一种卵巢癌个体化治疗的检测试剂盒及其应用

摘要

本发明涉及一种卵巢癌个体化治疗检测剂及其在卵巢癌检测中的应用。具体地，涉及卵巢癌个体化治疗，包括发生发展、分期分级、预测疗效等相关分子标志物检测探针的制备。本发明中涉及的卵巢癌分子标志物检测探针可用于指导卵巢癌个体化治疗方案制定，评价治疗效果、监测复发和转移、评估预后等。

权利要求

1.一种卵巢癌分子标志物检测试剂盒，包括：1)杂交液、DAPI复染剂，和2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中杂交液由杂交缓冲液、荧光标记的基因探针和封闭DNA配制而成；且所述基因探针由以下探针组成：(1)GSP BRCA1

由第一探针和第二探针组成，其中，第一探针核酸序列为BRCA1基因5’末端以外的

398Kb的核酸序列；第二探针由BRCA1基因及5’末端以外23Kb和3’末端以外102Kb的核酸序列组成；所述2个探针均位于17q21区；

(2)GSP PTEN

由第一探针、第二探针和第三探针组成，其中，第一探针核酸序列为PTEN基因5’末端以外的487Kb的核酸序列；第二探针由5’端98Kb的部分PTEN基因及5’末端以外61Kb的核酸序列组成；第三探针由3’端13Kb的部分PTEN基因13Kb和3’末端以外170Kb的核酸序列组成；所述3个探针均位于10q23区；

(3)GSP WT1

由第一探针、第二探针和第三探针组成，其中，第一探针核酸序列为WT1基因5’末端以外的182Kb的核酸序列；第二探针由WT1基因及5’末端以外98Kb和3’末端以外13Kb的核酸序列组成；第三探针为WT1基因3’末端以外188Kb的核酸序列；所述3个探针均位于

11p13区；

(4)GSP PIK3CA

由第一探针、第二探针和第三探针组成，其中，第一探针核酸序列为PIK3CA基因5’末端以外的202Kb的核酸序列；第二探针由PIK3CA基因及5’末端以外43Kb和3’末端以外

54Kb的核酸序列组成；第三探针为PIK3CA基因3’末端以外104Kb的核酸序列；所述3个探针均位于3q26区；

(5)GSP AIB1

由第一探针和第二探针组成，其中，第一探针核酸序列由5’末端AIB1基因126Kb及5’末端以外36Kb的核酸序列组成；第二探针由3’末端AIB1基因47Kb及3’末端以外145Kb的核酸序列组成；所述2个探针均位于20q13区；

(6)GSP AURKA

由第一探针、第二探针和第三探针组成，其中，第一探针核酸序列为AURKA基因5’末端以外的190Kb的核酸序列；第二探针由AURKA基因及5’末端以外56Kb和3’末端以外99Kb的核酸序列组成；第三探针为AURKA基因3’末端以外176Kb的核酸序列；所述3个探针均位于20q13区；

(7)GSP ZNF217

由第一探针和第二探针组成，其中，第一探针核酸序列为ZNF217基因5’末端以外的

152Kb的核酸序列；第二探针由ZNF217基因及5’末端以外54Kb和3’末端以外125Kb的核酸序列组成；所述2个探针均位于20q13区；

(8)GSP MDR1

由第一探针、第二探针和第三探针组成，其中，第一探针核酸序列为MDR1基因5’末端以外的155Kb的核酸序列；第二探针由MDR1基因及5’末端以外51Kb和3’末端以外3Kb的核酸序列组成；第三探针为MDR1基因3’末端以外171Kb的核酸序列；所述3个探针均位于7q21区；

上述探针选择不同的荧光染料标记。

2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于每人份杂交液中使用基因探针的量为0.2ul，杂交缓冲液为7ul，交缓冲液中去离子甲酰胺浓度为50％～70％。

3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征还在于所述基因探针以包含检测靶基因及周边核酸序列的克隆插入片段作为探针制备模板，采用随机引物或切口平移法进行荧光标记。

4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征还在于基因探针的制备模板为如下克隆组合：(1)GSP BRCA1：RP11-948G15、RP11-831F13；

(2)GSP PTEN：RP11-113H4、CTD-2557P6、CTD-2557P6；

(3)GSP WT1：RP11-1037K14、CTD-2643K15、RP11-195J14；

(4)GSP PIK3CA：RP11-737018、RP11-466H15、CTD-2333C22；

(5)GSP AIB1：RP11-1151C1、RP11-122N8；

(6)GSP AURKA：RP11-688E22、RP11-1067D15、CTD-2592H20；

(7)GSP ZNF217：RP11-91L1、RP11-1057P5；

(8)GSP MDR1：RP11-47N1、RP11-1067D15、CTD-2592H20。

5.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于所检测样本为组织样本或细胞样本。

说明书

一种卵巢癌个体化治疗的检测试剂盒及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种卵巢癌个体化治疗检测剂及其在卵巢癌检测中的应用。具体地，涉及卵巢癌个体化治疗，包括发生发展、分期分级、预测疗效等相关分子标志物检测探针的制备。本发明中涉及的卵巢癌分子标志物检测探针可用于指导卵巢癌个体化治疗方案制定，评价治疗效果、监测复发和转移、评估预后等。

