一种水蛭肽和制备方法及其应用

摘要

本发明提供一种水蛭肽和制备方法及其应用，属于多肽及其制备领域。本发明重组水蛭素在大鼠体内的代谢过程中发现，其在大鼠体尿中的代谢产物具有更强的抗凝血酶活性。经过提取、分离和结构与鉴定，发现这种代谢产物为一组重组水蛭素C端去掉17-12个氨基酸的N端保留的水蛭肽，即水蛭肽rH1-51，水蛭肽rH1-52及其两者的混合物。制备方法主要为大鼠静脉给药，收集尿液，采用凝胶色谱（GF-HPLC）并结合反相高效液相色谱（RP-HPLC）提取纯化，即得。本发明提供的水蛭肽免疫原性将显著的降低，有望成为新一代抗血栓新药，具有良好的发展前景和临床应用价值。

权利要求

1-51

1.一种水蛭肽，其特征在于：水蛭肽rH ，其序列如序列表中SEQ ID No.1所示或水

1-52

蛭肽rH ，其序列如序列表中SEQ ID No.2所示。

1-51 1-52

2.一种水蛭肽的混合物，其特征在于：该混合物为水蛭肽rH 和水蛭肽rH 两者的

1-51 1-52

混合物；水蛭肽rH ，其序列如序列表中SEQ ID No.1所示；水蛭肽rH ，其序列如序列表中SEQ ID No.2所示。

1-51

3.如权利要求1所述的水蛭肽，其特征在于：水蛭肽rH 由51个氨基酸组成，其序列如序列表中SEQ ID No.1所示。

1-52

4.如权利要求1所述的水蛭肽，其特征在于：水蛭肽rH 由52个氨基酸组成，其序列如序列表中SEQ ID No.2所示。

5.权利要求1所述的水蛭肽在制备抗血栓药物中的应用。

6.权利要求2所述的水蛭肽混合物在制备抗血栓药物中的应用。

说明书

一种水蛭肽和制备方法及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于多肽及其制备领域，特别涉及一种水蛭肽和制备方法

背景技术

[0002] 世界卫生组织统计年鉴指出，心血管疾病﹑恶性肿瘤﹑呼吸器官疾病﹑车祸和自杀依次分别是目前世界上的五大死因。我国心血管疾病年死亡人数达百万人，随着人们生活水平的提高，心血管疾病将日趋严重。

[0003] 冠心病是心血管疾病的重要类型，其发病机制与动静脉血栓形成及血栓栓塞有关，主要是由于血脂代谢异常，引起血管内膜的炎性免疫反应和血小板聚集，在动脉内一些类似粥样的脂类物质堆积而成白色斑块，血管狭窄到一定程度，血栓形成，称为动脉粥样硬化病变。这些斑块渐渐增多造成动脉腔狭窄，使冠心病是世界上最常见的、致死率最高的慢性疾病之一。

[0004] 随着我国社会经济的快速发展、生活方式的改变以及人口老龄化,冠心病的发病率呈逐年增长的趋势。世界卫生组织预测我国每年有超过100万人死于冠心病。冠心病将严重威胁人民生命和健康,并为社会和家庭带来沉重的经济负担。为此,加强开展以冠心病为代表的心血管疾病的药物开发，具有较高的社会价值。

[0005] 目前，多肽类药物水蛭素是较为常用的天然的凝血酶特异性抑制剂，分为水蛭素（Hirudin,H)及重组水蛭素(recombine Hirudin,rH)，其含有65-66个氨基酸，具有良好的抗凝、抗动静脉血栓作用以及毒副作用低等特点，已经引起国内外各大厂商的高度重视。但是肽类药物临床应用的副作用，主要是免疫原性。也就是说，肽类药物的分子量愈大其免疫原性越大。分子量越小其免疫原性越小，由于水蛭素及重组水蛭素其分子量较大，具有半抗原性，影响其在临床的使用。因此，临床使用中需要抗原反应低，抗血栓作用明显的多肽类药物。

发明内容

[0006] 本发明的目的是提供一种水蛭肽和制备方法，该水蛭肽为一组抗凝血酶活性物质，其为重组水蛭素(recombine Hirudin,rH)在大鼠尿中的代谢产物，即为rH1-51或rH1-52或两者的混合物，本发明不仅保留了重组水蛭素的抗凝血酶的活性，而且由于分子量（5000D左右）较重组水蛭素（7000D）小，免疫原性明显降低，减少不良反应的发生。

