本发明是一种提取三叶鬼针草根系分泌物的方法，包括如下步骤：一、三叶鬼针草根系分泌物的收集装置设计；二、三叶鬼针草根系分泌物的提纯方法。本发明的优点：设计简单，时间较短，造价低廉，形成闭合循环系统可多次重复利用；提取根系分泌物含量高，充分利用植物根系的生长阶段；无破坏性，无污染；同时对于其他外来入侵物种的根系分泌物研究也有一定的借鉴意义。
1.一种提取三叶鬼针草根系分泌物的方法，其特征是该方法包括如下步骤：（1）三叶鬼针草根系分泌物收集装置的设计；
（2）三叶鬼针草根系分泌物的提纯方法；所述步骤（1）三叶鬼针草根系分泌物收集装置的设计；具体包括如下步骤，A、实验材料：
1）底部带Teflon塞的玻璃瓶规格10cm×15cm；BT100-1L型蠕动泵连接管路均采用Teflon材料;树脂层析柱的规格为20mm×250mm; 树脂选用AB-8大孔中性吸附树脂；生长介质: 石英砂为白色，无其他杂色，石英砂粒径为0.5-1.0mm，玻璃珠粒径为10 mm，石英砂和玻璃珠的粒径比例为5∶1；
2）实验预培养15天龄的完整三叶鬼针草植株幼苗，茎高15cm，洗净营养土待用；
3）配置Hoagland’s原液5L，用去离子水稀释100倍为实验营养液，实验选用Hoagland’s配方pH=6.0，取各药品的质量浓度分别为：硝酸钙浓度为945mg/L，硝酸钾浓度为506mg/L，硝酸铵浓度为80mg/L，磷酸二氢钾浓度为136mg/L，硫酸镁浓度为493mg/L，七水合硫酸亚铁浓度为3.45mg/L，乙二胺四乙酸二钠浓度为4.66mg/L；
1）将带Teflon塞的玻璃瓶、玻璃树脂层析柱和Teflon材料的连接管路用0.5%质量的盐酸浸泡24h；取出用去离子水冲洗，然后用洁净超纯水润洗12h；放入烘箱烘干；分别将带Teflon塞的玻璃瓶和玻璃树脂层析柱用黑色不透明胶纸把瓶身包裹，使瓶壁和柱壁不透光；
2）石英砂和玻璃珠均用去离子水浸泡24h，放入烘箱烘干待用；
3）AB-8大孔中性吸附树脂，首先，用0.5倍于树脂柱体积的分析纯无水乙醇润洗，然后将润洗后的AB-8大孔中性吸附树脂浸泡于无水乙醇中24h；其次，用2倍体积的无水乙醇冲洗浸泡后的AB-8大孔中性吸附树脂，直至AB-8大孔中性吸附树脂不再流出白色浑浊物为止；再次，用4-6倍体积的重量浓度为5%HCl溶液冲洗AB-8大孔中性吸附树脂，浸泡2h后用去离子水洗至中性；再用2倍体积的重量浓度为2%NaOH溶液冲洗AB-8大孔中性吸附树脂，浸泡2h，最后用去离子水洗至中性；
1）将15天龄的三叶鬼针草幼苗取出40株，放入事先放入玻璃珠的带Teflon塞的玻璃瓶内，用处理过的石英砂固定并包埋，加入稀释100倍的Hoagland’s营养液250mL；
2）用2倍体积的稀释100倍的Hoagland’s营养液冲洗AB-8大孔中性吸附树脂，然后接在带Teflon塞的玻璃瓶下；
3）用Teflon材料的连接管路将AB-8大孔中性吸附树脂与带Teflon塞的玻璃瓶相互连接，形成回路；
4）接入BT100-1L型蠕动泵，设置流速为5mL/min,保持实际滴速为30滴/min，打开各个阀门，打开蠕动泵，营养液开始循环，闭合回路开始工作；
所述步骤（2）三叶鬼针草根系分泌物的提纯方法，具体包括如下步骤：
1）装置运行两天后，关闭阀门和蠕动泵，取下AB-8大孔中性吸附树脂；
2）每根AB-8大孔中性吸附树脂分别用分析纯甲醇溶液作为洗脱液，以2倍AB-8大孔中性吸附树脂体积的甲醇洗脱树脂；
3）平均每柱分析纯甲醇洗脱液为50mL，将洗脱液收集转移入心形瓶中；
