坡柳皂苷化合物及其制备方法和应用转让专利
申请号 : CN201310075529.5
文献号 : CN103113449B
文献日 : 2015-04-29
发明人 : 秦小萍 , 杨美林 , 李丰超 , 付立新 , 李成云
申请人 : 云南农业大学
摘要 :
本发明公开了一种坡柳皂苷化合物及其制备方法和应用。本发明提供了新的坡柳皂苷化合物的化学结构式，所述化合物从坡柳种子制备得到，具有杀虫活性，可广泛应用于制备杀虫剂。本发明首次从坡柳植物中找到具有拒食活性的化合物。本发明制备方法简单，应用前景广阔。
权利要求 :
1.一种坡柳皂苷化合物，其特征在于具有如式1所示的化学结构式：
。
2.权利要求1所述的一种坡柳皂苷化合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)坡柳种子80％乙醇提取物:坡柳种子用植物粉碎机粉碎，过40目筛，然后用石油醚常温下冷浸提取3天，每天更换溶剂一次，坡柳种子体积：石油醚溶剂体积比例为1：3，石油醚去酯后，取坡柳种子石油醚提取后的残渣用80％乙醇提取,残渣体积：80％乙醇体积为1：3,每天更换溶剂一次，最后合并浓缩，得到坡柳种子80％乙醇提取物；
(2)小孔树脂法分离：将坡柳种子80％乙醇提取物甲醇溶解通过全自动快速制备层析得到8个馏分，条件为：MCI柱，甲醇：水＝50：50～0：100，其中馏分3为甲醇：水＝30：70洗脱得到；
(3)凝胶柱层析分离:馏分3上Sephadax LH-20葡聚糖凝胶柱，甲醇脱洗，得馏分3.3；
(4)加压反相柱分离:将馏分3.3上加压反相柱，洗脱条件为甲醇：水＝80：20～100：
0，得10个馏分，其中馏分3.3.7为甲醇：水＝90:10洗脱得到；
(5)HPLC制备分离：将馏分3.3.7用分析型HPLC-ELSD确定参数，条件为：ZORBAX SB-C18分析柱，洗脱剂为甲醇：5％甲酸：乙腈的体积比为17：48：35；进样量：5μL；流速：
2mL/min柱温：30℃；Tr＝10.1min，检测波长：A:254nm；B:210nm；C:208nm；D:280nm；确定前述参数后，再上制备型HPLC-ELSD，按如下条件制备：ZORBAX SB-C18半制备柱，洗脱剂为甲醇：5％甲酸：乙腈的体积比为17：48：35；进样量：5μL；流速：2mL/min柱温： 30℃；Tr＝32.1min和检测波长：A:254nm；B:210nm；C:208nm；D:280nm，即获得坡柳皂苷化合物。
3.权利要求1所述的一种坡柳皂苷化合物在制备杀虫剂中的应用，其特征在于具有式
1所示结构的化合物在制备杀虫剂方面的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于具有式1所示结构的化合物在制备防治小菜蛾和菜青虫拒食剂方面的应用。
说明书 :
坡柳皂苷化合物及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及农药和植物化学技术领域，具体涉及从植物坡柳种子中制备得到化合物及其制备方法及化合物的应用。
背景技术
[0002] 在人们日益关注食品安全、生态安全和经济可持续发展的今天，生物农药的研发已成为各国政府和企业抢占农业技术高地的核心之一。大力发展和利用生物农药防治植物病虫害是农业可持续发展迫切需要的技术。植物源农药是重要的生物农药之一，因其高效、低残留及与环境和谐而倍受社会青睐。目前已发现对害虫生长有抑制、干扰作用的物质大约有1100余种，其中来源于植物的就有1000多种，现已开发出一系列卓有成效的产品，如除虫菊素、鱼藤酮、印楝素等。
[0003] 坡柳[Dodonaea viscosa（L inn.）Jacq.]，又名车桑子、明子柴、透骨草等，属于无患子科灌木，高3-5米，小枝暗紫红色或灰黑色，叶倒披针形或倒卵状椭圆形，长3-6厘米，宽1-2厘米，边缘具细锯齿。主要分布于全世界的热带和亚热带地区，一般生长在干旱的山坡，沙地和小树丛间，多年来被认为是一种恶性杂草，引起草原的退化，严重影响牧业的发展。坡柳在云南省金沙江河谷及景东、南涧、巍山、玉溪等地区分布较广，植物资源丰富。
发明内容
[0004] 本发明的目是提供从植物坡柳种子中制备得到的化合物。
[0005] 本发明的另一目的是提供所述化合物的制备方法。具体是提供一种从坡柳种子中制备化合物坡柳皂苷A的方法。
[0006] 本发明还有一个目的就是提供所述化合物的应用。
[0007] 本发明的目的通过以下技术方案予以实现：
[0008] 1.提供一种坡柳皂苷化合物，化学结构式如式1所示：