背景技术

[0002] 卵巢癌是发生于卵巢组织的恶性肿瘤，发病率仅次于宫颈癌和子宫体癌，占女性恶性肿瘤的第3位。由于卵巢肿瘤位于盆腔内，在患病的初期少表现症状，发病隐匿、进展迅速，70％～80％的卵巢癌患者发现时已为晚期，5年生存率仅为20％～30％，而早期卵巢癌患者的生存率可达90％。目前，临床普遍开展以手术为主的综合治疗，但因病理分类多，结构复杂，生物学特性区别大，且对化疗、放疗等的敏感性各异，造成处理上的困难而影响疗效，其死亡率超过宫颈癌和子宫体癌之和，占妇科肿瘤的首位。因此，只有提高卵巢癌的早期诊断水平、掌握各类型卵巢恶性肿瘤的生物特性，探索有效的综合疗法，才能够争取有利的治疗时机，改善预后，提高卵巢癌的生存率、降低死亡率。

[0003] 与大多数恶性肿瘤一样，卵巢癌的演进及恶化也是一个多步骤、多因素参与的复杂过程，可能涉及到多个基因的共同调节。与卵巢癌相关的肿瘤标志物随着免疫学、分子生物学的发展，也得到了越来越深入研究，并在卵巢癌临床诊断和治疗中起到重要作用。大量的临床对比及回顾研究发现，有多个基因与卵巢癌相关。如BRCA1基因变异患卵巢癌比例更高，BRCA1与P53在上皮性卵巢癌中的表达呈负相关关系，两者可能在卵巢癌的发生、发展过程中存在相互协同作用，共同促进卵巢癌的演变及恶化(Zhihui Feng，Lisa Kachnic，Junran Zhang，et，al.DNA Damage Induces p53-dependent BRCA1 Nuclear Export.The Journal of Biological Chemistry，July 2，2004.279.28574-28584.)。RAD51C基因缺陷在卵巢癌中比例更高，ZNF361、PSMA2、AIB1在卵巢癌中高表达，ZNF217与卵巢癌显著相关，导致卵巢癌的发生发展，WT1基因在上皮性卵巢癌中高表达，与肿瘤分期分级相关，PTEN在卵巢癌发展中表达量逐渐下降，等等。

[0004] 靶向治疗作为一种新的肿瘤治疗手段，能够提高药物对肿瘤细胞的杀伤力，而同时减少对正常组织器官的不良作用，较传统治疗方式显示出明显优势，已逐步应用于临床治疗。随着分子生物学、免疫学、病毒学和基因工程等基础学科的飞速发展，以及人们对肿瘤发生发展研究的深入，靶向治疗已作为一种新的治疗模式以其安全、高效的特性，为卵巢癌的治疗开创了新的领域，成为继手术、放疗、化疗后的又一种有希望的治疗方法，成为当今卵巢癌治疗的新趋势。而研究显示不同治疗方案和药物疗效存在明显的个体差异，利用分子生物学检测评估患者，据分子分型制定治疗方案，实行个体化诊疗，对于提高诊疗效果，降低死亡率、减少医疗成本都极具意义(Albertson，D.G.，2006.Gene amplification in cancer.Trends Genet.22(8)，447-455.Albertson，D.G.，Collins，C.，McCormick，F.，Gray，J.W.，2003.Chromosome aberrations in solid tumors.Nat.Genet.34(4)：369-376.Ena Segota MD，Ronald M，Bukowski MD：The promise of targeted therapy：Cancer drugs become more specific.Cleveland Clinic Journal Of Medicine 2004；volume71，number 7.)。目前，与卵巢癌相关的遗传标志、发生发展相关基因及用药疗效预测基因研究较多，但大多停留在试验室研究阶段，市场上缺少相应的分子诊断试剂，大大限制了个体化诊疗的发展。

[0005] 本发明根据临床研究结果，选择与卵巢癌疾病进程及疗效预测两方面相关的分子指标作为检测靶点，通过联合检测在卵巢癌中的表达预测肿瘤生物学行为特征，并作为判断预后的指标，临床上可以通过对这些基因及其表达产物的监测而调整化疗方案。具体包括如下：

[0006] ①BRCA1(breast cancer susceptibility gene 1)：定位于人类染色体17q21区。乳腺癌易感基因，抑癌基因，它编码抑癌蛋白，参与许多重要的细胞生命活动，如细胞周期的调控、转录活化与抑制、染色质重塑、中心体复制、DNA损伤修复等。正常BRCA1基因编码BRCA1蛋白，对肿瘤的生长起到抑制作用。若由于先天遗传或者后天原因发生基因突变，基因产物作用消失或者降低，就可能导致卵巢肿瘤的发生。研究表明，BRCA1在正常卵巢组织中高表达，在卵巢癌中表达降低，且随着肿瘤病理学分级增高及发生淋巴转移时，阳性表达率逐渐下降(Joshua Z Press，Alessandro De Luca，Niki Boyd，et，al.Ovarian carcinomas with genetic and epigenetic BRCA1 loss have distinct molecular abnormalities.BMC Cancer.2008，8：17；Miki Y，Swensen J，Shattuck-Eidens D，Futreal PA，et，al.A strong candidate for the breast and ovarian cancer susceptibility gene BRCA1.1994，266(5182)：66-71)。

