诃黎勒酸在制备治疗人肠道病毒71型感染引发疾病药物中的应用

摘要

本发明公开了诃黎勒酸在制备治疗人肠道病毒71型感染引发疾病的药物中的应用，作为优选，所述人肠道病毒71型感染引发疾病为手足口病、疱疹性咽峡炎、病毒性脑膜炎、病毒性脑炎、迟缓性麻痹、肺水肿或病毒性心肌炎。体内及体外试验表明，诃黎勒酸可以抑制人肠道病毒71型在细胞中的复制和病变，对于人肠道病毒71型感染引发疾病具有较好的治疗效果，具有临床应用前景。

权利要求

1.诃黎勒酸在制备治疗人肠道病毒71型感染引发的疾病的药物中的应用；所述诃黎勒酸为诃黎勒酸单体和/或诃黎勒酸盐；

所述人肠道病毒71型感染引发的疾病为手足口病。

说明书

诃黎勒酸在制备治疗人肠道病毒71型感染引发疾病药物

中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及医药领域，特别涉及诃黎勒酸在制备治疗人肠道病毒71型感染引发疾病药物中的应用。

背景技术

[0002] 诃黎勒酸（Chebulagic acid），主要存在于使君子科植物柯子的果实中，结构上属于水解鞣质，分子式为C41H30O27，其结构式如式I所示：

[0003]

[0004] 式I

[0005] 诃黎勒酸具有多种生物活性，包括抗炎、抗氧化、抗菌和抗肿瘤等。除此之外，诃黎勒酸还抑制少量病毒的复制，比如单纯疱疹病毒（HSV）、人丙型肝炎病毒（HCV）和人免疫缺陷病毒（HIV）。

[0006] 人肠道病毒71型为小RNA病毒科肠道病毒属的成员，归属于人类肠道病毒A，简称EV71，常引起手足口病、疱疹性咽峡炎、病毒性脑膜炎、病毒性脑炎、迟缓性麻痹、肺水肿、病毒性心肌炎等疾病，统称为肠道病毒71型感染。这类疾病多发生于6岁以下的婴幼儿，少数病情较为严重，甚至会引起死亡。该病一年四季都可发生，常见于4-9月份。

[0007] EV71病毒感染患儿多以发热起病，一般为38℃左右，发热同时，在口腔、手足、臀部出现皮疹，或出现口腔内溃疡、粘膜疹。部分病人早期有咳嗽等感冒样表现。少数患儿可出现严重并发症。这类病人大多持续高热，病情发展迅速，多在发病后3-5天内出现中枢神经系统、呼吸系统、循环系统严重并发症，并可引起死亡，死亡原因主要为脑水肿、脑疝、中枢性呼吸、循环衰竭。EV71病毒在世界范围内多次爆发，经由胃肠道或呼吸道传播，根据卫生部的数据，自2008年到2012年10月，内地儿童手足口病发生率一直居高不下，患病者超过500万人，死亡人数超过2000，疫情依然严峻。

[0008] 目前，对于EV71感染尚没有公认的特效药物或疫苗。

发明内容

[0009] 本发明要解决的技术问题为提供诃黎勒酸在制备治疗人肠道病毒71型感染引发的疾病的药物中的应用。

[0010] 作为优选，所述诃黎勒酸为诃黎勒酸单体和/或诃黎勒酸盐。

[0011] 人肠道病毒71型简称EV71，为小RNA病毒科肠道病毒属的成员，呈球形，二十面体立体对称，无包膜和突触，直径约24-30纳米，核酸为单股正链RNA。EV71型病毒基因组编码的多肽VP1、VP2、VP3、VP4构成原聚体，后者再拼装成具有五聚体样结构的亚单位，60个亚单位通过各自的结构域相互连接，最终形成病毒的外壳。VP1、VP2和VP3三个多肽暴露在病毒外壳的表面，而VP4包埋在病毒外壳的内侧与病毒核心紧密连接。EV71病毒可经由胃肠道或呼吸道传染。

[0012] 所述人肠道病毒71型感染引发的疾病是指肠道病毒71型感染导致感染性疾病，包括手足口病、疱疹性咽峡炎、病毒性脑膜炎、病毒性脑炎、迟缓性麻痹、肺水肿和病毒性心肌炎等多种疾病。

[0013] 本发明利用实验室所建立的EV71感染人横纹肌瘤细胞模型和小鼠模型，对诃黎勒酸抑制人肠道病毒71型复制和治疗人肠道病毒71型感染引发疾病的效果进行了研究，结果显示：EV71病毒感染72小时后，未经药物治疗组可见细胞大量病变，而经25μg/ml诃黎勒酸治疗的细胞未见明显病变，有效保护50%人横纹肌瘤细胞免受EV71感染的诃黎勒酸浓度为12.5μg/ml，而当药物浓度大于等于25μg/ml时，能够完全抑制病毒导致的人横纹肌瘤细胞病变。

[0014] EV71感染小鼠模型研究结果显示：每天给予1mg/kg体重剂量的诃黎勒酸，持续给药5天，感染小鼠的症状减弱，小鼠的死亡率降至60%，而模型组小鼠死亡率为100%，说明诃黎勒酸对EV71所致感染具有治疗作用，有临床应用前景。