[0009]
[0010] 上述化合物命名为坡柳皂苷A
[0011] 2.本发明同时提供了上述化合物的制备方法，包括以下步骤：
[0012] （1） 坡柳种子80%乙醇提取物:坡柳种子用植物粉碎机粉碎，过40目筛，然后用石油醚常温下冷浸提取3天，每天更换溶剂一次，坡柳种子体积：石油醚溶剂体积比例为1：3，石油醚去酯后，取坡柳种子石油醚提取后的残渣用80％乙醇提取,残渣体积：80％乙醇体积（V：V）为1：3,每天更换溶剂一次，最后合并浓缩，得到坡柳种子80%乙醇提取物；
[0013] （2） 小孔树脂法分离：将坡柳种子80%乙醇提取物甲醇溶解通过全自动快速制备层析得到8个馏分，条件为：MCI柱，甲醇：水=50：50～0：100，其中馏分3为甲醇：水=30：70洗脱得到；
[0014] （3） 凝胶柱层析分离:馏分3上Sephadax LH-20葡聚糖凝胶柱，甲醇脱洗，得馏分3.3；
[0015] （4） 加压反相柱分离:将馏分3.3上加压反相柱，条件为甲醇：水=80：20～100：0，得10个馏分，其中馏分3.3.7为甲醇：水＝90:10洗脱得到；
[0016] （5） HPLC制备分离：将馏分3.3.7用分析型HPLC-ELSD确定参数，条件为：ZORBAX SB-C18分析柱，洗脱剂为甲醇：5%甲酸：乙腈的体积比为17：48：35；进样量：5μL；流速：2mL/min柱温：30℃；Tr＝10.1min，②检测波长：A:254nm;B:210nm；C:208nm；D:280nm；确定前述参数后，再上制备型HPLC-ELSD，按如下条件制备：ZORBAX SB-C18半制备柱，洗脱剂为甲醇：5%甲酸：乙腈的体积比为17：48：35；进样量：5μL；流速：2mL/min柱温：30℃；Tr＝32.1min和检测波长：A:254nm；B:210nm；C:208nm；D:280nm，即获得坡柳皂苷A。
[0017] 本发明同时提供了上述化合物在制备杀虫剂方面的应用。
[0018] 本发明的有益效果是：
[0019] 1、本发明首次从被认为恶性杂草坡柳植物中分离得到了一种具有新颖化学结构的坡柳皂苷A，该坡柳皂苷A对蔬菜害虫菜青虫和小菜蛾具有良好的拒食作用，为进一步研究坡柳植物的防虫提供重要的启示。
[0020] 2、本发明使坡柳这一恶性杂草变废为宝，产生了较好的经济和社会效益。且坡柳植物分布广，在我国金沙江干热河谷，秦岭等地已开始人工大面积种植，植物资源丰富，因而成本低，本发明制备方法简单，应用前景广阔。
具体实施方式
[0021] 以下实施例可以使本领域技术人员更全面理解本发明，但并不构成对本发明的限制。以下各实施例无特别说明，为常规方法。
[0022] 实施例1 本发明所述的坡柳皂苷A的制备，包括以下步骤：
[0023] （1） 坡柳种子80%乙醇提取物:坡柳种子用植物粉碎机粉碎，过40目筛，然后用石油醚常温下冷浸提取3天，每天更换溶剂一次，坡柳种子体积：石油醚溶剂体积比例为1：3，石油醚去酯后，取坡柳种子石油醚提取后的残渣用80％乙醇提取,残渣体积：80％乙醇体积（V：V）为1：3,每天更换溶剂一次，最后合并浓缩，得到坡柳种子80%乙醇提取物；
[0024] （2） 小孔树脂法分离：将坡柳种子80%乙醇提取物甲醇溶解通过全自动快速制备层析得到8个馏分，条件为：MCI柱，甲醇：水=50：50～0：100（体积比），其中馏分3为甲醇：水=30：70洗脱得到；
[0025] （3） 凝胶柱层析分离:馏分3上Sephadax LH-20葡聚糖凝胶柱，甲醇脱洗，得馏分3.3；
[0026] （4） 加压反相柱分离:将馏分3.3上加压反相柱，洗脱条件为甲醇：水=80：20～100：0（体积比），得10个馏分，其中馏分3.3.7为甲醇：水＝90：10洗脱得到；
[0027] （5） HPLC制备分离：将馏分3.3.7用分析型HPLC-ELSD确定参数，条件为：ZORBAX SB-C18分析柱，洗脱剂为甲醇：5%甲酸：乙腈的体积比为17：48：35；进样量：5μL；流速：2mL/min柱温：30℃；Tr＝10.1min，②检测波长：A:254nm;B:210nm；C:208nm；D:280nm；确定前述参数后，再上制备型HPLC-ELSD，按如下条件制备：ZORBAX SB-C18半制备柱，洗脱剂为甲醇：5%甲酸：乙腈的体积比为17：48：35；进样量：5μL；流速：2mL/min柱温：30℃；Tr＝32.1min和检测波长：A:254nm；B:210nm；C:208nm；D:280nm，即获得坡柳皂苷A。
[0028] 实施例2 本发明所述的坡柳皂苷A的结构鉴定
