一种RNA及其在心血管系统疾病中的应用

摘要

本发明公开了一种RNA及其在心血管系统疾病中的应用。本发明提供的一种RNA，一种RNA，其核苷酸序列为序列表中序列3。还提供了编码上述RNA的基因。所述RNA的基因的核苷酸序列为序列表中序列4。本发明的实验证明，本发明发现经异丙肾上腺素（ISO）诱导，在乳大鼠心肌成纤维细胞中应用RNAi方法knock down HIP-55明显促进心脏成纤维细胞增殖；而在Knock-down HIP-55心肌成纤维细胞中能够增强ISO诱导的P38MAPK的激活以及激酶活性；发现HIP-55是一种新的对心脏纤维化具有保护作用的蛋白质，为临床诊断、治疗及新药开发提供了新的靶点。

权利要求

1.一种RNA，其核苷酸序列为序列表中序列3。

2.编码权利要求1所述RNA的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述RNA的基因的核苷酸序列为序列表中序列4。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体、转基因细胞系或重组腺病毒。

5.根据权利要求4所述的载体，其特征在于：所述重组载体为重组腺病毒载体；

所述重组腺病毒载体具体为将编码权利要求2或3所述的基因插入pAd/PL-Dest中得到的载体。

6.HIP-55蛋白抑制剂在制备具有如下1)和/或2)功能的产品中的应用：

1)促进心脏成纤维细胞增殖；

2)提高P38MAPK激酶活性；

所述HIP-55蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2；

所述HIP-55蛋白抑制剂为权利要求1所述RNA、权利要求2或3所述基因或权利要求

4或5所述的重组载体或权利要求4所述的转基因细胞系或重组腺病毒。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述产品为药物。

8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于：所述心脏成纤维细胞为离体心脏成纤维细胞。

说明书

一种RNA及其在心血管系统疾病中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种RNA及其在心血管系统疾病中的应用。

背景技术

[0002] HIP-55(hematopoietic progenitor kinase 1[HPK1]-interacting protein of55 kDa；也称为drebrin-like protein、mAbp1或SH3P7)是一个包含多功能域的蛋白质。
其结构主要包含着N端的F-actin蛋白结合结构域和C端SH3结构域。HIP-55参与突触发生、受体内吞、骨架重排及信号转导。目前对HIP-55功能了解较少尚无对HIP-55在心血管系统方面的研究报道。

[0003] 心血管疾病是中国居民健康的“头号杀手”，每年主要用于心血管病的直接医疗费用已达1300亿元人民币。心肌纤维化是心脏重塑的重要病理改变，是指在心肌的正常组织结构中心肌成纤维细胞过度分裂，胶原纤维过量积聚、心脏组织中胶原浓度显著升高或胶原成分发生改变，引起心肌僵硬度增加、舒缩功能受限，严重影响心脏的功能。这种病理变化在多种心血管疾病中存在，与心律失常、心功能障碍甚至心脏性猝死密切相关。心肌纤维化是心功能由代偿期向失代偿期转变的关键，其严重程度和疾病的发生发展及预后密切相关。因此，预防和逆转心肌纤维化具有重要的意义。大量研究表明儿茶酚胺-肾上腺素系统过度激活是促心肌纤维化的重要因素，儿茶酚胺（如异丙肾上腺素isoproteronol,Iso)通过β-ARs促进心肌成纤维细胞增殖和胶原合成增加，从而导致心肌纤维化、心脏功能的恶化和心衰的形成。同时β-ARs阻滞剂能够显著改善患者的预后。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种RNA及其在心血管系统疾病中的应用。

[0005] 本发明提供的RNA，其核苷酸序列为序列表中序列3。

[0006] 编码上述RNA的基因也是本发明保护的范围。

[0007] 上述RNA的基因的核苷酸序列为序列表中序列4。

[0008] 含有上述基因的重组载体、转基因细胞系或重组腺病毒也是本发明保护的范围。

[0009] 上述重组载体为重组腺病毒载体；所述重组腺病毒载体具体为将上述的基因导入腺病毒载体中，得到表达RNA的重组腺病毒载体。

[0010] 上述腺病毒载体为pAd/PL-Dest，上述重组腺病毒载体具体为将编码上述RNA的基因（序列4）插入pAd/PL-Dest中得到的载体，将该质粒命名为shpAd-HIP-55[0011] HIP-55蛋白抑制剂在制备具有如下1）和/或2）功能的产品中的应用也是本发明保护的范围：

[0012] 1）促进心脏成纤维细胞增殖；

[0013] 2）提高P38MAPK激酶活性；

[0014] 所述HIP-55蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。

[0015] 上述促进心脏成纤维细胞增殖具体通过如下1）或2）体现：

[0016] 1）在ISO诱导下增加心脏成纤维细胞Brdu参入量；

[0017] 2）在ISO诱导增加心脏成纤维细胞CCK8吸光值。

[0018] 上述提高P38MAPK激酶（为两种亚型，其氨基酸序列为序列表中的序列8或序列9）活性通过提高P38MAPK激酶底物ATF-2的磷酸化水平。

[0019] 上述应用中，所述HIP-55蛋白抑制剂为上述RNA、上述基因或上述重组载体、转基因细胞系或重组腺病毒。

[0020] 上述应用中，所述产品为药物。

[0021] 上述应用中，所述心脏成纤维细胞为离体心脏成纤维细胞。

[0022] HIP-55蛋白在筛选、开发和/或设计具有如下1）和/或2）功能的产品中的应用也是本发明保护的范围：1）抑制心脏成纤维细胞增殖；2）抑制P38MAPK激酶活性；所述HIP-55蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。

