结缕草耐盐性主效基因位点qLF-2的分子标记方法

摘要

本发明提供了结缕草耐盐主效基因位点qLF-2的分子标记方法，属于分子遗传学领域。对结缕草种源Z105与Z061杂交获得的F1家系的基因型和盐胁迫下的叶片枯黄率进行遗传连锁分析，获得结缕草耐盐主效基因位点qLF-2的分子标记。通过结缕草耐盐主效基因位点的分子标记来检测结缕草及其杂交后代中是否含有该主效基因位点，可预测其抗盐性水平，大大节约成本并提高结缕草耐盐性的选择效率。

权利要求

1. 检测结缕草耐盐性主效基因位点qLF-2 的分子标记方法，其特征在于：用标记引物Me12Em20的左端引物序列5’-TGAGTCCAAACCGGTAG-3’ 和右端引物序列

5’-GACTGCGTACGAATTGGT-3’

对结缕草叶片分离的DNA进行扩增，如果能分别扩增出220bp DNA片段，则标志着结缕草耐盐主效基因位点qLF-2的存在，该主效基因位点位于第5连锁群的42.25cM处，利用mapQTL5.0软件测得对结缕草耐盐性的贡献率为29.7%。

说明书

结缕草耐盐性主效基因位点qLF-2 的分子标记方法

[0001] 一、技术领域

[0002] 本发明提供了结缕草耐盐主效基因位点qLF-2的分子标记方法，属于分子遗传学领域，专用于结缕草耐盐新品种选育和种质资源的利用。

[0003] 二、背景技术

[0004] 土壤盐碱化是一个世界性的问题，全世界盐碱地面积近9.6×108hm2，我国有盐渍7 2
土3.47×10hm，相当于耕地面积的1/3。随着滨海盐碱地区的开发和园林绿化的需要，对
草坪草的耐盐性提出越来越高的要求，结缕草属植物作为一种重要的草坪草，培育优质耐
盐的结缕草属植物新品种是一项非常重要的任务。

[0005] 前期研究结果表明，与其它草坪草相比，结缕草属植物具有较强的耐盐性，但结缕草属内的不同种以及同一种的不同种源间的耐盐性存在较大的遗传变异。因此要选择一种
优质耐盐的结缕草进行盐碱地绿化，耐盐性鉴定是一项非常重要的工作。目前，关于结缕草
属植物耐盐性的鉴定均是通过水培法或土培法进行的，虽然这两种方法是区试之前，最直
接最有说服力的耐盐性鉴定方法，但是通过以上两种方法进行耐盐性鉴定需要非常大的工
作量，费时费力，且容易受环境的影响。当从大批量材料中筛选耐盐材料时有相当的困难。
使结缕草耐盐性育种进程受到很大影响。

[0006] 遗传研究结果表明结缕草的耐盐性存在主效基因位点（郭海林等. 结缕草（Zoysia japonica）耐盐性的遗传分析. 植物遗传资源学报, 2012, 13(5):733-738.）。
因此利用分子生物学的手段，通过构建结缕草属植物的遗传图谱，并对其耐盐性的主效基
因位点（Quantitative Trait Loci, QTL）进行分析，找到与耐盐性主效QTL紧密连锁的分
子标记对品种的耐盐性进行鉴定，将大大地节约成本，提高育种和选择效率。

[0007] 三、发明内容

[0008] 技术问题：本发明针对上述情况，提供一种结缕草耐盐主效基因位点的分子标记方法，通过检测这些耐盐性主效基因位点连锁的分子标记，可以预测结缕草的耐盐性强弱，
提高耐盐结缕草的选择效率。

[0009] 技术方案：

[0010] 用标记引物Me12Em20的左端引物序列5’-TGAGTCCAAACCGGTAG-3’ 和右端引物序列5’-GACTGCGTACGAATTGGT-3’

[0011] 对结缕草叶片分离的DNA进行扩增，如果能分别扩增出220bp DNA片段，则标志着结缕草耐盐主效基因位点qLF-2的存在，该主效基因位点位于第5连锁群的42.25cM处，利
用mapQTL5.0软件测得对结缕草耐盐性的贡献率为29.7%。

