抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11在黄曲霉毒素B1荧光淬灭中的应用及方法转让专利
申请号 : CN201210501565.9
文献号 : CN103116024B
文献日 : 2014-04-09
发明人 : 李培武 , 李鑫 , 张奇 , 丁小霞 , 张文 , 张兆威 , 李冉
申请人 : 中国农业科学院油料作物研究所
摘要 :
权利要求 :
1.抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11在黄曲霉毒素B1荧光淬灭中的应用,其特征在于:它是在含有黄曲霉毒素B1的样品溶液中加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11,使黄曲霉毒素B1荧光淬灭,其中:所述的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11由保藏号为CCTCC NO. C201013的杂交瘤细胞株1C11分泌产生。
2.根据权利要求1所述的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11在黄曲霉毒素B1荧光淬灭中的应用,其特征在于:所述为使黄曲霉毒素B1的荧光进行充分淬灭,在黄曲霉毒素B1的样品溶液中加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11后先混匀,然后于37±5℃放置至少
0.5h。
3.根据权利要求2所述的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11在黄曲霉毒素B1荧光淬灭中的应用,其特征在于:还包括根据以下方法测定荧光淬灭率:将含有黄曲霉毒素B1的样品溶液中在未加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11前,先于365nm激发波长激发下获取其荧光发射光谱,记录440nm处的荧光强度值;然后再加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11进行淬灭后,再于365nm激发波长激发下获取其荧光发射光谱,记录440nm处的荧光强度值,根据以下公式计算荧光淬灭率:荧光淬灭率为荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11淬灭强度值即加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11淬灭前后的440nm处的两个荧光强度的差值/加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11淬灭前的荧光强度值。
4.根据权利要求2所述的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11在黄曲霉毒素B1荧光淬灭中的应用,其特征在于:在含有黄曲霉毒素B1的样品中加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11时,使抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11的浓度达到使体系中黄曲霉毒素B1的荧光充分淬灭的最小浓度,以使样品中黄曲霉毒素B1的荧光进行充分淬灭。
5.根据权利要求4所述的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11在黄曲霉毒素B1荧光淬灭中的应用,其特征在于:所述使体系中黄曲霉毒素B1的荧光充分淬灭的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11最小浓度是根据如下方法获得:将含有黄曲霉毒素B1的样品在未加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11前,先于365nm激发波长激发下获取其荧光发射光谱,记录440nm处的荧光强度值;然后在上述黄曲霉毒素B1标准品溶液中加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11,获得不同浓度抗黄曲霉毒毒通用单克隆抗体的体系,采用如上条件进行荧光淬灭,将淬灭后的荧光强度值与初始荧光强度值相比,获得不同浓度抗黄曲霉毒素通用单克抗体时的荧光淬灭率,通过比较其荧光淬灭率,在抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11为某一浓度时,随着该浓度的增加,体系中黄曲霉毒素B1的荧光淬灭率也不随之增加,则该浓度即为使体系中黄曲霉毒素B1的荧光充分淬灭的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11最小浓度。