[0023] 本发明的实验证明，本发明发现经异丙肾上腺素（ISO）诱导，在乳大鼠心肌成纤维细胞中过表达HIP-55明显抑制心脏成纤维细胞增殖，与之相反，应用RNAi方法knock down HIP-55明显促进心脏成纤维细胞增殖；在过表达HIP-55心脏成纤维细胞中能够抑制ISO诱导的P38MAPK的激活以及激酶活性，而在Knock-down HIP-55心肌成纤维细胞中能够增强ISO诱导的P38MAPK的激活以及激酶活性；发现HIP-55是一种新的对心脏纤维化具有保护作用的蛋白质，为临床诊断、治疗及新药开发提供了新的靶点。

附图说明

[0024] 图1为过表达HIP-55蛋白质表达水平的检测

[0025] A为携带Dserd-HIP-55基因腺病毒及携带Dserd基因的对照腺病毒转染效率的检测；B为过表达HIP-55蛋白质表达水平的检测

[0026] 图2为HIP-55shRNA敲减HIP-55蛋白质表达水平的检测

[0027] 图3为HIP-55抑制心肌成纤维细胞增殖（Brdu法）

[0028] A为过表达HIP-55抑制心肌成纤维细胞增殖；B为敲减HIP-55促进心肌成纤维细胞增殖

[0029] 图4为HIP-55抑制心肌成纤维细胞增殖（CCK8法）

[0030] A为过表达HIP-55抑制心肌成纤维细胞增殖；B为敲减HIP-55促进心肌成纤维细胞增殖

[0031] 图5为ISO通过p38MAPK诱导的心脏成纤维细胞增殖

[0032] 图6为HIP-55抑制心脏成纤维细胞P38MAPK激酶活性

[0033] A和B为过表达HIP-55抑制心肌成纤维细胞P38MAPK激酶活性；C和D为敲减HIP-55增强心肌成纤维细胞P38MAPK激酶活性。

具体实施方式

[0034] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0035] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0036] 下述实施例中定量试验均重复三次，结果取平均值。

[0037] 鼠HIP-55蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2，编码该蛋白的基因的核苷酸序列为序列表中的序列1。

[0038] 下述实施例采用的离体乳大鼠心脏成纤维细胞通过如下方法获得：

[0039] 实验用SD乳大鼠购自北京大学医学部实验动物部，完全遵照北京大学医学部实验动物相关伦理学标准；采用酶消化和差速贴壁方法进行分离培养；细胞在含有10％胎牛血清（Biochrom AG，Berlin，Germany）的高糖DMEM（Hyclone，Logan，UT）培养基里，其中添加100μg/ml链霉素及100U/ml青霉素，置于37℃的5%CO2孵箱里培养，具体如下：

[0040] 出生1-3天内的SD乳大鼠，浸没于75％酒精；眼科剪开胸取心脏；置于冰冷的Hank’s缓冲液中剪除心房部分并洗涤两次。转移到10ml血清瓶中，剪碎组织后Hank’s缓冲液再洗涤两次。弃去上清；加入4mL0.1％胰蛋白酶置于37℃水浴中平缓搅动消化，每次4min，弃去前两次细胞悬液。继续进行6-8次消化，收集细胞悬液，加入含4mLDMEM完全培养基（含10％胎牛血清）的离心管中，1000rpm×5min离心，取4mL DMEM完全培养基洗涤细胞沉淀，再次重悬离心。最后合并收集细胞，接种于10cm培养皿，37℃、5％CO2培养箱静置培养2小时。吸取未贴壁的心肌细胞悬液，已贴壁的成纤维细胞用DMEM洗涤后，加入DMEM完全培养基进行培养。长满后传代，实验选用第二代离体心脏成纤维细胞。

[0041] 下面实施例采用的抗体如下：Anti-EIF5（Santa cruz公司；货号：c-282）、Anti-P38MAPK（santa cruz 公 司；货 号：sc-7194）、Anti-phospho-P38MAPK（cell signaling；货号：#9211s）。

[0042] 实施例1、HIP-55shRNA、过表达HIP-55的重组腺病毒和RNA干扰HIP-55表达的重组腺病毒的获得

[0043] 一、HIP-55shRNA的获得

[0044] 针对鼠HIP-55蛋白编码基因设计并合成如下HIP-55shRNA和对照Control shRNA如表1所示：

[0045] HIP-55shRNA，其核苷酸序列为序列表中序列3，其编码基因的核苷酸序列为序列表中序列4；

[0046] 设计Control shRNA：其核苷酸序列为序列表中序列5，其编码基因的核苷酸序列为序列表中序列6；

[0047] 表1为shRNA及其对照序列

[0048]

