一种抗肿瘤活性的新化合物及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种抗肿瘤活性的新化合物及其制备方法和应用。本发明还提供了式(I)所示化合物。本发明还提供了生产式(I)所示化合物的菌株N153，它的保藏编号为CGMCC No.5380。本发明还提供了用菌株N153制备式(I)所示化合物的方法以及式(I)所示化合物在抑制肿瘤细胞中的应用。本发明对研究与开发新的抗肿瘤药物提供了候选化合物，也为开发利用微生物来源的天然活性物质提供了科学依据。式(I)。

权利要求

1.式(I)所示化合物；

2.一种制备权利要求1所述化合物的方法，是发酵保藏编号为CGMCC No.5380的菌株N153，得到权利要求1所述化合物。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述方法还包括将发酵所述菌株N153得到的发酵物用有机溶剂进行浸提的步骤。

4.权利要求1所述化合物在制备药物中的应用；所述药物为抑制肿瘤细胞增殖和/或治疗癌症的药物；所述肿瘤细胞为MCF-7细胞；所述癌症为MCF-7细胞引起的乳腺癌。

5.一种药物，它的活性成分为权利要求1所述化合物；所述药物为抑制肿瘤细胞增殖和/或治疗癌症的药物；所述肿瘤细胞为MCF-7细胞；所述癌症为MCF-7细胞引起的乳腺癌。

说明书

一种抗肿瘤活性的新化合物及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种具有抗肿瘤活性的新化合物及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 恶性肿瘤是目前严重危害人类生命和生活质量的主要疾病之一。世界卫生组织的一项研究报告表明，乳腺癌是女性患病率最高的癌症，占所有癌症中的16％。据估计，在2004年，有519，000位女性因乳腺癌而去世。乳腺癌的发病率高达99.4/10万，且发病率仍呈上升趋势。

[0003] 在恶性肿瘤的治疗中，药物治疗占有重要的地位。在合成化学类抗肿瘤药物中绝大多数都以天然抗肿瘤活性成分为先导化合物，以天然产物为来源的抗肿瘤药物具有活性显著、结构独特、作用机制不同于一般的小分子化学治疗药物的优势。据报道，临床使用的抗癌药物中超过60％来源于天然，包括植物、海洋生物、微生物。在2003年销售最好的20种抗肿瘤药物中，天然产物及其衍生物占37％，如紫杉醇，多西他赛，羟基喜树碱等，由此可见，天然产物是结构新颖和作用独特的抗肿瘤化合物的重要来源。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种抗肿瘤活性的新化合物及其制备方法和应用。

[0005] 本发明提供的抗肿瘤活性的新化合物为式(I)所示化合物；

[0006] 式(I)。

[0007] 本发明还保护一种菌株，名称为菌株N153，属于并盾壳孢属(Paraconiothyrium brasiliense)，已于2011年10月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCCNo.5380。

[0008] 所述菌株N153在生产式(I)所示化合物中的应用也属于本发明的保护范围[0009] 本发明还保护一种制备式(I)所示化合物的方法，是发酵所述菌株N153，得到式(I)所示化合物。

[0010] 所述方法还包括将发酵所述菌株N153得到的发酵物用有机溶剂进行浸提的步骤。所述有机溶剂具体可为乙酸乙酯。

[0011] 所述浸提的方法具体如下：将所述发酵物用乙酸乙酯室温浸提3-5天(具体可为4天)。所述浸提过程中，可以每24小时更换新的乙酸乙酯，最后合并提取液上清。

