利用固定化酶合成胆红素的方法

摘要

本发明涉及一种胆红素生产方法技术领域。本发明公开利用固定化酶促合成胆红素的方法。该方法包括如下步骤：a)分别克隆血红素加氧酶基因和胆绿素还原酶基因；b)于大肠杆菌中分别表达重组的血红素加氧酶和胆绿素还原酶；c)提取血红素加氧酶的粗提物或其纯酶以及胆绿素还原酶的粗提物或其纯酶；d)固定化血红素加氧酶的粗提物或其纯酶以及胆绿素还原酶的粗提物或其纯酶；e)同时用固定化血红素加氧酶和固定化胆绿素还原酶催化，以血红素和氧气为底物，在氧化型辅酶II辅助下制备胆红素。

权利要求

1.一种利用固定化酶促合成胆红素的方法，其特征在于同时利用固定化血红素加氧酶和固定化胆绿素还原酶,以血红素和氧气为底物,在氧化型辅酶II（NADP）辅助下生产胆红素；其中所述血红素加氧酶由源自Clostridium tetani E88的血红素加氧酶基因编码，并且是在大肠杆菌中表达的重组蛋白，该重组蛋白在大肠杆菌中表达后，通过破菌后粗蛋白直接固定化而形成固定化酶；

所述胆绿素还原酶由源自Synechocystis sp.PCC6803的胆绿素还原酶基因编码，并且是在大肠杆菌中表达的重组蛋白，该重组蛋白在大肠杆菌中表达后，通过破菌后粗蛋白直接固定化而形成固定化酶；

所述源自Clostridium tetani E88的血红素加氧酶基因通过以下方法获得：

根据基因库GenBank NC_004557基因序列设计引物HO-F:5’AACATATGTCAATAATTAATAATTATAT3’和HO-R:5’AAGGCGCGCCCTATTTAAATCTATCAAATTCT3’，用引物对HO-F和HO-R从Clostridium tetani E88中扩增血红素加氧酶编码基因；

扩增条件为：20mM pH8.8的Tris-HCl，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1%Triton X-100，50μM dATP，50μM dTTP，50μM dCTP，50μM dGTP，400nM引物HO-F，400nM引物HO-R，1.0U Pfu DNA聚合酶，用接种环挑取少许Clostridium tetani E88菌体，再用无菌水调反应体积至50μl；

PCR扩增反应程序为：95℃3分钟，35圈循环：95℃50秒、50℃30秒和72℃1分钟，最后72℃10分钟，扩增的产物经限制性内切酶NdeI和AscI酶切后与经同样限制性内切酶NdeI和AscI酶切的载体pRSET-A连接，得质粒pRSET-HO，经DNA测序，确定该被克隆的血红素加氧酶的核苷酸序列；并且所述源自Synechocystis sp.PCC6803的胆绿素还原酶基因通过以下方法获得：

根据基因库GenBank NC_000911基因序列设计引物BR-F:5’AACATATGTCTGAAAATTTTGCAGTT3’和BR-R:5’AAGGCGCGCCCTAATTTTCAACCTTATATCCA3’，用引物对BR-F和BR-R从Synechocystis sp.PCC6803中扩增胆绿素还原酶编码基因；

扩增条件为：20mM pH8.8的Tris-HCl，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1%Triton X-100，50μM dATP，50μM dTTP，50μM dCTP，50μM dGTP，400nM引物BR-F，400nM引物BR-R，1.0U Pfu DNA聚合酶，用接种环挑取少许Synechocystis sp.PCC6803菌体，再用无菌水调反应体积至50μl；

PCR扩增反应程序为：95℃3分钟，35圈循环：95℃50秒、50℃30秒和72℃1分钟，最后72℃10分钟，扩增的产物经限制性内切酶NdeI和AscI酶切后与经同样限制性内切酶NdeI和AscI酶切的载体pRSET-A连接，得质粒pRSET-BR，经DNA测序，确定该被克隆的胆绿素还原酶的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述固定化采用环氧型载体LX-3000作为酶固定化载体。

说明书

利用固定化酶合成胆红素的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及分子生物学与生物技术领域,具体地说,涉及利用固定化酶促合成胆红素的方法。背景技术：

[0002] 胆红素是人胆汁中的主要色素，呈橙黄色。胆红素具备多种药理作用，是制造人工牛黄的主要原料。药理实验证明，它对W256瘤有较好的抑制作用;它对乙型脑炎病毒的灭活率,抑制指数比去氧胆酸和胆酸高1～1.5倍；它还是一种有效的肝脏疾病的治疗药物，在不破坏肝组织的情况下，有增殖新细胞的作用，可治疗血清肝炎、肝硬变等病。此外，胆红素具有镇静、镇惊、解热、降压等作用。主要用于人工牛黄的原料及药品、保健品、化妆品等行业。