[0007] ②PTEN(Phosphatase and tensin homolog)：定位于人类染色体10q23区。PTEN是迄今为止发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因，在生长因子的细胞信号传递中起着复杂而重要的作用，通过抑制细胞有丝分裂、诱导细胞凋亡、参与调节细胞的黏附、转移和分化等发挥抑癌基因的作用。PTEN的缺失和突变与多种肿瘤，包括卵巢癌的发生及演进关系密切。PTEN表达在卵巢癌发生过程中逐渐降低，提示PTEN基因表达在卵巢癌发生中作为早期分子事件发挥重要作用。PTEN表达与卵巢癌的临床病理分期呈负相关，提示PTEN表达下降可能与卵巢癌的演进关系密切。此外，卵巢癌中PTEN表达下降时会缩短无复发间隔，而PTEN表达上升将延长进展。(T. U.-J. G.Roth，Time to progressionis dependent on the expression of the tumour suppressor PTEN in ovarian cancer patients.European Journal of Clinical Investigation Volume 33，Issue 3，pages 256-260，March 2003；GOMES，C.P.；ANDRADE，L.A.L.A.PTEN and p53 expression in primary ovarian carcinomas：immunohistochemical study and discussion of pathogenetic mechanisms.International Journal of Gynecological Cancer：February
2006-Volume 16-Issue-p 254-258)

[0008] 染色体20q12-q13.2区在人类癌症中存在非随机性的DNA扩增情况，在卵巢癌中有许多报导，其高频率的基因扩增可能与发病机理相关，随着肿瘤进展，其异常频率显著增加，在临床中，可应用于肿瘤分型，作为肿瘤进展发生的预后标志，与预后差相关。(L.Dimova，A.Yosifova，B.Zaharieva，et，al.Association of 20q13.2 copy number changes with the advanced stage of ovarian cancer-tissue microarray analysis.European Journal of Obstetrics&Gynecology and Reproductive Biology.Volume 118，Issue 1，10 January 2005，Pages 81-85)

[0009] ③ZNF217(Zinc finger protein 217)：定位于人类染色体20q13区，是一种致癌基因。ZNF217基因是卵巢癌的增殖、侵袭、运动的促进基因。有研究表明，ZNF217可以减弱阿霉素治疗导致的凋亡信号，暗示ZNF217表达可能与化疗抗药性有关。ZNF217可能通过与特定的DNA序列结合，形成共阻物c端结合蛋白(CtBP)阻止多种基因的转录。ZNF217不恰当表达导致与癌细胞增殖、生长和/或侵袭相关基因的负调节。ZNF217基因有望成为卵巢癌基因治疗的靶点。(Peixiang Li，Sarah Maines-Bandiera，Wen-Lin Kuo.Multiple roles of the candidate oncogene ZNF217 in ovarian epithelial neoplastic progression.International Journal of Cancer.Volume 120，Issue 9，pages 1863-1873，1 May 2007；Kate G.R.Quinlan，Alexis Verger，Paul Yaswen.Amplification of zinc finger gene 217(ZNF217)and cancer：When good fingers go bad.Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Reviews on Cancer.Volume 1775，Issue
2，June 2007，Pages 333-340；Alexander Schipf，Doris Mayr，Thomas Kirchner，et，al.Molecular genetic aberrations of ovarian and uterine carcinosarcomas-a CGH and FISH study.Virchows Archiv，Volume 452，Number 3，259-268.)

[0010] ④AURKA(Aurora kinase A，或BTAK，STK15)：定位于人类染色体20q13区。研究表明在卵巢上皮细胞癌细胞增殖过程中，AURKA的扩增和表达是一个普遍和重要的事件，可能会引起重要的癌前病变。(C.M.Chung，C.Man，Y.Jin.Amplification and overexpression of Aurora kinase A(AURKA)in immortalized human ovarian epithelial(HOSE)cells.Molecular Carcinogenesis.165-174，July 2005)

[0011] ⑤ AIB1(Amplified in breast cancer 1， 也 称 steroid receptor coactivator-3)：定位于人类染色体20q13区。类固醇激酶共激活剂基因，与雌激素受体阳性相关，与患者生存差相关。(Minna M.Tanner，Seija Grenman，Anjila Koul，et，al.Frequent Amplification of Chromosomal Region 20q12-q13 in Ovarian Cancer.Clin Cancer Res May 20006；1833)

[0012] ⑥WT1(Wilms′tunor suppressor gene)：定位于人类染色体11p13区。产物被认为具内源免疫性，现在认为具有致癌性。一项研究表明，在正常组织中，WT1仅在肾脏、脾脏粘液层、睾丸支持细胞、卵巢颗粒细胞中表达。而在上皮性卵巢癌中WT1高表达，与肿瘤分期分级相关，与生存期无关。因其组织特异性表达特点和内源免疫性，WT1将可能成为上皮性卵巢癌中抗原特异免疫治疗的新靶标。此外，WT1表达与临床预后差相关。(Bonnie Hylandera，Elizabeth Repaskya，Protul Shrikanta，Expression of Wilms tumor gene(WT1)in epithelial ovarian cancer，Gynecologic Oncology，Volume 101，Issue 1，April 2006，Pages 12-17；Jakob Dupont，Ekaterina S.Doubrovina，Chia Ma，Development and analysis of Wilms’tumor protein(WT1)specific T cells for adoptive immunotherapy of epithelial ovarian cancer.Proc Amer Assoc Cancer Res，Volume 46，2005)

[0013] ⑦PIK3CA(Phosphatidylinositol 3-kinase，catalytic，alpha polypeptide)：定位于人类染色体3q26区。PIK3CA在约40％卵巢和其它癌症中基因拷贝增加，它编码磷脂酰肌醇3-激酶(PI3-kinase)p110α催化剂亚单位。因为PI3激酶在肿瘤增殖、葡萄糖代谢、细胞粘连、细胞凋亡等中的作用，使得PIK3CA作为一种原癌基因参与肿瘤发生。(Laleh Shayesteh，Yiling Lu，Wen-Lin Kuo.PIK3CA is implicated as an oncogene in ovarian cancer.Nature Genetics (1999)21，99-102)