[0012] 所述发酵具体可采用如下培养基：将80g大米在120mL水中浸泡过夜，得到培养基。所述发酵的条件具体可为25℃、40天(无菌培养)。

[0013] 所述方法还包括将所述浸提的产物依次进行减压硅胶柱层析分离、凝胶色谱分离和反相HPLC分离的步骤。

[0014] 所述减压硅胶柱层析分离的具体参数如下：

[0015] 柱子型号为：8×30cm；

[0016] 填充物为：薄层层析硅胶H；

[0017] 洗脱过程为：依次用1000mL洗脱液A(由9体积份石油醚和1体积份乙酸乙酯组成)、1000mL洗脱液B(由4体积份石油醚和1体积份乙酸乙酯组成)和1000mL洗脱液C(由7体积份石油醚和3体积份乙酸乙酯组成)进行洗脱，流速为50mL/min，收集洗脱液C的过柱后洗脱液。

[0018] 所述凝胶色谱分离的参数具体如下：

[0019] 柱子型号为：3×60cm；

[0020] 填充物为：Sephadex LH-20；

[0021] 流动相为1体积份二氯甲烷和1体积份甲醇的混合物，流速为0.5mL/min；

[0022] 收集保留体积为80-100mL的过柱后洗脱液。

[0023] 所述反相HPLC分离的参数具体如下：

[0024] 柱子型号为：Kramosil C18柱(10μm；10×250mm)；

[0025] 洗脱过程为：用体积百分含量为72％的甲醇水溶液洗脱30min，流速为2mL/min。

[0026] 收集保留时间为18.9-20.2min的过柱后洗脱液。

[0027] 本发明还保护一种抑制肿瘤细胞增殖和/或治疗癌症的活性成分，其制备方法包括如下步骤：

[0028] (1)发酵所述菌株N153，得到发酵物；

[0029] (2)将所述发酵物用有机溶剂进行浸提，得到所述活性成分。

[0030] 所述有机溶剂具体可为乙酸乙酯。

[0031] 所述浸提的方法具体如下：将所述发酵物用乙酸乙酯室温浸提3-5天(具体可为4天)。所述浸提过程中，可以每24小时更换新的乙酸乙酯，最后合并提取液上清。

[0032] 所述发酵具体可采用如下培养基：将80g大米在120mL水中浸泡过夜，得到培养基。所述发酵的条件具体可为25℃、40天(无菌培养)。

[0033] 所述方法还包括将所述浸提的产物依次进行减压硅胶柱层析分离、凝胶色谱分离和反相HPLC分离的步骤。

[0034] 所述方法还包括将所述浸提的产物依次进行减压硅胶柱层析分离、凝胶色谱分离和反相HPLC分离的步骤。

[0035] 所述减压硅胶柱层析分离的具体参数如下：

[0036] 柱子型号为：8×30cm；

[0037] 填充物为：薄层层析硅胶H；

[0038] 洗脱过程为：依次用1000mL洗脱液A(由9体积份石油醚和1体积份乙酸乙酯组成)、1000mL洗脱液B(由4体积份石油醚和1体积份乙酸乙酯组成)和1000mL洗脱液C(由7体积份石油醚和3体积份乙酸乙酯组成)进行洗脱，流速为50mL/min，收集洗脱液C的过柱后洗脱液。

[0039] 所述凝胶色谱分离的参数具体如下：

[0040] 柱子型号为：3×60cm；

[0041] 填充物为：Sephadex LH-20；

[0042] 流动相为1体积份二氯甲烷和1体积份甲醇的混合物，流速为0.5mL/min；

[0043] 收集保留体积为80-100mL的过柱后洗脱液。

[0044] 所述反相HPLC分离的参数具体如下：

[0045] 柱子型号为：Kramosil C18柱(10μm；10×250mm)；

[0046] 洗脱过程为：用体积百分含量为72％的甲醇水溶液洗脱30min，流速为2mL/min。

[0047] 收集保留时间为18.9-20.2min的过柱后洗脱液。

[0048] 所述肿瘤细胞为乳腺癌细胞，优选为MCF-7细胞。所述癌症为乳腺癌，优选为MCF-7细胞引起的乳腺癌。

[0049] 所述菌株N153、式(I)所示化合物或所述活性成分均可用于制备药物；所述药物为抑制肿瘤细胞增殖和/或治疗癌症的药物。所述肿瘤细胞为乳腺癌细胞，优选为MCF-7细胞。所述癌症为乳腺癌，优选为MCF-7细胞引起的乳腺癌。