[0007] 本发明的水蛭肽rH1-51序列见序列表SEQ ID No.1；

[0008] 本发明的水蛭肽rH1-52序列见序列表SEQ ID No.2；

[0009] 本发明的水蛭肽为水蛭肽rH1-51和水蛭肽rH1-52两者的混合物。

[0010] 重组水蛭素(rH)的原型结构如下：

[0011]

[0012] 本发明的制备方法如下：

[0013] （1）大鼠尾静脉注射重组水蛭素，注射剂量为6mg/kg，收集给药后0.5-4h的尿液，以供分离提取代谢产物；

[0014] （2）用凝胶色谱法对空白和样品尿液进行初步分离，色谱条件：凝胶柱流动相：0.02mol/l的PBS溶液，pH7.0，流速0.5-1.0ml/分钟，检测波长为215nm。收集流出液，每分钟收集1管。取收集液，-70℃冷冻，冷冻干燥保存；

[0015] （3）将凝胶色谱收集到的收集液进行再用C8反相色谱法纯化，色谱条件为：八烷基硅烷键合硅胶柱，进样量20μl，梯度洗脱，乙腈：0.1%TFA25min内从15：85变至45：55，流速0.5ml/min，检测波长为215nm。反复进样，收集2个水蛭肽rH1-51和rH1-52及其混合物，-70℃冷冻，冷冻干燥保存；

[0016] （4）水蛭肽rH1-51的的序列见序列表SEQ ID No.1，rH1-52的序列见序列表SEQ ID No.2；

[0017] 本发明中的重组水蛭素为N端结构为[Ile1,Thr2]-63-脱硫酸基的重组水蛭素，由大连高新生物制药有限公司提供。

[0018] 在对N端结构为[Ile1,Thr2]-63-脱硫酸基的重组水蛭素进行大鼠体内代谢研究发现，其代谢产物仍然具有水蛭素样的抗凝血酶活性，我们对其进行提取分离和结构分析，确认其为一组从重组水蛭素C端去掉14-15个氨基酸的小肽，具有抗凝酶活性，小肽的分子量为5160D，氨基酸序列为重组水蛭素氨基酸1-51处及1-52处。

[0019] 本发明的主要特点是通过降低水蛭素的分子量，进而降低水蛭素的免疫原性，并保持水蛭素的抗凝血酶活性不变。本发明的水蛭肽分子量（5000D左右）较水蛭素（7000D）小，因而免疫原性将显著的降低，有望成为新一代抗血栓新药，具有良好的发展前景和临床应用价值。显示出作为制备的药物的应用前景。

[0020] 以下实施例子进一步解释本发明的内容，但并不用以限制本发明。

[0021] 实施例1（1）大鼠100只，尾静脉注射重组水蛭素，注射剂量为6mg/kg。收集给药后4h的尿液，以供分离提取代谢产物；

[0022] （2）用凝胶色谱法对空白和样品尿液进行初步分离。色谱条件：凝胶柱，TSK-GELG2000SW 7.5mm×30.0cm，进样量为20μl，流动相：0.02mol/l的PBS溶液，pH7.0，流速0.5ml/min，检测波长为215nm。收集流出液，每分钟收集1管。取16，17，20，21，22，23min的收集液，-70℃冷冻，隔日用冷冻干燥器进行冷冻干燥，备用；

[0023] （3）将凝胶色谱收集到的16-23min的收集液进行再用C8反相色谱法次分离。色谱条件：C8柱，进样量20μl，梯度洗脱，乙腈：0.1%TFA 25min内从15：85变至45：55，流速0.5ml/min，检测波长为215nm。反复进样，收集14，15分钟的峰，-70℃冷冻，隔日用冷冻干燥器进行冷冻干燥，得到水蛭肽rH1-51为4mg和rH1-52为13mg及两者的混合物7mg。

[0024] 实施例2

[0025] （1）大鼠100只，尾静脉注射重组水蛭素，注射剂量为6mg/kg。收集给药后0.5h的尿液，以供分离提取代谢产物；

[0026] （2）用凝胶色谱法对空白和样品尿液进行初步分离。色谱条件：凝胶柱，TSK-GELG2000SW 7.5mm×30.0cm，进样量为20μl，流动相：0.02mol/l的PBS溶液，pH7.0，流速0.8ml/min，检测波长为215nm。收集流出液，每分钟收集1管。取16，17，20，21 min的收集液，-70℃冷冻，隔日用冷冻干燥器进行冷冻干燥，备用；