[0014] ⑧MDR1(multi-drug resistance gene)：定位于人类染色体7q21区。多药耐药基因MDR的表达产物p-gp是一种能量依赖性药泵，能将多种结构和作用机制不同的药物泵出细胞外，使胞内药物蓄积浓度下降，从而阻碍化疗药物作用的发挥，其表达水平与耐药程度正相关。目前临床应用的以铂类为基础的联合化疗对卵巢癌的治疗效果较好，但大部分晚期卵巢癌患者终会复发且产生化疗药物抗药性，从而导致治疗失败。体外研究发现，在对顺铂、阿霉素耐药的卵巢癌细胞株中72％的细胞出现了MDR1基因的过度表达。通过多种方法抑制MDR1基因的表达，不仅使细胞内化疗药物浓度增加同时也增强了肿瘤细胞对药物的敏感性。卵巢癌的耐药机制非常复杂，是多基因共同作用的结果，而检测该靶标将有助于进一步了解卵巢癌耐药机制。(Tatyana A.Holzmayer，Susan Hilsenbeck.Clinical Correlates of MDR1 P-glycoprotein)Gene Expression in Ovarian and Small-Cell Lung Carcinomas.JNCI J Natl Cancer Inst(1992)84(19)：1486-1491.Maria Kavallaris，Jennifer A.Leary，Julie A.et，al.MDR1 and multidrug resistance-associated protein(MRP)gene expression in epithelial ovarian tumors.Cancer letters，volume102，issues1-2，19 April 1996：7-16.)[0015] 利用荧光探针对上述八种标志物进行检测，能够更加全面的认识卵巢癌的发生机制，更准确的分析患者的病情，在临床应用中了解卵巢癌的发生发展。通过分子分型，评估卵巢癌患者的预后，用于指导个体化治疗方案的制定，选择合适的治疗药物，从而降低死亡率，节约医疗成本，达到优化诊疗效果的目的。

[0016] 本发明提供了这八种与卵巢癌相关的分子标志物的探针的制备方法，并在此基础上利用这些探针自主研制了卵巢癌分子标志物荧光原位杂交检测试剂盒，填补了国内该检测领域的空白，具有十分重大的意义。

发明内容

[0017] 本发明的一个目的是提供一种卵巢癌个体化治疗的检测剂，本发明检测剂包括BRCA1和/或PTEN和/或WT1和/或PIK3CA和/或ZNF217和/或AURKA和/或AIB1和/或MDR1基因探针。

[0018] 根据本发明一个优选的实施方案，通过NCBI Mapview数据库分别检索所有含有靶基因的克隆，分别对这些克隆进行筛选，选择最优的克隆。

[0019] 根据本发明一个优选的实施方案，该检测剂包括BRCA1基因探针：GSP BRCA1[0020] GSP BRCA1包括第一探针和第二探针，其中

[0021] 第一探针核酸序列为BRCA1基因5’末端以外的398Kb的核酸序列；第二探针包括BRCA1基因及5’末端以外23Kb和3’末端以外102Kb的核酸序列；所述2个探针均位于17q21区。

[0022] 在本发明的一个实施方案中，GSP BRCA1所述2个探针的核酸序列长度总为398Kb。探针购买于Invitrogen RP11 BAC克隆库。探针为RP11-948G15(其插入片段起止位置：chr17：40981496-41172473，末端序列登记号：AQ571046和AQ565418)和RP11-831F13(其插入片段起止位置：chr17：41172482-41379594，末端序列登记号：AQ818185和AQ828457)所包含的插入片段。

[0023] 根据本发明一个优选的实施方案，该检测剂包括PTEN基因探针：GSP PTEN[0024] GSP PTEN包括第一探针、第二探针和第三探针，其中

[0025] 第一探针核酸序列为PTEN基因5’末端以外的487Kb的核酸序列；第二探针包括部分PTEN基因98Kb及5’末端以外61Kb和的核酸序列；第三探针包括部分PTEN基因13Kb和3’末端以外170Kb的核酸序列；所述3个探针均位于10q23区。

[0026] 在本发明的一个实施方案中，GSP PTEN所述3个探针的核酸序列长度总为487Kb。探针购买于Invitrogen RP11 BAC及CTD BAC克隆库。探针为RP11-113H4(其插入片段起止位置：chr10：89411341-89571593，末端序列登记号：AQ343267和AQ343270)、CTD-2557P6(其插入片段起止位置：chr10：89562163-89721747，末端序列登记号：
AQ426941和AQ426940)和CTD-2557P6(其插入片段起止位置：chr17：89715222-89898644，末端序列登记号：AQ514109和AQ462258)所包含的插入片段。

[0027] 根据本发明一个优选的实施方案，该检测剂包括WT1基因探针：GSP WT1[0028] GSP WT1包括第一探针、第二探针和第三探针，其中

[0029] 第一探针核酸序列为WT1基因5’末端以外的182Kb的核酸序列；第二探针包括WT1基因及5’末端以外98Kb和及3’末端以外13Kb的核酸序列；第三探针WT1基因3’末端以外188Kb的核酸序列；所述3个探针均位于11p13区。

[0030] 在本发明的一个实施方案中，GSP WT1所述3个探针的核酸序列长度总为521Kb。探针购买于Invitrogen RP11 BAC及CTD BAC克隆库。探针为RP11-1037K14(其插入片 段起止 位置：chr11：32136627-32319471，末端 序列登 记号：AQ693687和AQ776592)、CTD-2643K15(其插入片段起止位置：chr11：32310961-32470989，末 端序列登记号：AQ588043和AQ588042)和RP11-195J14(其插入片段起止位置：chr11：
32469702-32657875，末端序列登记号：AQ412679和AZ517572)所包含的插入片段。