[0050] 本发明还保护一种药物，它的活性成分为式(I)所示化合物或所述活性成分；所述药物为抑制肿瘤细胞增殖和/或治疗癌症的药物。所述肿瘤细胞为乳腺癌细胞，优选为MCF-7细胞。所述癌症为乳腺癌，优选为MCF-7细胞引起的乳腺癌。

[0051] 本发明提供了一株新菌株、一个新的化合物、用该新菌株制备该新化合物的方法以及该新化合物在抑制肿瘤细胞中的应用。本发明对研究与开发新的抗肿瘤(乳腺癌)药物提供了候选化合物，也为开发利用微生物来源的天然活性物质提供了科学依据。

附图说明

[0052] 图1为式(I)所示化合物的HMQC二维核磁共振图谱。

[0053] 图2为式(I)所示化合物的HMBC二维核磁共振图谱。

具体实施方式

[0054] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。L-谷氨酰胺：Invitrogen公司。新生牛血清：Gibco公司。

[0055] 实施例1、菌株N153的分离和鉴定

[0056] 一、菌株N153的分离

[0057] 2005年8月从北京市东灵山五角枫枝条上分离到一株菌，命名为菌株N153。菌株N153为一种植物内生真菌。

[0058] 二、菌株N153的鉴定

[0059] 1、形态鉴定

[0060] 菌落白色；菌丝无色至褐色，表生，分支，具隔，2-4μm宽；产分生孢子器，聚生，表生，球状，黑色，厚壁，褐色至橄榄褐色，角状纹理；无分生孢子梗，产孢细胞瓶梗状，不伸长，离生，安瓿瓶状，无色，光滑，薄壁；分生孢子浅褐色，柱状至棒状，直，基部截平，顶部钝圆，无隔膜，光滑，薄壁，1.5-2×3-4μm。

[0061] 2、分子鉴定

[0062] 菌株N153的18S ribosomal RNA部分序列见序列表的序列1，如GENBANK ACCESSIONNO.JF439492.1的序列相似性最高，相似性为99％。

[0063] 根据 以上 鉴定 结 果，菌 株N153属 于并 盾壳 孢属 (Paraconiothyrium brasiliense)。

[0064] 三、菌株N153的保藏

[0065] 菌株N153，属于Paraconiothyrium brasiliense，已于2011年10月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No.5380。

[0066] 实施例2、式(I)所示化合物的制备

[0067] PDA培养基：将马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15g和水1000mL混匀，121℃高压蒸汽灭菌30min。

[0068] 种子培养基：将葡萄糖4.0g、麦芽汁10.0g、酵母提取物4.0g和水1000mL混匀，将pH调节到6.5，每个250mL三角瓶中加入50mL并121℃灭菌30min。

[0069] 大米培养基：将80g大米和120mL水加入500mL三角瓶中，浸泡过夜，121℃高压蒸汽灭菌30min。

[0070] 一、菌株N153的固体发酵

[0071] 1、菌株N153的活化

[0072] 将菌株在PDA平板上培养5天，待菌落长满平板后，将5个1cm2大小的菌块连同培养基接种到含有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，在摇床上培养(25℃、200rpm)7天后作为种子培养液。