[0049] 二、过表达HIP-55重组腺病毒的构建及制备

[0050] 1、过表达HIP-55重组腺病毒载体的构建

[0051] 利用重叠延伸PCR扩增attB1-HIP-55-Flag-IRES/DesRed-attB2

[0052] 利用重叠PCR扩增：以序列表中序列1所示的HIP-55核苷酸为模板，使用引物attB1-HIP-55和HIP-55-Flag-IRES-R（序列见表2）进行PCR扩增；以IRES/DesRed为模板，使用引物Flag-IRES-F和DesRedE2-attB2（序列见表2）进行PCR扩增；分别回收两个PCR产物；再以两个PCR产物为模板，用引物：attB1-HIP-55和DesRedE2-attB2进行融合PCR，得到2656bp的PCR产物（该PCR产物的核苷酸序列为序列表中的序列7，序列表中序列7自5’末端第36-1334位核苷酸为序列1自5’末端第1-1299位核苷酸），命名为attB1-HIP-55-Flag-IRES/DesRed-attB2。

[0053] 表2为重叠PCR扩增引物

[0054]引物名称 oligo序列5’to3’
attB1-HIP-55 GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCCACCATGGCGGTGAACCTGAGCHIP-55-Flag-R CTACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCCTCTATGAGCTCCACATAGT
Flag-IRES-F ACGACGATGACAAGTAGGCCCCTCTCCCTCCCCC
DesRedE2-attB2 GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTACTGGAACAGGTGGTGGC

[0055] 重叠PCR扩增反应体系及扩增程序如下：反应体系：

[0056]

[0057] 扩增程序：

[0058]

[0059] 6×loading buffer终止反应；

[0060] 将 上 述 2665bp 的 PCR 产 物 利 用 Gateway clone 构 建 重 组 载 体pDown-HIP-55-Flag-IRES/DesRedE2，具体如下：

[0061] 25℃，BP反应3h。

[0062] 反应体系：

[0063]

[0064] 加入蛋白酶K终止反应10min，得到BP反应产物，将BP反应产物转化到大肠杆菌Stbl3中，挑取单克隆摇菌并提取质粒，质粒为将attB1-HIP-55-Flag-IRES/DesRed-attB2（序列7）插入pDONR221中得到的中间载体，命名为pDown-HIP-55-Flag-IRES/DesRedE2。

[0065] 利用Gateway clone构建pAd-HIP-55-Flag-IRES/DesRedE2，具体如下：

[0066] 将中间载体pDown-HIP-55-Flag-IRES/DesRedE2和母载体质粒pAd/CMV/V5-DEST进行LR反应，体系如下：

[0067]

[0068] 25℃，LR反应3h，加入蛋白酶K终止反应10min，得到LR反应产物，将LR反应产物转化到大肠杆菌Stbl3中，挑取单克隆摇菌并提取质粒，质粒为将attB1-HIP-55-Flag-IRES/DesRed-attB2编码基因（序列7）插入pAd/CMV/V5-DEST中，得到腺病毒表达载体，命名为pAd-HIP-55-Flag-IRES/DesRedE2。

[0069] 2、对照病毒腺病毒表达载体pAd-CMV>flag/IRES/DsRed Express2的构建[0070] pAd-CMV>flag/IRES/DsRed Express2为将Flag-IRES/DesRedE2（序列表中序列7自5’末端第1335-2627位核苷酸）构建到pAd/CMV/V5-DEST中得到的载体；

[0071] 1）利用引物flag+DsRed-F和attB2+DsRed为引物（序列见表3），序列表中序列7自5’末端第1335-2627位核苷酸所示的DNA分子为模板PCR扩增获得1293bpflag-IRES-DsRed Express2片段；

[0072] 2）利用引物attB1-K-Flag和attB2+DsRed为引物，flag-IRES-DsRed Express2片段为模板PCR扩增获得1357bpattB1-flag-IRES-DsRed Express2-attB2片段。

[0073] 3）BP反应

[0074] 采用上述1的方法，将attB1-flag-IRES-DsRed Express2-attB2片段通过BP反应插入pDONR221载体中，构建pDown-flag/IRES/DsRed Express2；

[0075] 4）LR反应

[0076] 采用上述1的方法，将attB1-flag-IRES-DsRed Express2-attB2片段通过LR反应插入pAd/CMV/V5-DEST载体中得到pAd-CMV>flag/IRES/DsRed Express2。

[0077] 表3为引物序列

[0078]

[0079] 4、过表达HIP-55重组腺病毒的获得

[0080] 将上述获得的过表达HIP-55重组腺病毒载体pAd-HIP-55-Flag-IRES/DesRedE2转入HEK293A细胞（美国ATCC，产品目录号CRL-1573TM），包装得到过表达HIP-55重组腺病毒（命名简称：Dsred-HIP55）。

[0081] 将上述获得的空腺病毒载体pAd-CMV>Flag/IRES/DsRed Express2转染HEK293A细胞，包装得到pAd-CMV>Flag/IRES/DsRed Express2腺病毒（命名简称：Dsred）。

[0082] 5、验证

[0083] 1）转染

[0084] 将上述步骤4制备5×106pfu过表达HIP-55重组腺病毒（Dsred-HIP55）和5×106pfu pAd-CMV>Flag/IRES/DsRed Express2腺病毒（Dsred）转染离体心脏成纤维细胞，得到感染过表达HIP-55重组腺病毒的细胞和感染pAd-CMV>Flag/IRES/DsRedExpress2腺病毒细胞。

