处理

[0046]

[0047]

[0048] 实验结果采用SPSS18.0统计分析软件统计（2010）。

[0049] A316发酵上清液对辣椒灰霉病的防治效果达85.7%，阳性对照多菌灵防治效果为71.4%，说明本发明的A316发酵上清液对辣椒灰霉病有更好的抑制作用。

[0050] 一种假单胞菌发酵上清液在辣椒促生长中的应用，其应用过程是：

[0051] 1）辣椒种子灭菌处理，70%（v/v）酒精消毒1min，2%(w/w)次氯酸钠消毒10min，无菌水洗涤三次；

[0052] 2）辣椒种子在吸满水的滤纸上萌发；

[0053] 3）将萌发的种子种植至营养土中300g，每盆接种一颗辣椒；

[0054] 4）长出四片子叶后再接种发酵上清液（5ml/株）。在温室内培养30天统计生物量。

[0055] 5）试验设2种处理。处理组（A）：接种A316发酵上清液；阴性对照组（CK（-））：不接种A316发酵上清液。结果表明该发酵上清液液对植物有显著的促生长作用。

[0056] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：

[0057] 第一：该菌株在植物线虫病害的防治过程中具有较好的生物防效，与同类已知的有生物防效的假单胞菌相比防治效果更好；

[0058] 第二：该菌株可用于植物真菌病害的防治。综上所述，该菌株具有多病害防治及促进植物的生长等多种功能，是一株很有应用潜力的生防菌株。

[0059] 本发明分离的A316菌株，具有很强的抑制灰霉和南方根结线虫的能力，为灰霉病和南方根结线虫病的防治提供了新的生防产品。同时，对于作物的生长具有一定的促进效果。

附图说明

[0060] 图1：为一种假单胞菌发酵上清液的制备示意图。

[0061] 图2：为一种假单胞菌的系统发育树。

具体实施方式

[0062] 下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为报道的微生物学常规操作方法。

[0063] 实施例1：假单胞菌的鉴定

[0064] 第一步：假单胞菌的常规鉴定和分子辅助鉴定

[0065] 将假单胞菌Pseudomonas sp.MCCC NO.1A00316接种在2216E培养基上，28℃培养48h，观察记录单菌落形态，同时进行明胶水解试验等（参照：赵斌等，微生物学实验(第一版).北京：科学出版社，2002年介绍的方法）。16S rDNA鉴定，采用上游引物27F5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’和下游引物1492R 5’GGTTACCTGTTAC GACTT3’扩增 16S rDNA 片 段 (Suzuki K 等，Agromyces mediolanus sp.nov.,nom.rev.,comb.nov.,a species for ″Corynebacterium mediolanum″Mamoli 1939 and for some aniline-assimilating bacteria which contain 2,4-diaminobutyric acid in the cell wall peptidoglycan.Int J Syst Bacterio,1996,46:88-93)。采用20μl反应体系：1μl上游引物27F，1μl下游引物1492R，0.2μl dNTP，0.2μl TaqE,1μl Template,2μl
10×Buffer，14.6μl ddH2O。PCR反应条件：94℃,1min;55℃,1min;72℃,2min，30次循环，72℃延伸5min，PCR产物经电泳纯化后克隆到pMD 18-T载体(购自大连宝生物公司）上，送上海生物工程技术有限公司测序。将得到的16S rDNA序列提交GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=nucleotide) 和 RDP(Ribosomal Database Project)数据库（http://rdp.cme.msu.edu/），采用Blastn程序进行序列的同源性分析，用Clustal X进行多序列比对(Thompson JD等，The CLUSTAL_X windows interface:flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools.Nucleic Acids Res,1997,25:4876-4882)，用 MEGA4.0软 件按Neighbor-Joining法构建系统发育树（Kumar S等，MEGA3:Integrated software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and sequence alignment.Briefings in Bioinformatics,2004,5:150-163）。