[0031] 根据本发明一个优选的实施方案，该检测剂包括PIK3CA基因探针：GSP PIK3CA[0032] GSP PIK3CA包括第一探针、第二探针和第三探针，其中

[0033] 第一探针核酸序列为PIK3CA基因5’末端以外的202Kb的核酸序列；第二探针包括PIK3CA基因及5’末端以外43Kb和及3’末端以外54Kb的核酸序列；第三探针为PIK3CA基因3’末端以外104Kb的核酸序列；所述3个探针均位于3q26区。

[0034] 在本发明的一个实施方案中，GSP PIK3CA所述3个探针的核酸序列长度总为477Kb。探针购买于Invitrogen RP11 BAC及CTD BAC克隆库。探针为RP11-737O18(其插入片段起止位置：chr3：178633717-178836408，末端序列登记号：AQ450715和AQ456038)、RP11-466H15(其插入片段起止位置：chr3：178822841-179006790，末端序列登记号：AQ636573和AQ636574)和CTD-2333C22(其插入片段起止位置：chr3：
179007577-179111560，末端序列登记号：AQ038360和AQ038356)所包含的插入片段。

[0035] 根据本发明一个优选的实施方案，该检测剂包括AIB1基因探针：GSP AIB1[0036] GSP AIB1包括第一探针和第二探针，其中

[0037] 第一探针核酸序列包括AIB1基因126Kb及5’末端以外36Kb的核酸序列；第二探针包括AIB1基因47Kb及3’末端以外145Kb的核酸序列；所述2个探针均位于20q13区。

[0038] 在本发明的一个实施方案中，GSP AIB1所述2个探针的核酸序列长度总为335Kb。探针购买于Invitrogen RP11 BAC克隆库。探针为RP11-1151C1(其插入片段起止位置：
chr20：46094848-46256586，末端序列登记号：AQ749554和AQ749180)和RP11-122N8(其插入片段起止位置：chr20：46238389-46430555，末端序列登记号：AQ344397和AZ520185)所包含的插入片段。

[0039] 根据本发明一个优选的实施方案，该检测剂包括AURKA基因探针：GSP AURKA[0040] GSP AURKA包括第一探针、第二探针和第三探针，其中

[0041] 第一探针核酸序列为AURKA基因5’末端以外的190Kb的核酸序列；第二探针包括AURKA基因及5’末端以外56Kb和及3’末端以外99Kb的核酸序列；第三探针AURKA基因3’末端以外176Kb的核酸序列；所述3个探针均位于20q13区。

[0042] 在本发明的一个实施方案中，GSPAURKA所述3个探针的核酸序列长度总为497Kb。探针购买于Invitrogen RP11 BAC及CTD BAC克隆库。探针为RP11-688E22(其插入片段起止位置：chr20：54730219-54921077，末端序列登记号：AQ808759和AQ813272)、RP11-1067D15(其插入片段起止位置：chr20：54888353-55066415，末端序列登记号：
AQ730353

[0043] 和AQ730207)和CTD-2592H20(其插入片段起止位置：chr20：55051190-55227192，末端序列登记号：AQ476668和AQ476665)所包含的插入片段。

[0044] 根据本发明一个优选的实施方案，该检测剂包括ZNF217基因探针：GSP ZNF217[0045] GSP ZNF217包括第一探针和第二探针，其中

[0046] 第一探针核酸序列为ZNF217基因5’末端以外的152Kb的核酸序列；第二探针包括ZNF217基因及5’末端以外54Kb和3’末端以外125Kb的核酸序列；所述2个探针均位于20q13区。

[0047] 在本发明的一个实施方案中，GSP ZNF217所述2个探针的核酸序列长度总为337Kb。探针购买于Invitrogen RP11 BAC克隆库。探针为RP11-91L1(其插入片段起止位置：chr20：51987810-52139422，末端序列登记号：AZ519337和AQ283579)和RP11-1057P5(其插入片段起止位置：chr20：52129960-52324790，末端序列登记号：AQ673688和AQ680772)所包含的插入片段。

[0048] 根据本发明一个优选的实施方案，该检测剂包括MDR1基因探针：GSP MDR1[0049] GSP MDR1包括第一探针、第二探针和第三探针，其中

[0050] 第一探针核酸序列为MDR1基因5’末端以外的155Kb的核酸序列；第二探针为MDR1基因及5’末端以外51Kb和3’末端以外3Kb的的核酸序列；第三探针MDR1基因3’末端以外171Kb的核酸序列；所述3个探针均位于7q21区。

[0051] 在本发明的一个实施方案中，GSP MDR1所述3个探针的核酸序列长度总为473Kb。探针购买于Invitrogen RP11 BAC克隆库。探针为RP11-47N1(其插入片段起止位置：
chr7：87037167-87192745，末端序列登记号：AQ200820和AQ200819)、RP11-1067D15(其插入片段起止位置：chr20：87177953-87345695，末端序列登记号：AQ315289和AQ315285)和CTD-2592H20(其插入片段起止位置：chr20：87338969-8750978，末端序列登记号：B71252和AZ517192)所包含的插入片段。

[0052] 使用筛选得到的克隆制备上述基因探针，荧光原位杂交测试结果显示，杂交信号明亮，可用于样本检测。

[0053] 根据本发明一个优选的实施方案，基因探针制备步骤中克隆质粒DNA提取可使用市售的质粒提取试剂盒，包括但不限于，如Qiagen公司的Plasmid Maxi Kit。