[0085] 2）倒置荧光显微镜观察转染效率

[0086] 应用倒置荧光显微镜选用绿色激发块（激发红色荧光）观察转染效率，结果如图1的A所示，过表达Dsred-HIP-55病毒及Dsred病毒转染效率达到95%以上。

[0087] 3）Western blot验证

[0088] A、心脏成纤维细胞蛋白提取

[0089] 分别收获感染过表达HIP-55重组腺病毒（Dsred-HIP55）的细胞、感染pAd-CMV>Flag/IRES/DsRed Express2腺病毒（Dsred）细胞和离体心脏成纤维细胞，冷PBS洗细胞二次（样本欲检测磷酸化AMPK时则不洗，直接加裂解液），60mm培养皿中加入100μl细胞裂解液（20mmol/L Tris-HCl PH7.4,150mmol/L NaCl,2.5mmol/LEDTA,50mmol/L NaF,0.1mmol/L Na4P2O7,1mmol/L Na3VO4,1%Triton X-100,10%glycerol,0.1%SDS,1%deoxycholic acid,1mmol/L PMSF,and1μg/ml aprotinin）裂解细胞10分钟，用细胞刮刮下并移入Ep管中，超声处理后于4℃，12,000g离心15min，所得上清液冻存于-70℃。蛋白定量采用BCA方法，所得上清液冻存于-70，得到感染过表达HIP-55重组腺病毒（Dsred-HIP55）的细胞蛋白、感染pAd-CMV>Flag/IRES/DsRed Express2腺病毒（Dsred）细胞蛋白和离体心脏成纤维细胞蛋白。

[0090] B、Western blot

[0091] 将上述A得到的感染过表达HIP-55重组腺病毒（简称：Dsred-HIP55）细胞蛋白、感染pAd.-CMV>Flag/IRES/DsRed Express2腺病毒（简称：Dsred）细胞蛋白和离体心脏成纤维细胞蛋白进行Western blot检测，一抗为Anti-HIP-55（BD公司；货号：612614，稀释度1:1000），二抗为辣根过氧化物酶标记（中杉金桥公司，货号ZB-2305，稀释度1:4000）。

[0092] 结果如图1B所示，与感染pAd.-CMV>Flag/IRES/DsRed Express2腺病毒（Dsred）细胞相比，感染过表达HIP-55重组腺病毒（Dsred-HIP55）的细胞内的HIP-55蛋白有强表达。

[0093] 感染pAd-CMV>Flag/IRES/DsRed Express2腺病毒（Dsred）细胞和离体心脏成纤维细胞结果无显著差异。

[0094] 三、shRNA干扰HIP-55表达的重组腺病毒

[0095] 1、shRNA干扰HIP-55表达的重组腺病毒载体的构建

[0096] shRNA的扩增引物为shHIP-55-F和shHIP-55-R；

[0097] 对照shRNA的扩增引物为Control-F和Control-R；

[0098] 表4为shRNA相关引物序列

[0099]oligo名称 oligo序列5’to3’
shHIP-55-F TCTTTGGCATGTTTCCTGCCAACTCGAGTTGGCAGGAAACATGCCAAAGTTTTTCshHIP-55-R TCGAGAAAAACTTTGGCATGTTTCCTGCCAACTCGAGTTGGCAGGAAACATGCCAAAGAControl-F TGCGCGCTTTGTAGGATTCGCTCGAGCGAATCCTACAAAGCGCGCTTTTTC
Control-R TCGAGAAAAAGCGCGCTTTGTAGGATTCGCTCGAGCGAATCCTACAAAGCGCGCA[0100] shpDwon-HIP-55的构建Oligo DNA的退火

[0101] a)把待退火DNA oligo用DEPC处理的水配置成50μM，溶解Annealing Buffer for DNA Oligos(5×)，混匀备用。

[0102] b)设置反应体系：

[0103]

[0104] 设置PCR仪进行退火反应：

[0105] 95℃ 2min

[0106] 每8s下降0.1℃，降至25℃ 约90min

[0107] 4℃ 长时间保存

[0108] 退火产物-20℃保存，得到退火的shHIP-55Oligo DNA（核苷酸序列为序列4，）。

[0109] （2）、酶切载体shpDown-MCS

[0110] a)酶切体系：

[0111]

[0112] b)37℃酶切3h。

[0113] c)6×loading buffer终止反应，1%的琼脂糖凝胶电泳并切胶回收约3043bp的载体片段。

[0114] 3）连接

[0115] a)连接体系：

[0116]

[0117]

[0118] b)16℃连接过夜，将连接产物转化stb13感受态细菌，菌落PCR筛选阳性重组子。

[0119] PCR鉴定引物：

[0120] shpDown-flank-f：AGCTACATTTTACATGATAGGCTT

[0121] shpDown-flank-r：AGCGAGCTTATCGATACCGT

[0122] 得到234bp的为阳性重组子；提取质粒送去测序，测序引物：shpDown-flank-f：AGCTACATTTTACATGATAGGCTT，结果该质粒为将shRNA HIP-55(Rat)的编码基因（退火的shHIP-55Oligo DNA）插入shpDown-MCS中得到的载体，命名为shpDwon-HIP-55。