说明书 :
抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11在黄曲霉毒素B1荧光
淬灭中的应用及方法
技术领域
B1、B2、G1、G2和M1最为常见。黄曲霉毒素能对人及动物的肝脏组织产生破坏作用,严重时
可导致肝癌甚至死亡。黄曲霉毒素被世界卫生组织划定为Ⅰ类致癌物,以黄曲霉毒素B1毒
性最强,其毒性是砒霜的68倍。
米、无花果、果仁及谷物都有可能受黄曲霉毒素污染。由于我国小农户分散型的种植模式,
农产品从农田到餐桌的各个环节都有可能受到黄曲霉毒素的污染。而黄曲霉毒素毒性大,
危害严重,
离子、重金属离子、硝基化合物、重氮化合物等。而考虑到黄曲霉毒素B1自身具有较强的荧
光特性,容易对标记材料的荧光产生干扰,因此,一直没有黄曲霉毒素B1的基于标记材料
荧光淬灭特性的免疫分析技术研究报道。
发明内容
荧光淬灭,方法简单、可靠。
1C11分泌产生。该杂交瘤细胞株已于2010年7月13日保藏于中国典型培养物保藏中心
(CCTCC),保藏地址是,中国,武汉,武汉大学,保藏编号为CCTCC NO. C201013。
1C11,使黄曲霉毒素B1荧光淬灭。
0.5h。
荧光发射光谱,记录440nm处(荧光发射光谱中荧光强度最大处对应的波长)的荧光强度值;
然后再加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11进行淬灭后,再于365nm激发波长激发下获
取其荧光发射光谱,记录440nm处(荧光发射光谱中荧光强度最大处对应的波长)的荧光强
度值,根据以下公式计算荧光淬灭率:
霉毒素通用单克隆抗体1C11淬灭前的荧光强度值。
素B1的荧光充分淬灭的最小浓度,以使样品中黄曲霉毒素B1的荧光进行充分淬灭。
浓度时,随着该浓度的增加,体系中黄曲霉毒素B1的荧光淬灭率也不随之增加,该浓度即
为使体系中黄曲霉毒素B1的荧光充分淬灭的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11最小浓
度。具体获得方法如下:将含有黄曲霉毒素B1的样品在未加入抗黄曲霉毒素通用单克隆
抗体1C11前,先于365nm激发波长激发下获取其荧光发射光谱,记录440nm处(荧光发射光
谱中荧光强度最大处对应的波长)的荧光强度值;然后在上述黄曲霉毒素B1标准品溶液中
加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11,获得不同浓度抗黄曲霉毒毒通用单克隆抗体的体
系,采用如上条件进行荧光淬灭,将淬灭后的荧光强度值与初始荧光强度值相比,获得不同
浓度抗黄曲霉毒素B1抗体时的荧光淬灭率,通过比较其荧光淬灭率,在抗黄曲霉毒素通用
单克隆抗体1C11为某一浓度时,随着该浓度的增加,体系中黄曲霉毒素B1的荧光淬灭率也
不随之增加,则该浓度即为使体系中黄曲霉毒素B1的荧光充分淬灭的抗黄曲霉毒素通用
单克隆抗体1C11最小浓度。
素通用单克隆抗体1C11反应后再受到紫外光(365nm)激发时,黄曲霉毒素B1的荧光则可
绝大部分被淬灭。
隆抗体1C11对黄曲霉毒素B1荧光进行淬灭的特性可对农产品中黄曲霉毒素B1含量进行
快速检测等。
附图说明
素B1标准品溶液的荧光强度,右列为加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11反应淬灭后
的荧光强度。
预先制得,具体制备方法如下:
为:用双层滤纸过滤小鼠腹水,4℃,12000r/min离心15min,吸取上清,将所得腹水上清与4
倍体积的醋酸盐缓冲液混合,搅拌下缓慢加入正辛酸,每毫升腹水所需的正辛酸体积为33
μL,室温混合30min,4℃静置2h,然后4℃,12000r/min离心30min,弃沉淀,将得到的上清
液用双层滤纸过滤后,加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.1mol/L 和pH值为7.4的磷酸盐
缓冲液,用2 mol/L的氢氧化钠溶液调节该混合液的pH值至7.4,4 ℃预冷,缓慢加入硫酸
铵至硫酸铵终浓度为0.277g/mL,4℃静置2h,然后4℃,12000r/min离心30min,弃上清,将
所得沉淀用原腹水体积1/10的0.01mol/L磷酸盐缓冲液重悬,装入透析袋,对纯水透析,将