[0054] 根据本发明一个优选的实施方案，基因探针制备步骤中克隆质粒DNA的定量是将质粒DNA稀释后分别测定260nm和280nm下的吸光度，计算产物浓度。

[0055] 根据本发明一个优选的实施方案，基因探针的标记可以采用现有技术中的方法将相应荧光素标记至双链核酸上，所述方法包括但不限于：随机引物法、切口平移等，标记基因探针可以使用市售的缺口平移标记试剂盒和/或随机引物标记试剂盒，优选abbott和/或Roche公司的Nick Translation Kit。

[0056] 根据本发明一个优选的实施方案，基因探针标记的荧光素可以选择本领域已知的荧光染料，如：Alexa 488、Alexa 555、pacific FITC、DEAC、Rhodamine等，同一基因探针组中的不同探针，如BRCA1基因探针：GSP BRCA1中第一探针和第二探针，原则上使用同一荧光染料进行标记。

[0057] 根据本发明一个优选的实施方案，当实行多指标联合检测时，多色荧光体系中优选异硫氰酸(绿色)、和/或罗丹明(红色)、和/或DEAC(青色)、和/或spectrum Gold(金色)进行组合标记。

[0058] 根据本发明一个优选的实施方案，当进行单指标检测时，荧光体系中优选异硫氰酸(绿色)或罗丹明(红色)进行标记。

[0059] 根据本发明一个优选的实施方案，对于基因探针，当带有罗丹明标记时，在正常情况下，荧光显微镜下应该显示2个红色信号(2R)；出现基因纯合缺失时，荧光显微镜下不显示红色信号(0R)；出现基因扩增时，荧光显微镜下显示多个红色信号(＞2R)。

[0060] 本发明的另一个目的是利用BRCA1、和/或PTEN、和/或WT1、和/或PIK3CA、和/或ZNF217、和/或AURKA、和/或AIB1、和/或MDR1基因探针制备一种卵巢癌分子标志物荧光原位杂交检测试剂盒。

[0061] 为了实现本发明，我们采用了以下技术方案：

[0062] (1)样本处理和制片：按照原位杂交方法对各类型样本进行处理。

[0063] (2)杂交：配制杂交液，主要包括荧光标记探针混合物和杂交缓冲液，合适温度下进行8～16小时的杂交，然后以合适的洗液洗去未结合上的和非特异结合的探针；DAPI复染剂复染。

[0064] (3)通过荧光显微镜相应滤块观察荧光信号，对不同信号进行观察计数。

[0065] 基于以上技术方案发明的试剂盒包括：1)杂交缓冲液、荧光标记探针混合物、未标记的竞争性DNA、DAPI复染剂，和2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。

[0066] 根据本发明的一个优选实施方案，杂交缓冲液的组分包括去离子甲酰胺，SSC，硫酸葡聚糖，其中去离子甲酰胺浓度为50％～70％，硫酸葡聚糖浓度为0.1g/ml。

[0067] 根据本发明的一个优选实施方案，荧光标记探针混合物包括BRCA1、和/或PTEN、和/或WT1、和/或PIK3CA、和/或ZNF217、和/或AURKA、和/或AIB1、和/或MDR1基因探针。

[0068] 根据本发明的一个优选实施方案，可将8种基因探针组依据检测目的进行组合，分别标记不同荧光染料后，用于卵巢癌分子标志物检测；每人份荧光标记探针混合物中各基因探针的使用量均为0.2μl。

[0069] 根据本发明的一个优选实施方案，由杂交缓冲液、荧光标记探针混合物和未标记的竞争性DNA配制杂交液，其中未标记的竞争性DNA选择Human COT-1 DNA；每人份杂交液中加入7μl杂交缓冲液，0.2～0.8μl荧光标记探针混合物，Human COT-1DNA使用量为1μg，并用H2O补至10μl。。

[0070] 根据本发明的一个优选实施方案，其中DAPI复染剂配制方法为50～250ng DAPI溶于1ml抗褪色液(10mg/ml对苯二胺/PBS，甘油混合液)。

[0071] 利用本发明的试剂盒，依照常规的荧光原位杂交方法对人的中期和间期细胞进行信号计数。

[0072] 本发明与现有技术相比，具有下列优点：

[0073] (1)实现了对同一样本进行多达4种分子标志物的同时检测，有利于提高卵巢癌的早期

[0074] 检出率，更加准确的进行卵巢癌分子分型；

[0075] (2)进行准确、快速的信号计数、且结果重复性好；

[0076] (3)无需进行细胞培养和制备高质量的中期染色体片，可用于中期或间期细胞信号计数，操作相对简单；

[0077] (4)通过制备成试剂盒，可以实现在肿瘤生物学、细胞遗传学等领域的应用，有助综合评价各分子标志物，了解其与卵巢癌发生发展等的联系，辅助临床靶向治疗用药及治疗方案选择。