[0003] 牛黄是牛的胆结石，在我国药用已有二千多年历史，是世界上公认的珍贵稀有药料，以牛黄配制的中成药方180多个品种，如日本的救心丹，我国的安宫牛黄丸等。目前市场上的牛黄有天然牛黄、人工合成牛黄及人工培育牛黄。市场上以人工牛黄为主。

[0004] 人工牛黄的纯胆红素含量只有0.7%。人工牛黄粉胆红素含量太低，远远低于天然牛黄35%的含量标准，功效大打折扣是可想而知的。假定人工牛黄粉胆红素含量按35%的胆红素配制而成本增加不多,则人工牛黄市场会更大。

[0005] 按常规方法生产胆红素(即以动物如猪胆为材料经化学方法提取),由于技术门槛太低，毛利润率极低,国内生产企业众多，如四川什邡市康源植物原料有限公司、福建瑞国药业有限公司/哈尔滨瑞国医药有限公司、四川菲德力制药有限公司、安徽科宝生物工程有限公司等。

[0006] 目前，胆红素是来自胆汁，一公斤胆红素约需5万个猪胆，故胆红素成本较高，因而售价也高。酶催化生产高纯度胆红素之综合成本较低，故经济效益极佳。发明内容:

[0007] 本发明的目的在于提供一种利用固定化酶促合成胆红素的方法。本发明的另一目的还在于提供含有编码本发明所述的血红素加氧酶和胆绿素还原酶的基因序列。本发明的再一目的在于同时利用固定化血红素加氧酶和固定化胆绿素还原酶催化,以血红素和氧气为底物,在氧化型辅酶II辅助下生产胆红素。

[0008] 为实现本发明的上述目的，本发明人进行了大量深入的实验，通过克隆较佳的血红素加氧酶和胆绿素还原酶的基因至适当的载体，转入大肠杆菌后,本发明的血红素加氧酶和胆绿素还原酶在大肠杆菌中皆高表达。表达的重组蛋白菌体未破菌直接固定化、或破菌后粗蛋白直接固定化、又或破菌后粗蛋白经纯化得纯蛋白再固定化，进而形成固定化酶，并获得了高活力的固定化血红素加氧酶和高活力的固定化胆绿素还原酶，该固定化血红素加氧酶和固定化胆绿素还原酶能以血红素和氧气为底物,在氧化型辅酶II辅助下生产胆红素。

[0009] 本发明的血红素加氧酶是来源于Clostridium tetani E88。

[0010] 本发明的胆绿素还原酶是来源于Synechocystis sp.PCC6803。

[0011] 本发明的酶固定化载体是选择了环氧型载体LX-3000,还可选用本领域的其它酶固定化载体,如传统的无机载体材料二氧化硅、活性炭、玻璃珠等,再如有机高分子载体大孔型聚N-氨乙基丙烯酰胺-聚乙烯等。通过与该类型载体结合,本发明获得了高活力的固定化血红素加氧酶和固定化胆绿素还原酶,该二酶以血红素和氧气为底物,在氧化型辅酶II辅助下高转化率(大于80%)生产胆红素。

[0012] 附图的简要说明:

[0013] 图1A:重组的血红素加氧酶(粗提蛋白)之聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果,图中右边条带M并配有数字(单位是“KD”)是蛋白分子量标准,左边主带是重组的血红素加氧酶(粗提蛋白)，具体参见实施例3;

[0014] 图1B:重组的胆绿素还原酶(粗提蛋白)之聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果,图中右边条带M并配有数字(单位是“KD”)是蛋白分子量标准,左边主带是重组的胆绿素还原酶(粗提蛋白)，具体参见实施例4;具体实施方式：

[0015] 利用本领域已知的技术，先分别构建含有编码血红素加氧酶和胆绿素还原酶的基因的载体质粒，然后转入大肠杆菌后,无须诱导培养，将表达的血红素加氧酶和胆绿素还原酶提取并固定于适当的环氧型酶载体,从而获得高活力的固定化血红素加氧酶和高活力的固定化胆绿素还原酶。该固定化血红素加氧酶和固定化胆绿素还原酶双酶合力催化，以血红素和氧气为底物,在氧化型辅酶II辅助下生产胆红素。

[0016] 本发明所获得的血红素加氧酶和胆绿素还原酶基因可以在原核细胞或真核细胞胞内表达，也可采用本领域已知的任何其它适当方法实现在原核细胞或真核细胞胞外表达。