充分透析好的蛋白溶液置-70℃冰箱冷冻,之后用冷冻干燥机冻干,收集冻干粉,即得纯化
好的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11,将抗体置-20℃冰箱中备用;
酸二氢钾0.02g,加水定容至100mL所得。
素通用单克隆抗体1C11,混匀,然后于37±5℃放置1h,使黄曲霉毒素B1荧光淬灭,然后在
365nm激发波长激发下获得其荧光发射光谱,记录440nm处的荧光强度值,计算荧光淬灭
率,荧光淬灭率=荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11淬灭强度值即加入抗黄曲霉毒
素通用单克隆抗体1C11淬灭前后的440nm处的两个荧光强度的差值/加入抗黄曲霉毒素
通用单克隆抗体1C11淬灭前的荧光强度值。
霉毒素通用单克隆抗体1C11浓度为0.1ng/mL时,黄曲霉毒素B1的荧光淬灭率31%;抗黄
曲霉毒素通用单克隆抗体1C11浓度为0.5 ng/mL时,淬灭率为37%;抗黄曲霉毒素通用单
克隆抗体1C11浓度为5ng/mL时,淬灭率为49%;抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11浓度
为10ng/mL时,淬灭率为78%;抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11浓度为20ng/mL时,淬
灭率均为91%,且体系中抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体含量继续增加时至抗体浓度为30或
40ng/mL时,淬灭率仍为91%。
0.5、0.3、0.1和0 ng/mL),所述的磷酸盐缓冲液配方如下:0.8g氯化钠,0.29g十二水磷酸
氢二钠,0.02g氯化钾,0.02g磷酸二氢钾,加水定容至1000mL。取各系列浓度的黄曲霉毒素
B1标准品溶液2mL在365nm激发波长下激发,获取各系列浓度的黄曲霉毒素B1标准品溶液
的荧光发射光谱,记录波长440nm处的荧光强度值,见图1。然后在各浓度的黄曲霉毒素B1
标准品溶液中加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11,使各体系中抗黄曲霉毒素通用单克
隆抗体1C11的终浓度均为20 μg/mL,混匀,放置1h,取各体系溶液2mL,在365nm激发波长
下激发,获取各系体系的荧光发射光谱,取最大波长440nm处的荧光强度值,见图1。
0.75、0.5、0.3、0.1和0 ng/mL),所述的磷酸盐缓冲液配方如下:0.8g氯化钠,0.29g十二水
磷酸氢二钠,0.02g氯化钾,0.02g磷酸二氢钾,加水定容至1000mL。取各系列浓度的黄曲霉
毒素B1标准品溶液2mL在365nm激发波长下激发,获取各系列浓度的黄曲霉毒素B1标准
品溶液的荧光发射光谱,记录波长440nm处的荧光强度值,见图1。
黄曲霉毒素B1抗体的浓度分别为0.1,0.5 ,5,10, 20,30,40ng/mL),采用如上条件进行荧
光淬灭,将荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11淬灭强度值与加入抗黄曲霉毒素通
用单克隆抗体1C11淬灭前的荧光强度值相比,获得不同浓度的抗黄曲霉毒素通用单克隆
抗体1C11的荧光淬灭率。具体结果:抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11浓度为0.1ng/mL
时,黄曲霉毒素B1的荧光淬灭率31%;抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11浓度为0.5 ng/
mL时,淬灭率为37%;抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11浓度为5ng/mL时,淬灭率为49%;
抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11浓度为10ng/mL时,淬灭率为78%;抗黄曲霉毒素通用
单克隆抗体1C11浓度为20ng/mL时,淬灭率均为91%,且体系中抗黄曲霉毒素通用单克隆抗
体含量继续增加时至抗体浓度为30或40ng/mL时,淬灭率仍为91%,说明体系中抗黄曲霉毒
素通用单克隆抗体1C11浓度为20ng/mL时,即可使黄曲霉毒素B1的荧光充分淬灭。故结
合成本,选用下述体系中抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11的浓度为20ng/mL。
述抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11由保藏号为CCTCC NO:C201013的杂交瘤细胞株1C11
产生,混匀,放置1h,取各体系溶液2mL,在365nm激发波长下激发,获取各系体系的荧光发
射光谱,取最大波长440nm处的荧光强度值,见图1。
6
黄曲霉毒素B1浓度的关系曲线c1(x1,y1),曲线方程为:y1=10x1+8859,其中:x1黄曲霉毒
素B1浓度,0.1-1ng/mL,y1为荧光被抗黄曲霉毒素B1抗体1C11淬灭强度即加入抗黄曲霉
毒素B1抗体1C11前后的440nm处荧光强度的差值,见图2,和得到大浓度时荧光被抗黄曲
霉毒素通用单克隆抗体1C11淬灭强度与黄曲霉毒素B1浓度的关系曲线c2(x2,y2),曲线
6
方程为:y2=71535x2+10,其中:x2黄曲霉毒素B1浓度,1-10ng/mL,y2为荧光被抗黄曲霉毒
素B1抗体1C11淬灭强度即加入抗黄曲霉毒素B1抗体1C11前后的440nm处荧光强度的差
值,见图3。
积浓度为80%的甲醇水(含质量分数为4%的氯化钠),在50~60℃水浴下超声10分钟,定
量滤纸过滤,取滤液4mL 加入2mL石油醚,涡旋1分钟,静置分层,取下层甲醇水3mL,加入9
mL水,混匀,将该稀释的样品提取液用孔径为0.45μm的混合滤膜过滤,取10mL滤液流过黄
曲霉毒素B1免疫亲和柱,用1mL甲醇洗脱亲和柱,收集甲醇洗脱液,在60℃下用氮气吹干,
再用2mL上述稀释液将黄曲霉毒素悬起,即为样品溶液,扫描样品溶液在365nm激发波长激
发下的荧光发射光谱,再向样品溶液中加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11至抗黄曲
霉毒素通用单克隆抗体1C11终浓度为20μg/mL,混匀,放置1小时后,在365nm激发波长激
发下获得其荧光发射光谱,记录440nm处的荧光强度值。
前后的440nm处荧光强度的差值代入大浓度时荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11
淬灭强度与黄曲霉毒素B1浓度的关系曲线c2(x2,y2)(如图2-2)中,得到样品溶液中的黄
曲霉毒素B1浓度,再结合样品处理过程中的稀释情况,根据样品处理过程中浓度的变化关
系计算出实际花生样品中的黄曲霉毒素B1的添加浓度为9.4 ng/g。
加入2mL石油醚,涡旋1分钟,静置分层,取下层甲醇水3mL,加入9mL水,混匀,将该稀释的
样品提取液用孔径为0.45μm的混合滤膜过滤,取10mL滤液流过黄曲霉毒素B1的免疫亲
合柱,用1mL甲醇洗脱亲和柱,收集甲醇洗脱液,在60℃下用氮气吹干,再用2mL上述稀释液
将黄曲霉毒素悬起,即为样品溶液,扫描样品溶液在365nm激发波长激发下的荧光发射光
谱,记录440nm处的荧光强度值,再向样品溶液中加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11,
至抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11终浓度为20μg/mL,混匀,放置1小时后,在365nm激
发波长激发下获得其荧光发射光谱,记录440nm处的荧光强度值。
光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体淬灭强度与黄曲霉毒素B1浓度的关系曲线c1(x1,y1)
或大浓度时荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体淬灭强度与黄曲霉毒素B1浓度的关系曲
线c2(x2,y2),得到样品溶液中的黄曲霉毒素B1浓度,再结合样品处理过程中的稀释情况,
根据样品处理过程中浓度的变化关系计算出花生样品中的黄曲霉毒素B1的浓度,得到花
生样品1的待测溶液中黄曲霉毒素B1浓度为检出限0.1ng/mL以下,即样品1#中黄曲霉
毒素B1含量为未检出;花生样品2的待测溶液中黄曲霉毒素B1浓度为0.6ng/mL,即样品
2#中黄曲霉毒素B1含量为2.16μg/kg;花生样品3的待测溶液中黄曲霉毒素B1浓度为
3.2ng/m L,即样品3#中黄曲霉毒素B1含量为11.52μg/kg。同时采用国家标准方法GB/
T 18979-2003检测上述花生样品1#,2#或3#,其检测结果依次为:花生样品1#中黄曲霉毒
素B1未检出,花生样品2#中黄曲霉毒素B1含量为2.3μg/kg,花生样品3#中黄曲霉毒素
B1含量为12.2μg/kg。结合上述检测可看出:上述两种检测方法的检测结果相对相差均在
10%以内。