附图说明

[0078] 图1显示GSP BRCA1探针组位点模式图(红色线框示探针所在位置)。

[0079] 图2显示GSP PTEN探针组位点模式图(红色线框示探针所在位置)。

[0080] 图3显示GSPWT1探针组位点模式图(红色线框示探针所在位置)。

[0081] 图4显示GSP ZNF217探针组位点模式图(红色线框示探针所在位置)。

[0082] 图5显示GSP PIK3CA探针组位点模式图(红色线框示探针所在位置)。

[0083] 图6显示GSP AURKA探针组位点模式图(红色线框示探针所在位置)。

[0084] 图7显示GSP AIB1探针组位点模式图(红色线框示探针所在位置)。

[0085] 图8显示GSP MDR1探针组位点模式图(红色线框示探针所在位置)。

[0086] 图9显示人类正常分裂中期淋巴细胞基因探针的检测结果。

[0087] 图10显示人类正常分裂中期淋巴细胞组合基因探针(两色)的检测结果。

[0088] 图11显示人类正常分裂中期淋巴细胞组合基因探针(四色)的检测结果。

[0089] 图12显示卵巢癌组织福尔马林固定石蜡包埋组织切片中基因探针(四色)的检测结果。

具体实施方式

[0090] 下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。

[0091] 实施例1：卵巢癌分子标志物检测剂BRCA1基因探针的制备方法

[0092] (1)克隆筛选：挑选包含目的基因BRCA1及两端序列为RP11-948G15和RP11-831F13的克隆。

[0093] (2)克隆培养和鉴定：购买相应克隆Invitrogen RPCI11.C，取50ul添加到500ml的TB培养液(氯霉素抗性)中，37℃摇床中摇菌培养24～48小时；菌液使用STS引物对进行克隆鉴定。RP11-948G15：STS引物对：上游引物5’-CTTGCACCTATAATCCCAG-3’和下游引物5’-AGTCTTCTTGTCTTGTGGC-3’，PCR扩增条件为：95℃5分钟；(94℃30秒，55℃30秒，72℃45秒)×35循环；72℃7分钟。扩增产物进行电泳验证，结果128bps左右具有明亮的条带。RP11-831F13STS引物对：上游引物5’-AAACATGTTCCTCCTAAGGTGCTTT-3’和下游引物
5’-ATGAAACCAGAAGTAAGTCCACCAGT-3’，PCR扩增条件为：95℃5分钟；(94℃30秒，58℃30秒，72℃45秒)×35循环；72℃7分钟。扩增产物进行电泳验证，结果119bps左右具有明亮的条带。

[0094] (3)GSP BRCA1基因探针制备：鉴定阳性的菌液，使用Qiagen公司的Plasmid Maxi Kit，按照说明书要求的操作方法进行超低拷贝质粒DNA提取，通过测定260nm和280nm处的吸光度对质粒DNA定量；按照公式：双链DNA浓度(ng/ul)＝0D260×50(ng/ul)计算质粒DNA浓度。采用高压灭菌的超纯水稀释为100ng/ul，采用1.5ml的离心管分装，-20℃密封保存。

[0095] 通过缺口平移方法对质粒DNA进行荧光标记，探针标记的荧光素为FITC-12-dUTP。采用abbott的Nick Translation Kit，按如下方案，严格避光条件下在冰上配制PCR反应体系。

[0096]

[0097] 配完后震荡混匀，在16℃标记12小时，再80℃孵育10分钟灭活酶。取5ul使用2％琼脂糖凝胶做电泳，要求在100-500bp之间存在弥散的带。

[0098] 对标记产物进行乙醇沉淀和浓缩，按如下方案在1.5ml离心管中依次加入醋酸钠和无水乙醇，避光、冰上配制：

[0099] 标记产物 45ul

[0100] 醋酸钠(3mol/L) 5ul

[0101] 无水乙醇 125ul

[0102] 混匀后置于-70℃冰箱中至少2小时，4℃13000rpm离心30分钟，小心去上清，勿搅动沉淀，加入1ml的70％乙醇，4℃13000转/分钟离心15分钟，小心去上清，勿搅动沉淀，避光干燥。使用1ul纯化水溶解沉淀，获得GSP BRCA1基因探针，避光、-20℃储存。

[0103] (4)GSP BRCA1基因探针验证：使用人类正常分裂中期淋巴细胞滴片进行探针验证。包含中期或间期染色体DNA，荧光原位杂交时，染色体DNA表现为形态上可识别的染色体或是细胞核。

[0104] 实施例2：卵巢癌分子标志物检测剂PTEN基因探针的制备方法

[0105] (1)克隆筛选：挑选包含目的基因PTEN及两端序列为RP11-113H4、CTD-2557P6和RP11-765C10的克隆。

[0106] (2) 克 隆 培 养 和 鉴 定：RP11-113H4：STS 引 物 对：上 游 引 物5’-AGAAAGACAGACAAAAAGATGAGG-3’和下游引物5’-GAGTTGCCAGTGTGCTTTAC-3’，PCR扩增条件为：95℃5分钟；(94℃30秒，58℃30秒，72℃45秒)×35循环；72℃7分钟。扩增产物进行电泳验证，结果188bps左右具有明亮的条带。CTD-2557P6 STS引物对：上游引物
5’-GTTTTTAGTGAGGGCTGGTGAAA-3’和下游引物5’-ATTTCCCTTTGGAAAGTGCTGTT-3’，PCR扩增条件为：95℃5分钟；(94℃30秒，58℃30秒，72℃45秒)×35循环；72℃7分钟。扩增产物进行电泳验证，结果341bps左右具有明亮的条带。RP11-765C10STS引物对：上游引物
5’-TGTTAAGCTTGTCTATGCTAAACAA-3’和下游引物5’-AATTCAGTGGCTTAATCATGAATG-3’，PCR扩增条件为：95℃5分钟；(94℃30秒，58℃30秒，72℃45秒)×35循环；72℃7分钟。扩增产物进行电泳验证，结果341bps左右具有明亮的条带。其它步骤参见实施例1。

[0107] (3)GSP PTEN基因探针制备：鉴定阳性的菌液，使用Qiagen公司的Plasmid Maxi Kit，按照说明书要求的操作方法进行超低拷贝质粒DNA提取，通过测定260nm和280nm处的吸光度对质粒DNA定量；按照公式：双链DNA浓度(ng/ul)＝OD260×50(ng/ul)计算质粒DNA浓度。采用高压灭菌的超纯水稀释为100ng/ul，采用1.5ml的离心管分装，-20℃密封保存。