[0017] 在本发明制备血红素加氧酶和胆绿素还原酶的方法中，所述载体的宿主细胞为原核细胞或真核细胞。所述原核细胞包括但不限于大肠杆菌(如HB101,BL21,JM109,DH5α)﹑凝结芽孢杆菌﹑枯草芽胞杆菌和链霉菌。所述真核细胞包括但不限于酿酒酵母和毕赤巴斯德酵母(如毕赤巴斯德酵母GS115/9891)。

[0018] 本发明用于克隆血红素加氧酶和胆绿素还原酶基因的载体包括但不限于pRSET系列、pGEM-T系列等。

[0019] 本发明用于固定化血红素加氧酶和胆绿素还原酶基因的载体包括但不限于环氧型载体等。

[0020] 在本申请文本中所用的氨基酸三字母或单字母表达方式，采用IUPAC规定的氨基酸代码(Eur.J.Biochem.,138:9-37,1984)。

[0021] 下列实施例仅用于说明本发明而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按常规条件或制造商建议的条件进行。

[0022] 实施例1:血红素加氧酶编码基因的扩增与克隆

[0023] 根据基因库(GenBank NC_004557)基因序列设计引物HO-F:5’AACATATGTCAATAATTAATAATTATAT3’和HO-R:5’AAGGCGCGCCCTATTTAAATCTATCAAATTCT3’。用引物对HO-F和HO-R从Clostridium tetani E88中扩增血红素加氧酶编码基因。

[0024] 扩 增 条 件 为：20mM Tris-HCl(pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1%Triton X-100，50μM dATP,50μM dTTP,50μM dCTP,50μM dGTP，400nM引物HO-F，
400nM引物HO-R，1.0U Pfu DNA聚合酶(Promega，USA)，用接种环挑取少许Clostridium tetani E88菌体，再用无菌水调反应体积至50μl。

[0025] PCR扩增反应程序为：95℃3分钟，35圈循环：95℃50秒、50℃30秒和72℃1分钟，最后72℃10分钟。扩增的产物经限制性内切酶NdeI和AscI酶切后与经同样限制性内切酶NdeI和AscI酶切的载体pRSET-A(源自Invitrogen,USA)连接，得质粒pRSET-HO。经DNA测序，确定该被克隆的血红素加氧酶的核苷酸序列。

[0026] 实施例2：胆绿素还原酶编码基因的扩增与克隆

[0027] 根据基因库(GenBank NC_000911)基因序列设计引物BR-F:5’AACATATGTCTGAAAATTTTGCAGTT3’和BR-R:5’AAGGCGCGCCCTAATTTTCAACCTTATATCCA3’。用引物对BR-F和BR-R从Synechocystis sp.PCC6803中扩增胆绿素还原酶编码基因。

[0028] 扩 增 条 件 为：20mM Tris-HCl(pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1%Triton X-100，50μM dATP,50μM dTTP,50μM dCTP,50μM dGTP，400nM引物BR-F，
400nM引物BR-R，1.0U Pfu DNA聚合酶(Promega，USA)，用接种环挑取少许Synechocystis sp.PCC6803菌体，再用无菌水调反应体积至50μl。

[0029] PCR扩增反应程序为：95℃3分钟，35圈循环：95℃50秒、50℃30秒和72℃1分钟，最后72℃10分钟。扩增的产物经限制性内切酶NdeI和AscI酶切后与经同样限制性内切酶NdeI和AscI酶切的载体pRSET-A(源自Invitrogen,USA)连接，得质粒pRSET-BR。经DNA测序，确定该被克隆的胆绿素还原酶的核苷酸序列。

[0030] 实施例3：血红素加氧酶的提取

[0031] 血红素加氧酶的提取与纯化主要参考Hong-Bo Hu,et al.Bioprocess Biosyst Eng.2007，30:87–90。具体过程如下：

[0032] 将含血红素加氧酶基因的质粒pRSET-HO转化感受态细菌细胞E.coli HB101，在Luria broth(LB)平板(含100mg/L卡那霉素)上37℃培养24小时。接种单个克隆于5毫升LB液体培养基(含100mg/L卡那霉素)中于30℃培养20-24小时。离心收集菌体，并悬浮于1毫升100mM Tris盐酸缓冲液(pH7.5)中。然后用超声波裂解细菌细胞。离心(10℃，17,800g，10分钟)并收集上清液,即为粗提蛋白(或称粗提物)。

[0033] 图1A显示了重组的血红素加氧酶粗提蛋白之聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果，表明血红素加氧酶(目标带大小约为26.5kD)在大肠杆菌HB101中有相当高的表达水平。