[0073] 2、菌株N153的固体发酵

[0074] 将5mL种子培养液接种于装有大米培养基的三角瓶中，25℃无菌培养40天。

[0075] 二、式(I)所示化合物的提取

[0076] 1、在步骤1得到的三角瓶(含固体发酵物)中加入1.0L乙酸乙酯，室温浸提24小时，收集上清液。

[0077] 2、在步骤1的三角瓶中再次加入1.0L乙酸乙酯，室温浸提24小时，收集上清液。

[0078] 3、在步骤2的三角瓶中再次加入1.0L乙酸乙酯，室温浸提24小时，收集上清液。

[0079] 4、在步骤3的三角瓶中再次加入1.0L乙酸乙酯，室温浸提24小时，收集上清液。

[0080] 5、将步骤1的上清液、步骤2的上清液、步骤3的上清液和步骤4的上清液合并，减压蒸馏至干燥，得到9.0g粗提物。

[0081] 三、式(I)所示化合物的分离纯化

[0082] 1、减压硅胶柱层析

[0083] 将步骤二得到的粗提物进行减压硅胶柱层析。

[0084] 柱子型号为：8×30cm；

[0085] 填充物为：薄层层析硅胶H；

[0086] 洗脱过程为：依次用1000mL洗脱液A(由9体积份石油醚和1体积份乙酸乙酯组成)、1000mL洗脱液B(由4体积份石油醚和1体积份乙酸乙酯组成)和1000mL洗脱液C(由7体积份石油醚和3体积份乙酸乙酯组成)进行洗脱，流速为50mL/min，收集洗脱液C的过柱后洗脱液。

[0087] 2、凝胶色谱

[0088] 将步骤1收集的过柱后洗脱液进行凝胶色谱分离。

[0089] 柱子型号为：3×60cm；

[0090] 填充物为：Sephadex LH-20；

[0091] 流动相为1体积份二氯甲烷和1体积份甲醇的混合物，流速为0.5mL/min；

[0092] 收集保留体积为80-100mL的过柱后洗脱液。

[0093] 3、反相HPLC

[0094] 将步骤2收集的过柱后洗脱液进行反相HPLC。

[0095] 柱子型号为：Kramosil C18柱(10μm；10×250mm)；

[0096] 洗脱过程为：用体积百分含量为72％的甲醇水溶液洗脱30min，流速为2mL/min。

[0097] 收集保留时间为18.9-20.2min(峰值的保留时间tR为19.5min)的过柱后洗脱液。

[0098] 4、将步骤3收集的过柱后洗脱液减压蒸馏至干燥，得到20mg产物。

[0099] 四、式(I)所示化合物的表征

[0100] 将步骤三的产物进行红外光谱(测试仪器型号为Nicolet Magna-IR 750)、紫外plus光谱、有机质谱(测试仪器型号为Bruker Esquire 3000 )和核磁共振谱(测试仪器型号为Varian Mercury-600)分析。

[0101] 产物的表征表征数据如下：

[0102] 白色粉末；

[0103] 分子式：C15H19NO2；分子量：245；

[0104] 高分辨质谱HRESIMS：m/z 268.1307[M+Na]+(计算的C15H19NO2Na，268.1308)；

[0105] 红外光谱IR(涂膜)vmax：3392，3173，2934，2859，1760，1653，1587，1378，1120，-11001cm ；

[0106] HMQC二维核磁共振图谱见图1，HMBC二维核磁共振图谱见图2；

[0107] 氢谱(1H-NMR)和碳谱(13C-NMR)数据见表1。

[0108] 表1氢谱(1H-NMR)和碳谱(13C-NMR)数据

[0109]pos. δca，mult. δHb(J in Hz) HMBCa
1a.5a 33.9，CH2 1.36，qd(13，3.6) 2，4，6
1b.5b 1.97，dt(13，3.6) 2，3，4，6，7
2a.4a 34.1，CH2 2.11，td(13，3.6) 1，3，5，6，15
2b.4b 2.30，dt(13，3.6) 1，3，5，6，15
3 148.1，qC
6 33.4.CH 2.60，tt(13，3.6) 1，2，4，5，7，14
7 132.2，qC
8 113.5.CH 6.65.s 6，7，9，10，14
9 151.5，qC
10 121.1.CH 7.03.s 8，9，11，12，13
11 128.5，qC
12 170.0，qC
13 14.4，CH3 2.07.s 10，11，12
14 139.2.CH 7.56.s 7，8，9
15 107.7，CH2 4.64.s 2，3，4
NH2-12 7.48，br s；7.03，br