[0123] 2）shRNA干扰HIP-55表达重组腺病毒载体shpAd-HIP-55

[0124] 利用Gateway Technology构建shpAd-HIP-55，具体如下：

[0125] LR反应体系：

[0126]

[0127] 加入0.5ul蛋白酶K于37℃终止反应10min，得到LR反应产物。

[0128] 将LR反应产物转化到大肠杆菌Stbl3中，挑取挑取单克隆摇菌小量提取质粒，送去测序，测序引物：pAd/PL-flank-f：GGCCGCTAGCGACATCGATC和pAd/PL-flank-r：CCTTAAGCCACGCCCACAC，结果为该质粒为将shRNA HIP-55(Rat)的编码基因（退火的shHIP-55Oligo DNA）插入pAd/PL-Dest中得到的载体，将该质粒命名为shpAd-HIP-55。

[0129] 2、shRNA干扰HIP-55表达的重组腺病毒的获得

[0130] 将上述获得的shRNA干扰HIP-55表达重组腺病毒载体shpAd-HIP-55转入HEK293A细胞，包装得到shRNA干扰HIP-55表达重组腺病毒（简称KD1）。

[0131] 3、对照shRNA干扰重组腺病毒

[0132] 1）对照shRNA干扰重组腺病毒载体shpDown-Scramble的构建

[0133] （1）Oligo DNA的退火

[0134] a)把待退火DNA oligo用DEPC处理的水配置成50μM，溶解Annealing Buffer for DNA Oligos(5×)，混匀备用。

[0135] b)设置反应体系：

[0136]

[0137]

[0138] c)退火产物-20℃保存，得到和退火Control Oligo DNA（核苷酸序列为序列6，）。

[0139] （2）酶切载体shpDown-MCS

[0140] a)酶切体系：

[0141]

[0142] b)37℃酶切3h；

[0143] d)6×loading buffer终止反应，1%的琼脂糖凝胶电泳并切胶回收3kb的载体片段。

[0144] 3）连接

[0145] a)连接体系：

[0146]

[0147] b)16℃连接过夜，将连接产物转化stb13感受态细菌，菌落PCR筛选阳性重组子。

[0148] PCR鉴定引物：

[0149] shpDown-flank-f：AGCTACATTTTACATGATAGGCTT

[0150] shpDown-flank-r：AGCGAGCTTATCGATACCGT

[0151] 得到230bp的为阳性重组子；提取质粒送去测序，测序引物：shpDown-flank-f：AGCTACATTTTACATGATAGGCTT，结果该质粒为将Control shRNA编码基因（退火Control Oligo DNA）插入shpDown-MCS中得到的载体，命名为shpDown-Scramble。

[0152] 2）Scramble干扰HIP-55表达重组腺病毒载体shpAd-Scramble

[0153] 利用Gateway Technology构建shpAd-Scramble，具体如下：

[0154] LR反应体系：

[0155]

[0156] 加入0.5ul蛋白酶K于37℃终止反应10min，得到LR反应产物。

[0157] 将LR反应产物转化到大肠杆菌Stbl3中，挑取挑取单克隆摇菌小量提取质粒，送去测序，测序引物：pAd/PL-flank-f：GGCCGCTAGCGACATCGATC和pAd/PL-flank-r：CCTTAAGCCACGCCCACAC，结果为该质粒为将Control shRNA编码基因（退火Control Oligo DNA）插入pAd/PL-Dest中得到的载体，将该质粒命名为shpAd-Scramble。

[0158] 3）、对照shRNA干扰重组腺病毒

[0159] 将上述步骤2）得到的获得的对照shRNA干扰重组腺病毒载体shpAd-Scramble转入HEK293A细胞，包装得到对照shRNA干扰重组腺病毒（简称scramble）。

[0160] 4、验证

[0161] 1）转染

[0162] 将上述步骤2制备shRNA干扰HIP-55表达重组腺病毒（KD1）和步骤3制备对照shRNA干扰重组腺病毒（scramble）、pAd/PL-Dest腺病毒（将空载体pAd/PL-Dest转入HEK293A细胞，包装得到的腺病毒）转染离体心脏成纤维细胞，得到shRNA干扰HIP-55表达重组腺病毒的细胞、感染对照shRNA干扰重组腺病毒细胞和感染pAd/PL-Dest腺病毒细胞。

[0163] 2）转录水平验证

[0164] 将上述shRNA干扰HIP-55表达重组腺病毒（KD1）细胞和感染对照shRNA干扰重组腺病毒（scramble）细胞分别提取RNA，反转录得到cDNA作为模板，用表5中的HIP-55)F和HIP-55)R为引物进行RT-PCR扩增。以感染pAd/PL-Dest腺病毒细胞和正常的离体心脏成纤维细胞为对照。

[0165] 表5为引物序列

[0166]引物名称 引物序列
HIP-55)F TGCGAAAAGGAGCATGTGCCAA
HIP-55)R GGCAACCTTCTCCATGATGCAC
内参GAPDH Forward CCTTCCGTGTTCCTACCC
内参GAPDH Reverse CCTTCCGTGTTCCTACCC