4）将心形瓶接入BUCHI旋转蒸发仪上，BUCHI旋转蒸发仪设置的旋蒸气体为甲醇，恒定水温45℃，转速为BUCHI旋转蒸发仪上标注的2档，系统压强200-220mbar；
5）旋转蒸发洗脱液至其不再减少时停止旋蒸，将旋蒸后的洗脱液转移入50mL离心管中，用去离子水冲洗心形瓶；
6）将50mL离心管密封，放入-70℃的低温冰箱中冷冻，约72h后取出；
7）将50mL离心管放入Christ ALPHA 1-2 LD plus冷冻干燥仪中，将固态水分全部抽出，得到粉末状的根系分泌物提取物；
实验得到根系分泌物的数据参考，每管为40个植株2天的根系分泌物收集量：
1号瓶处理前12.5222g，处理后12.5582g，有效质量0.036g；
2号瓶处理前12.1084g，处理后12.1434g，有效质量0.035g。
一种提取三叶鬼针草根系分泌物的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及的是一种提取三叶鬼针草根系分泌物的方法，属于外来入侵物种防治技术领域。
背景技术
[0002] 近几十年来，随着全球变化加剧以及我国对外贸易、旅游和交通的发展，外来植物入侵发生的频度和危害的程度都在迅速增加。这些入侵者严重威胁着生物多样性、经济和环境。我国每年由外来种入侵造成的经济损失超过 70 亿美元。
[0003] 三叶鬼针草( Bidens pilosa L．) 又名一包针、一把针、婆婆针、盲肠草等，为菊科鬼针草属一年生草本植物，原产热带美洲，由于瘦果冠毛芒状具倒刺，可附着于人、物上远距离传播。该草生长速度极快，可以作为家兔饲料加以利用; 其味苦而无毒，具有清热解毒，活血散瘀消肿之功效，可以用于治疗痢疾、腹泻、感冒、炎症等。其有害的一面是入侵性非常强，对农田生产、果园、草坪、环境和生物多样性等造成严重的影响，已广泛分布于我国华东、华中、华南、中南、西南等地。
发明内容
[0004] 本发明提出的是一种提取三叶鬼针草根系分泌物的方法，其目的是提升提取物含量，拓展对外来入侵物种的根系分泌物研究。
[0005] 本发明的技术解决方案：一种提取三叶鬼针草根系分泌物的方法，包括如下步骤：
[0006] 一、三叶鬼针草根系分泌物的收集装置设计；
[0007] 二、三叶鬼针草根系分泌物的提纯方法。
[0008] 本发明的优点：设计简单，时间较短，造价低廉，形成闭合循环系统可多次重复利用；提取根系分泌物含量高，充分利用植物根系的生长阶段；无破坏性，无污染；同时对于其他外来入侵物种的根系分泌物研究也有一定的借鉴意义。
附图说明
[0009] 图1是三叶鬼针草根系分泌物收集流程示意图。
具体实施方式
[0010] 实施例，提取三叶鬼针草根系分泌物的方法，包括如下步骤：
[0011] 一、三叶鬼针草根系分泌物收集装置的设计；
[0012] 二、三叶鬼针草根系分泌物的提纯方法。
[0013] 所述的步骤一，三叶鬼针草根系分泌物收集装置的设计；具体包括如下步骤，[0014] 1、实验材料：
[0015] 1）底部带Teflon塞的玻璃瓶规格10cm×15cm；蠕动泵(BT100-1L)连接管路均采用Teflon材料;树脂层析柱的规格为20mm×250mm; 树脂选用AB-8大孔中性吸附树脂；生长介质: 石英砂为白色，无其他杂色，石英砂粒径为0.5-1.0mm，玻璃珠粒径为10 mm，石英砂和玻璃珠的粒径比例为5∶1；
[0016] 2）实验预培养15天龄的完整三叶鬼针草植株幼苗，茎高15cm，洗净营养土待用；
[0017] 3）配置Hoagland’s原液5L，用去离子水稀释100倍为实验营养液，实验选用Hoagland’s配方pH=6.0，取各药品的质量浓度分别为：