[0110] a在150MH以DMSO-d6为溶剂测试；b在600MHz以DMSO-d6为溶剂测试。

[0111] 依据以上表征数据上述化合物的理化数据和图谱，步骤三的产物为式(I)所示的化合物。

[0112] 式(I)。

[0113] 实施例3、式(I)所示化合物对肿瘤细胞的抑制作用

[0114] 采 用MTS(Jeong，C.H.；Bode，A.M.；Pugliese，A.；Cho，Y.Y.；Kim，H.G.；Shim，J.H.；Jeon，Y.J.；Li，H.；Jiang，H.；Dong，Z.Cancer Res.2009，69，5584-5591.)法检测式(I)所示化合物对肿瘤细胞的抑制作用。将紫杉醇(sigma公司)作为式(I)所示化合物的阳性对照，进行平行实验。

[0115] 本实施例所用肿瘤细胞为：MCF-7细胞(ATCC编号为HTB-22；乳腺癌细胞株；又称MCF7细胞)。

[0116] 本实施例所用的非肿瘤细胞株(阴性对照)为：HaCaT细胞(人角化上皮细胞株；参考文献：Boukamp，P；Petrussevska，R.T；Breitkreutz，D；Hornung，J；Markham，A；Fusenig，N.E.J.Cell Biol.1988，106：761-771.)、Hek293细胞(ATCC编号为CRL-1573；人肾上皮细胞株；又称293细胞)和NIH-3T3细胞(ATCC编号为CRL-1658；鼠成纤维细胞株；
又称NIH/3T3细胞)。

[0117] 1、将实施例2的步骤三的产物用二甲基亚砜(DMSO)分别配制0.62、1.85、5.56、16.67和50.00μM的待测溶液。待测溶液中式(I)所示化合物的含量是将步骤三的产物的质量除以化合物的分子量(245)得到的。

[0118] 2、将待测细胞(肿瘤细胞或非肿瘤细胞)培养于corning 96孔板中，每孔细胞数为5×103个，每孔加入100微升1640培养基(含2.05mmol/L L-谷氨酰胺和体积百分含量为10％的新生牛血清)。

[0119] 3、将步骤2的96孔板在37℃、5％CO2条件下培养12小时，用PBS缓冲液洗涤，分别加入各个待测溶液(100微升/孔)，每个待测溶液设置3个复孔；将二甲基亚砜用1640培养基稀释至1000倍体积，代替待测溶液，作为阴性对照；将二甲基亚砜用1640培养基稀释至1000倍体积，加入未加入细胞的孔中，作为空白对照。

[0120] 4、将步骤3的96孔板在37℃、5％CO2条件孵育72小时，然后每孔加入20微升MTS溶液(Cell Titer96A queous One Solution Cell Proliferation Assay，Promega公司)。

[0121] 5、将步骤4的96孔板在37℃条件下避光培养2小时，使用Bio-Tek EL*800型酶标仪，读取培养后的混合物在490纳米下的光吸收值。

[0122] 以阴性对照组细胞的光吸收值相对于空白对照组的光吸收值的增长量作为增殖率100％。IC50表示增殖率为50％的药物浓度，通过SPSS statistic19.0软件的Probit回归分析计算IC50值。

[0123] 式(I)所示化合物对MCF-7细胞的IC50值为7.8μM，对Hacat细胞的IC50值为＞50μM，对Hek293细胞的IC50值为＞50μM，对NIH-3T3细胞的IC50值为＞50μM。式(I)所示化合物对非肿瘤细胞的IC50值均大于50μM(化合物浓度＞50uM的情况下，有不溶解的情况，所以无法增加浓度计算IC50值)。结果表明，式(I)所示化合物对肿瘤细胞有着良好的特异性。

[0124] 紫杉醇对MCF-7细胞的IC50为14.1nM，对Hacat细胞的IC50为24.4nM，对Hek293细胞的IC50值为＞150nM，对NIH-3T3细胞的IC50值为＞150nM。