[0167] 结果如表6所示，可以看出，与感染对照shRNA干扰重组腺病毒（scramble）细胞相比，shRNA干扰HIP-55表达重组腺病毒（KD1）的细胞中的HIP-55表达受到抑制；表明HIP-55shRNA在成纤维细胞中敲减HIP-55。

[0168] 感染对照shRNA干扰重组腺病毒（scramble）细胞、感染pAd/PL-Dest腺病毒细胞和正常的离体心脏成纤维细胞结果无显著差异。

[0169] 表6为RT-PCR鉴定HIP-55shRNA干扰率

[0170]

[0171] 3）Western blot验证

[0172] A、心脏成纤维细胞蛋白提取

[0173] 分别收获感染shRNA干扰HIP-55表达重组腺病毒（KD1）的细胞、感染对照shRNA干扰重组腺病毒（scramble）细胞细胞、感染pAd/PL-Dest腺病毒细胞和离体心脏成纤维细胞，冷PBS洗细胞二次（样本欲检测磷酸化AMPK时则不洗，直接加裂解液），60mm培养皿中加入100μl细胞裂解液（20mmol/L Tris-HCl PH7.4,150mmol/L NaCl,2.5mmol/L EDTA,50mmol/L NaF,0.1mmol/L Na4P2O7,1mmol/L Na3VO4,1%Triton X-100,10%glycerol,0.1%SDS,1%deoxycholic acid,1mmol/L PMSF,and1μg/mlaprotinin）裂解细胞10分钟，用细胞刮刮下并移入Ep管中，超声处理后于4℃，12,000g离心15min，所得上清液冻存于-70℃。蛋白定量采用BCA方法，所得上清液冻存于-70，得到感染shRNA干扰HIP-55表达重组腺病毒（KD1）的细胞蛋白、感染对照shRNA干扰重组腺病毒（scramble）细胞蛋白、感染pAd/PL-Dest腺病毒细胞蛋白和离体心脏成纤维细胞蛋白。

[0174] B、Western blot

[0175] 将上述A得到的感染shRNA干扰HIP-55表达重组腺病毒（KD1）的细胞蛋白、感染对照shRNA干扰重组腺病毒（scramble）细胞蛋白、感染pAd/PL-Dest腺病毒细胞蛋白和离体心脏成纤维细胞蛋白进行Western blot检测，一抗为Anti-HIP-55（BD公司；货号：612614）、Anti-GAPDH（santa cruz公司；货号：sc-32233）（稀释度均1:1000），二抗为辣根过氧化物酶标记（中杉金桥公司，货号ZB-2305）（稀释度1:4000）。

[0176] 结果如图2所示，上图为电泳图，下图为定量统计结果；与感染对照shRNA干扰重组腺病毒（scramble）细胞相比，感染shRNA干扰HIP-55表达重组腺病毒（KD1）的细胞内的HIP-55蛋白表达明显减低，降低率在70%。感染对照shRNA干扰重组腺病毒（scramble）细胞、感染pAd/PL-Dest腺病毒细胞和正常的离体心脏成纤维细胞结果无显著差异。

[0177] 进一步表明HIP-55shRNA在心脏成纤维细胞中敲减HIP-55。

[0178] 实施例2、HIP-55的功能研究

[0179] 1、HIP-55与心脏成纤维细胞增殖的影响

[0180] 1）Brdu ELISA检测4

[0181] 将离体心脏成纤维细胞传代种于96孔板，细胞密度为3.5*10个/mL,100μl/孔，待细胞融合度达到60～70％时，换用无血清培养，感染腺病毒；上述腺病毒分别为由实施例1制备得到的过表达HIP-55重组腺病毒（Dsred-HIP55）、Des1d腺病毒（Dsred）、shRNA干扰HIP-55表达重组腺病毒（KD1）、对照shRNA干扰重组腺病毒（scramble）、pAd/PL-Dest腺-5病毒。培养24小时后，再给异丙肾上腺素（ISO，终浓度为10 mol/L）处理24小时后收样。
收样前6小时，掺入BrdU10μl/孔(终浓度10μmol/L)。收样时弃上清，拍干。

[0182] 使用Cell Proliferation ELISA,BrdU kit（Roche,Cat No.11647229001）测量BrdU掺入情况。具体步骤如下：加入200μl/孔Fix Denat室温（25℃）孵育30分钟；弃去，轻拍；加入100μl/孔anti-BrdU-POD工作液，室温孵育90分钟；弃去液体，加200μl/孔的洗涤液洗3次；拍干，加入100μl/孔底物溶液，室温孵育15分钟。加入25μl/孔2mol/L硫酸终止反应，在酶联免疫检测仪OD450nm波长测定吸光值。

[0183] HIP-55过表达结果表明HIP-55能够明显抑制心肌成纤维细胞增殖，如图3A所示：

[0184] 以感染Des1d腺病毒（Dsred）的细胞为对照，其BrdU参入量为1；经过ISO处理后的感染Des1d腺病毒（Dsred）细胞BrdU参入量为1.72；

[0185] 感染过表达HIP-55重组腺病毒（Dsred-HIP55）细胞BrdU参入量为0.84；经过ISO处理后的感染过表达HIP-55重组腺病毒（Dsred-HIP55）细胞BrdU参入量为1.36；