[0029] 本发明所述的坡柳皂苷A是由HRESIMS，IR，13C-NMR，1H NMR，HMBC谱，H-H COSY波谱鉴定。
[0030] 高分辨电喷雾质谱(HR-ESI-MS)表明其分子式为C57H89O24([M-H]-实测值为13
1157.5745，计算值1157.5743)，不饱和度为13（IR测得）。 C-NMR波谱数据显示55个碳信号(有两个信号发生重叠)，包括11个甲基、10个亚甲基、25个次甲基和11个季碳信号(DEPT)。化学位移为178.2和171.3的季碳信号表明至少有两个酯键或羧基存在，化学位移为110.7、105.5和104.5的三个次甲基信号表明该化合物中存在3个糖基，而氢谱中的三个低场质子信号5.28、4.69、4.53也支持该推测。糖基信号以及三个糖基的连接顺序通过与文献报道的对比来指定。C-3位信号δH3.22和δC91.9表明糖基连接在该原子上。
1157.5745，计算值1157.5743)，不饱和度为13（IR测得）。 C-NMR波谱数据显示55个碳信号(有两个信号发生重叠)，包括11个甲基、10个亚甲基、25个次甲基和11个季碳信号(DEPT)。化学位移为178.2和171.3的季碳信号表明至少有两个酯键或羧基存在，化学位移为110.7、105.5和104.5的三个次甲基信号表明该化合物中存在3个糖基，而氢谱中的三个低场质子信号5.28、4.69、4.53也支持该推测。糖基信号以及三个糖基的连接顺序通过与文献报道的对比来指定。C-3位信号δH3.22和δC91.9表明糖基连接在该原子上。
[0031] 一维核磁共振谱显示7个末端甲基的高场信号单峰（δH0.85-1.42）和一个典型的双键信号（δC127.0和143.5(C-12、C-13)，表明该化合物为12-烯齐墩果烷型的三萜皂苷衍生物。而HMBC谱中角甲基质子δH1.11(H-23)、δH0.90(H-24)与碳δC91.9(C-3)、40.4(C-4)和56.8(C-5)的 相 关，质 子δH1.01(H-25)与 碳δC56.8(C-5)、40.2(C-1)和37.9(C-10)的 相关，质子 δH1.03(H-26)与 碳δC48.4/48.2(C-14/9)、42.3(C-8）、
37.2(C-7)的相关，以及质子δH1.42(H-27)与碳δC143.5(C-13)、48.4(C-14)、68.5(C-15)和42.3(C-8)的相关也证实了以上结构推导。
37.2(C-7)的相关，以及质子δH1.42(H-27)与碳δC143.5(C-13)、48.4(C-14)、68.5(C-15)和42.3(C-8)的相关也证实了以上结构推导。
[0032] 通过HMBC谱中，δH5.89(H-21)的质子信号与δC171.3处酯基碳(C21-1)信号的相关关系，δH5.61(H-21)的质子信号与δC178.2处酯基碳(C22-1)信号的相关关系，以及5.89(H-21)的质子与δC73.8处的次甲基碳(C-22)、δC36.7处季碳(C-20)和δC29.5(C-29)、δC20.0(C-30)的远程相关点，δH5.61(H-22)的质子与δC81.8处的次甲基碳(C-21)、δC73.95处次甲基碳(C-16)和δC48.2处季碳(C-17)、δC63.8出亚甲基碳(C-28)的远程相关点，表明两个取代基团分别连接在齐墩果烷骨架的C-21、C-22位上。C-21、C-22位取代基团的结构，可以通过基团中质子信号与碳信号的HMBC相关来推定。该化合物的NMR数据归属指定如表1所示。
[0033] 表1 坡柳皂苷A的波谱数据
[0034]
[0035]
[0036]
[0037] 综合上述各种相关波谱数据，本发明坡柳皂苷A的化学结构确认如下：
[0038]
[0039] 通过文献查阅，CA化学数据库检索，确定本发明所述的坡柳皂苷A为一个新化合物，
[0040] 实施例3 本发明坡柳皂苷A对小菜蛾的拒食活性
[0041] 采用叶碟法，在预试基础上，用水将坡柳皂苷A溶解，采用对半稀释法配置成5个浓度梯度的药液（最高浓度为2000mg/L）供试。将新鲜较平整均一的甘蓝叶片用圆形打孔器（Φ1.8cm）打成叶碟，放入提取物药液中浸渍2-3s（对照用蒸馏水浸泡）。室温下晾干，放入直径9cm的培养皿中（内垫滤纸，加少量蒸馏水保湿），每皿内等距离放入4个处理叶碟，十字交叉型排列，4个对照叶碟另皿放置。接入饥饿4h的小菜蛾3龄幼虫，每皿3头作为一次重复，每处理设20个重复。供试幼虫在温度（25±1）℃、相对湿度75％～85％，每