[0012] 有益效果：

[0013] 本发明所提供的结缕草耐盐主效基因位点的分子标记方法，其有益效果在于：

[0014] 通过本发明在国际上首次公开了结缕草耐盐性的两个主效基因位点结缕草耐盐主效基因位点qLF-2，该主效基因位点位于第5连锁群的42.25cM处，利用mapQTL5.0软
件测得对结缕草耐盐性的贡献率为29.7%。。通过与耐盐主效基因位点相关联的分子标记
Me12Em20-220对结缕草的耐盐性进行鉴定，可以克服水培法和土培法易受环境影响，工作
量大等缺点，特别是对大批量种源材料或者杂交后代进行耐盐性鉴定时将表现出明显的优
势，大大减少人力物力的浪费，提高育种和选择效率。

[0015] 附图说明：

[0016] 图1：结缕草耐盐性QTL连锁群定位分析示意图，其中：包含QTL的连锁区段被显示，左侧为标记之间的距离（cM），右侧为标记名称。

[0017] 四、具体实施方式

[0018] （一）结缕草F1耐盐分离群体的构建与耐盐性鉴定

[0019] 对结缕草耐盐种源材料Z105（Z. japonica，耐盐系数为0.72）和敏盐种源材料Z061(Z. japonica，耐盐系数为0.14) （均为公知公用品种，见参考文献：李亚,耿蕾, 刘
建秀.中国结缕草属植物抗盐性评价.草地学报, 2004,12(1):8-11,16.）通过控制授粉
法进行杂交育种，获得F1分离群体，包括120个F1个体。

[0020] 通过水培法（参考文献：陈静波，阎君，姜燕琴，郭海林，张婷婷，陈宣，刘建秀. 暖季型草坪草优良选系和品种抗盐性的初步评价.草业学报, 2009, 18(5):107-114.）对两
亲本及其F1群体进行耐盐性鉴定，实验在玻璃温室进行，具体采用盐度逐渐增加的方法，
以最终盐浓度达到20g/L维持1个月后统计盐胁迫下不同材料的叶片枯黄率，进行耐盐性
评价。

[0021] 耐盐性鉴定结果表明在盐处理过程中，所有材料的处理和对照表现出明显的差异，在盐处理下，结缕草属植物生长速度下降，叶片出现枯黄现象，但不同材料的耐盐性也
表现出明显的差异（表1），叶片枯黄率的统计结果表明，F1群体的叶片枯黄率变异范围为
10%~98.33%，平均为50.39%，变异系数为40.50%，母本Z105的叶片枯黄率为35%，父本Z061
的叶片枯黄率为95%。

[0022] 表1 杂交后代耐盐性鉴定结果）%
（
率
黄
枯片叶 76.66 76.66 76.66 33.86 00.07 00.07 00.07 00.07 76.17 76.17 76.17 76.17 05.27 33.37 33.37 00.57 76.67 76.67 05.77 33.87 00.08 00.08 76.18 33.38 00.58 00.58 76.68 33.88 00.59 33.89号
编
代后 121 231 361 48 36 501 111 321 8 08 88 831 241 28 731 44 6 65 651 541 63 451 38 22 11 311 71 411 64 32
）%
（
率
黄
枯片叶 00.05 00.05 00.05 00.05 76.15 76.15 33.35 00.55 00.55 00.55 76.65 76.65 76.65 76.65 05.75 00.06 00.06 00.06 76.16 76.16 76.16 76.16 33.36 33.36 33.36 33.36 33.36 33.36 00.56 00.56号
编
代 6 9 0 3 9 4 9 2 6 6
后 74 85 95 11 39 79 56 51 97 41 34 16 07 11 3 78 01 11 13 31 51 61 92 83 05 35 26 21 2 41
）%
（
率
黄
枯片叶 33.33 33.33 00.53 00.53 76.63 76.63 76.63 33.83 00.04 00.04 00.04 00.04 00.04 00.04 33.34 33.34 33.34 33.34 33.34 33.34 76.64 76.64 33.84 33.84 33.84 33.84 00.05 00.05 00.05 00.05号
编
代后 76 161 23 73 09 001 511 18 53 401 901 211 141 051 7 33 75 86 811 331 551 851 58 131 631 041 1 31 42 14
）%
（
率
黄
枯片叶 00.01 76.11 00.51 76.61 76.61 05.71 33.81 00.02 00.02 76.12 33.32 33.32 33.32 00.52 00.52 00.52 76.62 76.62 76.62 33.82 33.82 00.03 00.03 00.03 00.03 00.03 05.23 05.23 33.33 33.33号
编
代后 921 98 47 37 351 91 031 17 531 43 67 021 521 54 68 341 01 57 601 69 221 4 52 27 89 421 721 821 15 06