[0066] 第二步：假单胞菌菌学特征及分类命名

[0067] 参照第三步中赵斌等，微生物学实验(第一版).北京：科学出版社，2002年介绍的方法，对其菌学特征进行了研究，特征如下：假单胞菌（Pseudomonas sp.）（MCCCNO.1A00316）菌株菌体为杆状，革兰氏反应阴性；在2216E平板上形成的菌落为半透明黄色，边缘整齐、表面有光泽。根据《伯杰细菌鉴定手册》（第八版，中译本，科学出版社，1984年）的检索表检索，其形态和生理生化特征与假单胞菌的性状相吻合。经过PCR扩增得到该菌株的16SrDNA片段，片段长度为1155bp，其序列为SEQ ID NO.1所示，测序后与GenBank数据库中已知的13个假单胞菌的16S rDNA同源性为99%。因此选取本发明所用菌株和RDP中相似性大的其它代表性菌株的16S rDNA序列进行遗传距离计算，并根据遗传距离计算结果绘制系统发育树（见图2），根据系统发育分析可以确认本发明所选取的菌株（MCCC NO.1A00316）是假单胞菌(Pseudomonas sp.)，以下简称为A316菌株。

[0068] A316菌株的保藏培养基为2216E基（如上所述），培养温度28℃。

[0069] 实施例2：A316发酵上清液对南方根结线虫病的离体防治实验

[0070] 第一步：A316的发酵

[0071] 1）在平板上将A316菌株划线分离活化得到单菌落；

[0072] 2）挑单菌落接到PA瓶中液体摇瓶活化；

[0073] 3）PA瓶中的种子液接到250ml三角瓶中液体摇瓶培养28℃摇瓶培养48h，至OD600=1.85；

[0074] 4）摇瓶后的发酵液8000rpm离心15min得到A316发酵上清液备用。

[0075] 第二步：A316对南方根结线虫的毒力测定

[0076] 1）用96孔板进行毒力测定，每孔吸取试验用二龄线虫30头；

[0077] 2）加入160ul发酵上清液，用无菌水补充至约200ul；

[0078] 3）实验设置三个处理组：处理组（M+A）：A316发酵上清液+南方根结线虫；；阳性对照（CK(+)）：已知有防效的假单胞菌CHA0发酵上清液+南方根结线虫；阴性对照（CK(-)）：清水+南方根结线虫；

[0079] 4）20℃温育24h统计死亡率；12h观察一；

[0080] 5）根据目测观察以及染色观察确定死虫数量，结果见表1。

[0081]

[0082] 表1A316发酵上清液对南方根结线虫的离体实验效果

[0083]

[0084] 注：处理组（M+A）：A316发酵上清液+南方根结线虫；；阳性对照（CK(+)）：已知有防效的假单胞菌CHA0发酵上清液+南方根结线虫；阴性对照（CK(-)）：清水+南方根结线虫。

[0085] 实施例2表明A316发酵上清液对南方根结线虫的离体实验效果可达到100%，已知的有防治效果的假单胞菌CHA0发酵上清液阳性对照效果为52.01%。

[0086] 实施例3：A316发酵上清液对南方根结线虫病的温室实验

[0087] 1）番茄种子灭菌处理，70%（v/v）酒精消毒1min，2%（w/w）次氯酸钠消毒10min，无菌水洗涤三次；

[0088] 2）番茄种子在吸满水的滤纸上萌发；

[0089] 3）将萌发的种子种植至无菌的培养土中1000g（土:沙=1:1），每盆接种一颗番茄；

[0090] 4）长出四片子叶后再接种，接种时用玻璃棒在番茄苗的周围均匀插3个小孔，把线虫悬浮液（300头/孔）和（或）发酵上清液（2ml/孔）分别从小孔注入，然后覆好灭菌土，接种后3d内不浇水，用喷壶适当叶面土面保湿，以免线虫被冲走，3d后进行正常浇水管理。在温室内培养30天后小心拔出番茄植株，用清水将根部的土壤洗净，计数所有植株的根结数量；《杀线虫植物内生细菌和根际放线菌对根结线虫的防效Vol.39植物保护学报No.1Feb.2012》。

[0091] 5）试验设2种处理：处理组（M+A）：A316发酵上清液+南方根结线虫；阴性对照（CK(-)）：清水+南方根结线虫；每个处理三个重复；

[0092] 6）每盆接种二龄线虫300条。

[0093] 7）根结指数参照Negron和Acosta的方法分0～5级。《Negron，Acosta.The Fusarium oxysporumf sp.Coffeae Meloidogyne incognita complex in Bourbon coffee［J］.Nematropica，1989，19：161-168.》