[0027] （3）将凝胶色谱收集到的16-21min的收集液进行再用C8反相色谱法次分离。色谱条件：C8柱，进样量20μl，梯度洗脱，乙腈：0.1%TFA 25min内从15：85变至45：55，流速0.5ml/min，检测波长为215nm。反复进样，收集14，15分钟的峰，-70℃冷冻，隔日用冷冻干
1-51 1-52
燥器进行冷冻干燥，得到水蛭肽rH 为3mg和rH 为11mg及两者的混合物6mg。

[0028] 实施例3

[0029] 分子量的测定

[0030] 将上述水蛭肽rH1-51和rH1-52，将提取的代谢产物，经飞行时间质谱（MALDI-TOF/TOF）测定其分子量。检测条件：N2激光源，波长337nm；检测方式：正离子，线性方式（飞行1-51 1-52
管长1.5m，加速电压20kV）；基质：CCA，水蛭肽rH 和rH 经飞行时间质谱测定分子量均为5162。

[0031] 实施例4

[0032] 抗凝血酶活性的测定

[0033] 本法是以甲苯磺酰基-氨基乙酰基-脯氨酰基-精氨酰-对-硝基苯胺（Tosyl-glycyl-polyl-arginine-para-nitraniline；商品名：Chromozym TH）为底物，凝血酶能水解Chromozym TH释放出对-硝基苯胺（para-nitraniline，pNA），pNA在405nm处有特异性吸收。rH能与凝血酶定量的结合，使凝血酶失去水解底物的活性，通过测定反应体系中未被rH抑制的凝血酶的量，间接测定rH的含量。本实验以rH为标准品制备标准曲线，测定出1-51 1-52
rH 和rH 抗凝血酶的活性。

[0034] 1、标准曲线的制备

[0035] 重组水蛭素为凝血酶的特异性抑制剂，凝血酶能水解生色底物（Chromozym TH，CT），释放出对硝基苯胺，对硝基苯胺在405nm波长处有吸收，在一定的范围内，凝血酶的量与释放出的对硝基苯胺的量成正比。而重组水蛭素能与凝血酶按1：1的分子比相结合，当定量过量的凝血酶与重组水蛭素反应后，通过测定剩余的凝血酶的量，即可测定出抗凝血酶的活性物质的量。表1为重组水蛭素的浓度与对应的OD值；对应的标准曲线为2
y=-0.0054x+0.4456，R=0.974。

[0036] 表1、标准品（重组水蛭素）的浓度与吸光度值（OD）（n=5）

[0037]

[0038] 2、水蛭肽rH1-51和rH1-52抗凝血酶活性的测定

[0039] 将冷冻干燥后的水蛭肽rH1-51和rH1-52溶解后测定其抗凝血酶活性，结果见表2，3。

[0040] 表2、水蛭肽rH1-51抗凝血酶活性的测定

[0041]1-52

[0042] 表3、水蛭肽rH 抗凝血酶活性的测定

[0043]

[0044] 抗凝血酶的活性与吸光度（OD值）成反比，实验结果表明水蛭肽rH1-51和rH1-52有较高的抗凝血酶的活性。

[0045] 实施例4

[0046] 抗血栓作用

[0047] 1、方法

[0048] 雄性大鼠40只，随机分为7组，即正常对照组、rH组、水蛭肽rH1-51组、水蛭肽rH1-52组和肝素钠组，每组10只。将大鼠腹腔注射乌拉坦1g/kg，剖腹分离下腔静脉，于左肾静脉下方置一条线备结扎血管用，自尾静脉注射不同的受试药物，正常对照组注射0.9%生理氯化钠注射液。5min结扎下腔静脉造成淤血，然后关闭腹腔，6h后再次打开腹腔，与结扎下方2.0cm处夹闭血管，纵行剖开取出血栓，60℃干燥4h后称血栓重，记录有无血栓形成及血栓干重。以正常对照组为基准计算各组血栓形成比率以及血栓干重抑制率。

[0049] 2、结果

[0050] 各组大鼠静脉注射不同样品后，下腔静脉血栓形成及干重结果见表4.[0051] 表4 不同样品对大鼠下腔静脉血栓形成的影响

[0052]1-51 1-52

[0053] 由表4可见，相同剂量的水蛭肽rH 或rH 或其混合物与重组水蛭素（rH）相比，小分子量的水蛭肽抗血栓作用的效果更强。