[0018] 硝酸钙浓度为945mg/L，硝酸钾浓度为506mg/L，硝酸铵浓度为80mg/L，磷酸二氢钾浓度为136mg/L，硫酸镁浓度为493mg/L，七水合硫酸亚铁浓度为3.45mg/L，乙二胺四乙酸二钠浓度为4.66mg/L；
[0019] 2、装置预处理：
[0020] 1）将带Teflon塞的玻璃瓶、玻璃树脂层析柱和Teflon材料的连接管路用0.5%质量的盐酸浸泡24h；取出用去离子水冲洗，然后用洁净超纯水润洗12h；放入烘箱烘干；分别将带Teflon塞的玻璃瓶和玻璃树脂层析柱用黑色不透明胶纸把瓶身包裹，使瓶壁和柱壁不透光；
[0021] 2）石英砂和玻璃珠均用去离子水浸泡24h，放入烘箱烘干待用；
[0022] 3）AB-8大孔中性吸附树脂，首先，用0.5倍于树脂柱体积的分析纯无水乙醇润洗，然后将润洗后的AB-8大孔中性吸附树脂浸泡于无水乙醇中24h；其次，用2倍体积的无水乙醇冲洗浸泡后的AB-8大孔中性吸附树脂，直至AB-8大孔中性吸附树脂不再流出白色浑浊物为止；再次，用4-6倍体积的重量浓度为5%HCl溶液冲洗AB-8大孔中性吸附树脂，浸泡2h后用去离子水洗至中性；再用2倍体积的重量浓度为2%NaOH溶液冲洗AB-8大孔中性吸附树脂，浸泡2h，最后用去离子水洗至中性；
[0023] 3、装置组装：
[0024] 1）将15天龄的三叶鬼针草幼苗取出40株，放入事先放入玻璃珠的带Teflon塞的玻璃瓶内，用处理过的石英砂固定并包埋，加入稀释100倍的Hoagland’s营养液250mL；
[0025] 2）用2倍体积的稀释100倍的Hoagland’s营养液冲洗AB-8大孔中性吸附树脂，然后接在带Teflon塞的玻璃瓶下；
[0026] 3）用Teflon材料的连接管路将AB-8大孔中性吸附树脂与带Teflon塞的玻璃瓶相互连接，形成回路；
[0027] 4）接入BT100-1L型蠕动泵，设置流速为5mL/min,保持实际滴速为30滴/min，打开各个阀门，打开蠕动泵，营养液开始循环，闭合回路开始工作。
[0028] 所述的步骤二、三叶鬼针草根系分泌物的提纯方法，具体如下步骤包括，[0029] 1）装置运行两天后，关闭阀门和蠕动泵，取下AB-8大孔中性吸附树脂；
[0030] 2）每根AB-8大孔中性吸附树脂分别用分析纯甲醇溶液作为洗脱液，以2倍AB-8大孔中性吸附树脂体积的甲醇洗脱树脂；
[0031] 3）平均每柱分析纯甲醇洗脱液为50mL，将洗脱液收集转移入心形瓶中；
[0032] 4）将心形瓶接入BUCHI旋转蒸发仪（R210/R215）上，BUCHI旋转蒸发仪（R210/R215）设置的旋蒸气体为甲醇，恒定水温45℃，转速为BUCHI旋转蒸发仪（R210/R215）上标注的2档，系统压强200-220mbar；
[0033] 5）旋转蒸发洗脱液至其不再减少时停止旋蒸，将旋蒸后的洗脱液转移入50mL离心管中，用去离子水冲洗心形瓶；
[0034] 6）将50mL离心管密封，放入-70℃的低温冰箱中冷冻，约72h后取出；
[0035] 7）将50mL离心管放入Christ ALPHA 1-2 LD plus冷冻干燥仪中，将固态水分全部抽出，得到粉末状的根系分泌物提取物；
[0036] 实验得到根系分泌物的数据参考，每管为40个植株2天的根系分泌物收集量：
[0037]瓶号 处理前 处理后 有效质量
1 12.5222g 12.5582g 0.036g
2 12.1084g 12.1434g 0.035g