[0023] （二）F1群体的分子标记分析

[0024] （1）用新型广谱植物基因组DNA快速提取试剂盒（HF213）提取亲本及其F1群体各个体的DNA。

[0025] （2）首先用400对SRAP引物对结缕草两亲本材料Z105和Z061的DNA进行多态性分析，有276对引物在两亲本间表现为多态性。SRAP-PCR采用10µL 的反应体系，其中
包括： 50ng模板DNA，10×PCR缓冲液，Mg2+ 1.5mmol·L-1，dNTPs 200µmol·L-1，引物0.2
-1
µmol·L ，Taq DNA聚合酶 0.5 U。SRAP-PCR扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性1min，
37℃退火1min，72℃延伸10sec，5个循环；94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸10sec，
35个循环；循环结束后72℃延伸7min，4℃保存。扩增反应在英国TECHNE公司的TC-412
型PCR仪上进行。扩增产物通过10%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳进行检测，并在胶片观察
灯上进行拍照，记录结果。亲本间有多态性的引物在F1群体中进行分析，获取群体基因型
资料。

[0026] （3）根据CP群体的标记类型，对所获得F1群体的标记进行统计，在标记类型统计的基础上，应用joinmap3.0软件，采用Kosambi作图函数，进行结缕草属植物F1群体遗
传图谱的构建，结果当LOD值等于3.5时，242个标记构成24个连锁群，其中包括43个偏
分离标记，82个标记未能在连锁群上定位，作图位点率为74.23%。24个连锁群中，单个连
锁群的标记数为2-48个，平均为10.08个；图谱总长度为1210.99cM，标记间最大图距为
38.765cM，最小图距为0cM，平均图距为5.00cM，各连锁群长度在3.34-205.17cM之间，最短
和最长的连锁群分别为LG22和LG3。

[0027] （4）基于已构建的分子遗传图谱，应用MAPQTL5.0的区间作图法对各个分子标记的群体基因型资料和与其对应每个F1株系在盐胁迫下的叶片枯黄率进行连锁分析。以连
锁群5%显著水平的LOD值作为检测QTL的阈值（每性状经1000次排列测验确定LOD阈值）。
当各LOD值大于阈值时，就认为该区域存在一个QTL，其位置在LOD值的峰值对应点。以峰
值向下1个LOD值单位的区间作为该QTL的置信区间，检测到的QTL通过MAPChart软件定
位到连锁群上。计算结果定位了叶片枯黄率2个QTL（附图 1），命名为：qLF-1 和qLF-2，
qLF-1 位于第4连锁群的36.28cM处，位于标记Me5Em1-315和Me12Em1-180之间，LOD值
为3.27，贡献率为13.1%，与标记Me5Em1-315的图距为1.0 cM，与标记Me12Em1-180的图距
为0.142cM；qLF-2位于第5连锁群的42.25cM处，LOD值为2.88，贡献率为29.7%，与标记
Me12Em20-220在连锁群上处于同一位置。所检测的2个QTL的位置、邻近标记及效应见表
2和附图1，标记序列见表3。

[0028] 表2 结缕草耐盐性（叶片枯黄率和枝叶修剪干重降低百分率）的QTL定位

[0029]

[0030] 表3 标记引物的序列及扩增片段大小标记 左端引物序列 右端引物序列 片段大小（bp）
Me12Em1 5’-TGAGTCCAAACCGGTAG-3’ 5’-GACTGCGTACGAATTCAA-3’ 180
Me5Em1 5’-TGAGTCCAAACCGGTGC-3’ 5’-GACTGCGTACGAATTCAA-3’ 315
Me12Em20 5’-TGAGTCCAAACCGGTAG-3’ 5’-GACTGCGTACGAATTGGT-3’ 220