[0034] 实施例4：胆绿素还原酶的提取

[0035] 胆 绿 素 还 原 酶 的 提 取 与 纯 化 主 要 参 考 Aya Watanabe,et al.Acta Cryst.2011,F67,313–317。具体过程如下：

[0036] 将含胆绿素还原酶基因的质粒pRSET-BR转化感受态细菌细胞E.coli HB101，在Luria broth(LB)平板(含100mg/L卡那霉素)上37℃培养24小时。接种单个克隆于5毫升LB液体培养基(含100mg/L卡那霉素)中于30℃培养20-24小时。离心收集菌体，并悬浮于1毫升100mM Tris盐酸缓冲液(pH7.5)中。然后用超声波裂解细菌细胞。离心(10℃，17,800g，10分钟)并收集上清液,即为粗提蛋白(或称粗提物)。

[0037] 图1B显示了重组的胆绿素还原酶粗提蛋白之聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果，表明胆绿素还原酶(目标带大小约为36.6kD)在大肠杆菌HB101中有较高表达水平。

[0038] 实施例5：血红素加氧酶活性的测定

[0039] 配制底物溶液:含50μM的血红素、50μM的抗坏血酸和100mM Tris盐酸缓冲液，调pH至7.5。取底物溶液400微升，然后加入100微升血红素加氧酶粗提蛋白,于30℃进行30分钟反应。离心(10℃，17,800g，15分钟)并收集上清液。通过高压液相色谱(HPLC)测定所得上清液中胆绿素的含量。用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定酶蛋白浓度。一单位酶比活性定义为在上述条件下每分钟转化一微摩尔血红素为胆绿素所需之酶量。血红素加氧酶(粗提蛋白)特异性活力为0.6U/mg。

[0040] 实施例6：胆绿素还原酶活性的测定

[0041] 配制底物溶液:含20mM的胆绿素、5mM NADP、50mM磷酸钾缓冲液和终浓度为10mM之MgCl2，调pH至7.5。取底物溶液400微升，然后加入100微升胆绿素还原酶粗提蛋白,于37℃进行30分钟反应。离心(10℃，17,800g，15分钟)并收集上清液。通过高压液相色谱(HPLC)测定所得上清液中胆红素的含量。用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定酶蛋白浓度。一单位酶比活性定义为在上述条件下每分钟转化一微摩尔胆绿素为胆红素所需之酶量。结果,胆绿素还原酶(粗提蛋白)特异性活力为0.2U/mg。

[0042] 实施例7：血红素加氧酶固定化

[0043] 取血红素加氧酶粗提蛋白，用洗酶缓冲液（0.02M Tris-HCl/0.001MEDTA,pH7.0溶液）稀释至蛋白含量5～10mg/ml。将酶稀释液与PB溶液(2.0mol/L磷酸二氢钾,pH7.5)等体积混合,加入环氧型固定化酶载体LX-3000(10毫克酶/克载体)，于摇床(转速100rpm)中25°C反应20小时。反应完成后用滤袋过滤，用洗酶缓冲液清洗5～6次,得到固定化血红素加氧酶。

[0044] 实施例8：胆绿素还原酶固定化

[0045] 取胆绿素还原酶粗提蛋白，用洗酶缓冲液（0.02M Tris-HCl/0.001M EDTA,pH7.0溶液）稀释至蛋白含量5～10mg/ml。将酶稀释液与PB溶液(2.0mol/L磷酸二氢钾,pH7.5)等体积混合,加入环氧型固定化酶载体LX-3000(10毫克酶/克载体)，于摇床(转速100rpm)中25°C反应20小时。反应完成后用滤袋过滤，用洗酶缓冲液清洗5～6次,得到固定化胆绿素还原酶。

[0046] 实施例9：用固定化血红素加氧酶和胆绿素还原酶制备胆红素

[0047] 配制底物溶液:含100uM的血红素、100μM的抗坏血酸、1mM的NADP、100mM Tris盐酸缓冲液和终浓度为10mM之MgCl2，调pH至7.5。取底物溶液10毫升，然后加入0.5克固定化血红素加氧酶和0.5克固定化胆绿素还原酶,于35℃进行反应2-20小时。离心(10℃，17,800g，15分钟)并收集上清液。通过高压液相色谱(HPLC)测定所得上清液中胆红素的含量。结果,血红素转化为胆红素的转化率超过80%。

[0048] 本发明不受上述具体文字描述的限制，本发明可在权利要求书所概括的范围内做各种改变。这些改变均在本发明的范围之内。