[0186] 可以看出，给予ISO刺激后能够明显诱导心脏成纤维细胞增殖（p<0.001）,过表达HIP-55后能够明显抑制ISO诱导的心脏成纤维细胞增殖（p<0.05）。

[0187] HIP-55敲减结果进一步表明HIP-55能够明显促进心肌成纤维细胞增殖，结果如图3B所示：

[0188] 以感染对照shRNA干扰重组腺病毒（scramble）细胞为对照，其BrdU参入量为1；经过ISO处理后的感染对照shRNA干扰重组腺病毒（scramble）细胞BrdU参入量为1.41；

[0189] 感染shRNA干扰HIP-55表达重组腺病毒（KD1）细胞BrdU参入量为1.06；经过ISO处理后的感染shRNA干扰HIP-55表达重组腺病毒（KD1）细胞BrdU参入量为2.01；

[0190] 对照shRNA干扰重组腺病毒（scramble）和pAd/PL-Dest腺病毒结果无显著差异。

[0191] 以感染重组腺病毒（scramble）细胞为对照，给予ISO刺激后能够明显诱导心脏成纤维细胞增殖（p<0.001）,敲减HIP-55后能够明显增强ISO诱导的心脏成纤维细胞增殖（p<0.01）。

[0192] 2）、Cell Counting Kit-8(CCK-8试剂盒)检测

[0193] 将离体心脏成纤维细胞传代种于96孔板，细胞密度为3.5×104个/mL,100μl/孔，待细胞融合度达到60～70％时，换用无血清培养，感染腺病毒；上述腺病毒为由实施例1制备得到的过表达HIP-55重组腺病毒（Dsred-HIP55）、Des1d腺病毒（Dsred）、shRNA干扰HIP-55表达重组腺病毒（KD1）、对照shRNA干扰重组腺病毒（scramble）和pAd/PL-Dest腺-5
病毒。培养24小时后，再给ISO(终浓度10 mol/L）处理24h后，每孔100μl不含血清培养液中加入CCK810μl，37°C，5％CO2培养箱静置培养2h。

[0194] 用CCK8细胞增殖试剂盒（dojindo公司(日本)货号ck04）检测增殖，在酶联免疫检测仪上490nm波长处测定光吸收值，用只加培养液的空白孔调零。

[0195] CCK8检测结果同样表明HIP-55过表达HIP-55能够明显抑制心肌成纤维细胞增殖，如图4A所示，

[0196] 以感染Des1d腺病毒（Dsred）的细胞为对照，CCK8吸光值为1；经过ISO处理后的感染Des1d腺病毒（Dsred）细胞CCK8吸光值为1.35；

[0197] 感染过表达HIP-55重组腺病毒（Dsred-HIP55）细胞CCK8吸光值为0.89；经过ISO处理后的感染过表达HIP-55重组腺病毒（Dsred-HIP55）细胞CCK8吸光值为1.16；

[0198] 可以看出，以感染腺病毒（Dsred）的细胞为对照，给予ISO刺激后能够明显诱导心脏成纤维细胞增殖（p<0.001）,过表达HIP-55后能够明显抑制ISO诱导的心脏成纤维细胞增殖（p<0.05）。

[0199] HIP-55敲减结果进一步表明HIP-55能够明显促进心肌成纤维细胞增殖，结果如图4B所示：

[0200] 以感染对照shRNA干扰重组腺病毒（scramble）细胞为对照，其CCK8吸光值为1；经过ISO处理后的感染对照shRNA干扰重组腺病毒（scramble）细胞CCK8吸光值为1.45；

[0201] 感染shRNA干扰HIP-55表达重组腺病毒（KD1）细胞CCK8吸光值为1.24；经过ISO处理后的感染shRNA干扰HIP-55表达重组腺病毒（KD1）细胞CCK8吸光值为1.89；

[0202] 对照shRNA干扰重组腺病毒（scramble）和pAd/PL-Dest腺病毒结果无显著差异。

[0203] 以感染重组腺病毒（scramble）细胞为对照，给予ISO刺激后能够明显诱导心脏成纤维细胞增殖（p<0.001）,敲减HIP-55后能够明显增强ISO诱导的心脏成纤维细胞增殖（p<0.01）。

[0204] 总之，上述Brdu ELISA和CCK8法检测细胞增殖结果表明，敲减HIP-55后心脏成纤维细胞的增殖明显增强。与之相反，过表达HIP-55后心脏成纤维细胞的增殖明显减弱。证明HIP-55能够明显抑制心脏成纤维细胞增殖。

[0205] 2、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)活性对心脏成纤维细胞增殖的影响[0206] 本实验采用p38MAPK选择性抑制剂SB202190（10μm）抑制p38MAPK激酶的活性，检测p38MAPK激酶的活性对ISO诱导的心脏成纤维细胞增殖的影响。

[0207] 方法按照上述1的1），将离体第二代心脏成纤维细胞传代种于96孔板，细胞密度4
为3.5*10个/mL,100μl/孔，待细胞融合度达到60～70％时，换用无血清培养24小时后，先给予P38抑制剂SB202190（10μM）孵育30min后，再给异丙肾上腺素（ISO，终浓度为-5
10 mol/L）处理24小时后收样。收样前6小时，掺入BrdU10μl/孔(终浓度10μmol/L)，收样时弃上清，拍干。