[0094] 0级：无根结或卵块；

[0095] 1级：1～2个根结或卵块／株；

[0096] 2级：3～10个根结或卵块／株；

[0097] 3级：11～30个根结或卵块／株；

[0098] 4级：31～100个根结或卵块／株；

[0099] 5级：100个以上根结或卵块／株。

[0100] 实验结果采用SPSS18.0统计分析软件统计（2010）。结果见表2

[0101] 表2 A316发酵上清液对南方根结线虫病的温室实验结果

[0102]

[0103] 注：处理组（M+A）：A316发酵上清液+南方根结线虫；阴性对照（CK(-)）：清水+南方根结线虫，每个处理三个重复。

[0104] 实施例3表明A316发酵上清液对南方根结线虫病有很好的防效活体防效为71.3%。

[0105] 实施例4：A316发酵上清液对辣椒灰霉病的温室实验

[0106] 1）辣椒种子灭菌处理，70%酒精消毒1min，2%次氯酸钠消毒10min，无菌水洗涤三次；

[0107] 2）辣椒种子在吸满水的滤纸上萌发；

[0108] 3）萌发后的辣椒幼苗移植到花盆中，每个苗盆种辣椒苗3株，每个处理做4个重复，每个重复设置4个苗盆，即每个样品处理16个苗盆；

[0109] 4）制备灰葡萄孢孢子悬液，28℃培养1d，再转入PDB液体培养基培养2d，将发酵液5000rpm离心10min，取沉淀加适当蒸馏水稀释成菌悬浮液备用；

[0110] 5）待辣椒长出四片子叶用A316发酵上清液以及0.1%农药多菌灵（W/W）5ml分别装入小喷壶中喷洒一次定植，每个苗盆喷撒接种5ml（除去损耗实际接种量约4ml），喷洒距7
离5cm，定植一天后即喷洒孢子悬液500ul（孢子数为1×10/ml）（除去损耗实际接种量约
400ul）使做染病处理。

[0111] 实验设置如下：处理组（B+A）：接种灰葡萄孢孢子悬液+A316发酵上清液；阳性对照（CK(+)）：接种灰葡萄孢孢子悬液+农药多菌灵；阴性对照（CK（-））：接种灰葡萄孢孢子悬液；

[0112] 6）待CK（-）组开始出现病症开始记录实验数据，按照病级指数对发病况进行统计，预计统计时间为两周；若CK（-）组两周内全部死亡则可提前终止实验录。

[0113] 7）数据处理

[0114]

[0115]

[0116] 实验结果采用SPSS18.0统计分析软件统计（2010）结果见表3

[0117] 表3 A316发酵上清液对辣椒灰霉病的温室实验效果

[0118]

[0119] 注：处理组（B+A）：接种灰葡萄孢孢子悬液+A316发酵上清液；阳性对照（CK(+)）：接种灰葡萄孢孢子悬液+农药多菌灵；阴性对照（CK（-））：接种灰葡萄孢孢子悬液。实施例4表明A316发酵上清液对辣椒灰霉病的防治效果达85.7%，阳性对照多菌灵防治效果为
71.3%，说明本发明的A316发酵上清液对辣椒灰霉病有更好的抑制作用。

[0120] 实施例5 A316发酵上清液对辣椒促生长作用

[0121] 1）辣椒种子灭菌处理，70%酒精消毒1min，2%次氯酸钠消毒10min，无菌水洗涤三次；

[0122] 2）辣椒种子在吸满水的滤纸上萌发；

[0123] 3）将萌发的种子种植至营养土中300g，每盆接种一颗辣椒；

[0124] 4）长出四片子叶后再接种发酵上清液（5ml/株）。在温室内培养30天统计生物量。

[0125] 5）试验设2种处理。处理组（A）：接种A316发酵上清液；阴性对照组（CK（-））：不接种A316发酵上清液。

[0126] 实验结果采用SPSS18.0统计分析软件统计（2010）

[0127] 表4 A316发酵上清液对辣椒促生长效果

[0128]

[0129] 注：处理组（A）：接种A316发酵上清液；阴性对照组（CK（-））：不接种A316发酵上清液。

[0130] 实施例5表明，A316发酵上清液液对植物有显著的促生长作用。