附图说明

[0015] 图1为人横纹肌瘤细胞感染EV71病毒2小时后给予诃黎勒酸或等体积的生理盐水处理，处理后0小时、48小时、72小时的细胞AO/EB染色结果；

[0016] 图2为不同剂量诃黎勒酸治疗EV71感染小鼠的生存率曲线；

[0017] 图3为诃黎勒酸对EV71病毒感染小鼠各组织病毒载量的影响。

具体实施方式

[0018] 本发明公开了一种诃黎勒酸在制备治疗人肠道病毒71型感染引发疾病的药物中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

[0019] 为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

[0020] 实施例1诃黎勒酸抑制EV71病毒在细胞中的复制

[0021] 在EV71感染人横纹肌瘤细胞模型中，将新培养人横纹肌瘤细胞接种至96孔板中，4
每孔细胞数量为2×10 个。37℃培养箱中培养24小时后，开始接种病毒。

[0022] 所使用EV71为中国大陆地区流行毒株，菌株名称FY0805，分离自安徽阜阳，基因序列在NCBI中存储号为HQ882182。病毒接种细胞的剂量为100TCID50，体积为98微升，继续在37℃培养箱中培养。

[0023] 诃黎勒酸用生理盐水溶解，并在病毒感染细胞2小时候给药，药物体积为2微升，未给药的细胞给予2微升生理盐水。观察72小时内细胞病变，计算药物的半数有效抑制浓度为12.5μg/ml。

[0024] 人横纹肌瘤细胞感染EV71病毒2小时后，给予终浓度为25μg/ml的诃黎勒酸治疗，分别于给药后0小时、48小时、72小时进行AO/EB染色，以等体积的生理盐水代替诃黎勒酸作为阴性对照，观察诃黎勒酸治疗组细胞与生理盐水组细胞的病变情况，其结果如图1所示；图1结果显示：生理盐水组细胞可见细胞大量病变，而经25μg/ml诃黎勒酸治疗的细胞则未见明显细胞病变，说明：诃黎勒酸可抑制EV71病毒在细胞中的复制。

[0025] 实施例2诃黎勒酸对EV71病毒感染小鼠的治疗作用

[0026] 本实验的目的是验证诃黎勒酸在小鼠体内对EV71病毒感染的治疗效果，所用模型为中国大陆地区EV71毒株感染10日龄ICR小鼠的模型。毒株为临床分离株FY0805在小7
鼠体内的适应株，毒株名为MP10，基因序列在NCBI中的存储号为HQ712020。以1×10TCID50剂量的MP10病毒经腹腔注射感染10日龄ICR小鼠后，可导致小鼠在4日内表现出后肢瘫痪和体重减轻的症状，并于感染后10天内全部死亡。

[0027] 应用上述模型，对诃黎勒酸的治疗效果进行体内评价。使用小鼠为SPF级ICR小鼠，10日龄，雌雄各半。首先，腹腔注射MP10病毒对小鼠进行病毒感染，感染2小时后腹腔注射给予诃黎勒酸或生理盐水，诃黎勒酸用生理盐水溶解，其剂量分别为0.2毫克/公斤体重/天、1毫克/公斤体重/天、5毫克/公斤体重/天，每组小鼠数量为30只；每天分两次给药，间隔12小时，持续给药5天。自病毒感染之日起，持续观察14天，记录小鼠的体重、症状和生存率，评价诃黎勒酸对EV71病毒感染的治疗效果。

[0028] 结果如图2所示，图2结果显示：每天给予1毫克/公斤体重剂量的诃黎勒酸，持续给药5天，感染小鼠的症状减弱，小鼠的死亡率降至60%，而模型组小鼠死亡率为100%；说明诃黎勒酸对于EV71感染小鼠具有较好的治疗效果。

[0029] 实施例3诃黎勒酸对于EV71病毒感染小鼠组织中病毒载量的影响

[0030] 所述病毒载量，是指单位重量组织中的病毒数量，用于反映组织中的病毒复制情况。

[0031] 本实验的目的是检测诃黎勒酸对于EV71病毒感染小鼠不同组织中病毒载量的影响，以验证诃黎勒酸对于EV71病毒在体内复制的抑制作用。

[0032] 应用实施例2所述EV71病毒感染小鼠模型，测定诃黎勒酸治疗EV71病毒感染小鼠不同组织中的病毒载量。使用小鼠为SPF级ICR小鼠，10日龄，雌雄各半。经腹腔注射MP10病毒对小鼠进行感染，感染2小时候经腹腔注射给予诃黎勒酸或生理盐水，诃黎勒酸用生理盐水溶解，其剂量为1毫克/公斤体重/天。每天给药2次，间隔12小时，持续给药5天。病毒感染后第六天，将小鼠脱颈处死，分别取血液、脑组织与肌肉组织，用qRT-PCR方法进行病毒载量的检测，其检测结果如图3所示，图3纵坐标为每毫克组织的Log（病毒拷贝数）。

[0033] 图3结果显示：每天给予1毫克/公斤体重剂量的诃黎勒酸，持续给药5天，与给予生理盐水组相比，给药组小鼠各组中的病毒载量明显降低，说明：诃黎勒酸可以明显抑制病毒在体内的复制。

[0034] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。