[0208] 结果表明ISO能够明显诱导的心脏成纤维细胞增殖，p38MAPK选择性抑制剂SB202190能够明显抑制ISO诱导的心脏成纤维细胞增殖（图5）。说明ISO诱导心脏成纤维细胞增殖是通过激活p38MAPK活性引起的。

[0209] 3、HIP-55对心脏成纤维细胞P38MAPK激酶活性的影响

[0210] 1）心脏成纤维细胞体外P38MAPK激酶活性分析本实验采用非放射性P38MAPK激酶分析试剂盒检测体外P38MAPK激酶（为两种亚型，其氨基酸序列为序列表中的序列8或序列9）活性，试剂盒购自(cell signaling公司货号#9820)；具体如下：

[0211] （1）配制1×lysis buffer；从－20℃取出10×lysis buffer，冰上融化；加入1mmol/l PMSF，用dd H2O配制；

[0212] （2）将细胞接种在100mm培养皿，加入终浓度为10μM ISO孵育培养10分钟；

[0213] （3）用上述lysis buffer裂解细胞，细胞裂解液离心收集上清液即为总蛋白；BCA法检测总蛋白含量；上清液－80℃冻存。

[0214] （4）每个样品取500μg总蛋白，用lysis buffer调整体积至600μl。

[0215] （7）分别加入磷酸化P38MAPK抗体小珠悬液20μl，4℃，旋转孵育过夜。

[0216] （8）4℃，14000g离心，30s，小心弃上清液。

[0217] （9）用500μl lysis buffer清洗小珠，共2次。

[0218] （10）用1×kinase buffer再洗2次。

[0219] （11）最后用50μl kinase buffer重悬。

[0220] （12）各样加入1μl ATP（200μmol/l）以及1μl ATF-2融合蛋白（ATF-2是P38MAPK激酶底物，p-ATF2水平代表了P38MAPK激酶活性）。

[0221] （13）30℃，孵育30min。

[0222] （14）加入25μl3×SDS上样缓冲液终止反应。

[0223] （15）混匀，14000g离心，30s。

[0224] （16）100℃，煮沸5min。－80℃冻存。

[0225] （17）用抗ATF-2磷酸化抗体（Thr76）进行western blot，样本离心后取体积25μl上清液上样，检测P38MAPK激酶活性。

[0226] 上述细胞为感染过表达HIP-55重组腺病毒（Dsred-HIP55）的细胞、感染pAd-CMV>Flag/IRES/DsRed Express2腺病毒（Dsred）的对照细胞、感染shRNA干扰HIP-55表达重组腺病毒（KD1）的细胞、感染对照shRNA干扰重组腺病毒（scramble）对照细胞、感染pAd/PL-Dest腺病毒细胞。

[0227] 结果如图6所示，其中，A为HIP-55过表达的结果；B为HIP-55过表达定量结果；C为HIP-55shRNA干扰结果；“-”号表示没有ISO诱导；“+”号表示10μM ISO诱导；D为HIP-55shRNA干扰定量结果；

[0228] 图6B中可以看出，以感染Des1d腺病毒（Dsred）的细胞为对照，p-ATF2相对表达量为1；经过ISO处理后的感染Des1d腺病毒（Dsred）细胞p-ATF2相对表达量为2.45；

[0229] 感染过表达HIP-55重组腺病毒（Dsred-HIP55）细胞p-ATF2相对表达量为1.03；经过ISO处理后的感染过表达HIP-55重组腺病毒（Dsred-HIP55）细胞p-ATF2相对表达量为1.63；

[0230] 图6D中可以看出，以感染对照shRNA干扰重组腺病毒（scramble）细胞为对照，p-ATF2相对表达量1；经过ISO处理后的感染对照shRNA干扰重组腺病毒（scramble）细胞p-ATF2相对表达量为1.57；

[0231] 感染shRNA干扰HIP-55表达重组腺病毒（KD1）细胞p-ATF2相对表达量为1.24；经过ISO处理后的感染shRNA干扰HIP-55表达重组腺病毒（KD1）细胞p-ATF2相对表达量为2.16；

[0232] 对照shRNA干扰重组腺病毒（scramble）和pAd/PL-Dest腺病毒结果无显著差异。

[0233] 从图6A/B和6C/D上可以看出，与感染pAd-CMV>Flag/IRES/DsRed Express2腺病毒（Dsred）的对照细胞相比，感染过表达HIP-55重组腺病毒（Dsred-HIP55）细胞的P38MAPK激酶底物ATF-2磷酸化（p-ATF2）水平明显减弱，说明抑制P38MAPK激酶活性。与之相反，与感染shRNA干扰重组腺病毒（scramble）对照细胞相比，感染shRNA干扰HIP-55表达重组腺病毒（KD1,敲减HIP-55）的ATF-2磷酸化（p-ATF-2）水平明显增强，说明促进P38MAPK激酶活性。

[0234] 以上结果表明，在心脏成纤维细胞中过表达HIP-55能够明显抑制P38MAPK激酶活性（以ATF2做为底物检测，其磷酸化水平反映P38MAPK激酶活性），相反，在心脏成纤维细胞中敲减HIP-55则明显增强P38MAPK激酶活性。因此，HIP-55在心脏成纤维细胞中抑制P38MAPK激酶活性。