[0108] 通过缺口平移方法对质粒DNA进行荧光标记，探针标记的荧光素为Spectrum orange(或gold)dUTP。采用abbott的Nick Translation Kit，按如下方案，严格避光条件下在冰上配制PCR反应体系。

[0109]

[0110] 配完后震荡混匀，在16℃标记12小时，再80℃孵育10分钟灭活酶。取5ul使用2％琼脂糖凝胶做电泳，要求在100-500bp之间存在弥散的带。

[0111] 对标记产物进行乙醇沉淀和浓缩，按如下方案在1.5ml离心管中依次加入醋酸钠和无水乙醇，避光、冰上配制：

[0112] 标记产物 45ul

[0113] 醋酸钠(3mol/L) 5ul

[0114] 无水乙醇 125ul

[0115] 混匀后置于-70℃冰箱中至少2小时，4℃13000rpm离心30分钟，小心去上清，勿搅动沉淀，加入1ml的70％乙醇，4℃13000转/分钟离心15分钟，小心去上清，勿搅动沉淀，避光干燥。使用1ul纯化水溶解沉淀，获得GSP BRCA1基因探针，避光、-20℃储存。

[0116] (4)GSP PTEN基因探针验证：使用人类正常分裂中期淋巴细胞滴片进行探针验证。包含中期或间期染色体DNA，荧光原位杂交时，染色体DNA表现为形态上可识别的染色体或是细胞核。

[0117] 实施例3：卵巢癌分子标志物检测剂WT1基因探针的制备方法

[0118] (1)克隆筛选：挑选包含目的基因WT1及两端序列为RP11-1037K14、CTD-2643K15和RP11-195J14的克隆。

[0119] (2) 克 隆 培 养 和 鉴 定：RP11-1037K14：STS 引 物 对：上 游 引 物5’-AGCTCAAGTGGACAGATGTACAGG-3’和下游引物5’-TGCAATTAGCACGACCATGATAC-3’，PCR扩增条件为：95℃5分钟；(94℃30秒，56℃30秒，72℃45秒)×35循环；72℃7分钟。扩增产物进行电泳验证，结果323bps左右具有明亮的条带。CTD-2643K15STS引物对：上游引物5’-GTTGTCCTTTTCAGCATTGC-3’和下游引物5’-GCAGGGTTTCATCCTCGG-3’，PCR扩增条件为：95℃5分钟；(94℃30秒，58℃30秒，72℃45秒)×35循环；72℃7分钟。扩增产物进行电泳验证，结果405bps左右具有明亮的条带。RP11-195J14STS引物对：上游引物
5’-CCTTTGCTTATGCTGCTTCC-3’和下游引物5’-CATGCTTCATGCTTCTCTATGG-3’，PCR扩增条件为：95℃5分钟；(94℃30秒，56℃30秒，72℃45秒)×35循环；72℃7分钟。扩增产物进行电泳验证，结果130bps左右具有明亮的条带。其它步骤参见实施例1。

[0120] (3)GSP WT1基因探针制备：鉴定阳性的菌液，使用Qiagen公司的Plasmid Maxi Kit，按照说明书要求的操作方法进行超低拷贝质粒DNA提取，通过测定260nm和280nm处的吸光度对质粒DNA定量；按照公式：双链DNA浓度(ng/ul)＝OD260×50(ng/ul)计算质粒DNA浓度。采用高压灭菌的超纯水稀释为100ng/ul，采用1.5ml的离心管分装，-20℃密封保存。

[0121] 通过缺口平移方法对质粒DNA进行荧光标记，探针标记的荧光素为DEAC-dUTP。采用abbott的Nick Translation Kit，按如下方案，严格避光条件下在冰上配制PCR反应体系。

[0122]

[0123]

[0124] 配完后震荡混匀，在16℃标记12小时，再80℃孵育10分钟灭活酶。取5ul使用2％琼脂糖凝胶做电泳，要求在100-500bp之间存在弥散的带。

[0125] 对标记产物进行乙醇沉淀和浓缩，按如下方案在1.5ml离心管中依次加入醋酸钠和无水乙醇，避光、冰上配制：

[0126] 标记产物 45ul

[0127] 醋酸钠(3mol/L) 5ul

[0128] 无水乙醇 125ul

[0129] 混匀后置于-70℃冰箱中至少2小时，4℃13000rpm离心30分钟，小心去上清，勿搅动沉淀，加入1ml的70％乙醇，4℃13000转/分钟离心15分钟，小心去上清，勿搅动沉淀，避光干燥。使用1ul纯化水溶解沉淀，获得GSP WT1基因探针，避光、-20℃储存。

[0130] (4)GSP WT1基因探针验证：使用人类正常分裂中期淋巴细胞滴片进行探针验证。包含中期或间期染色体DNA，荧光原位杂交时，染色体DNA表现为形态上可识别的染色体或是细胞核。

[0131] 实施例4：卵巢癌分子标志物检测剂GSP PIK3CA、GSP ZNF217、GSP AURKA、GSP AIB1、GSP MDR1基因探针的制备方法

[0132] (1)克隆及STS引物对列表

[0133] 表1 GSP PIK3CA探针筛选克隆及STS鉴定引物对

[0134]

[0135] 表2 GSP ZNF217探针筛选克隆及STS鉴定引物对

[0136]

[0137] 表3 GSP AURKA探针筛选克隆及STS鉴定引物对

[0138]

[0139]

[0140] 表4 GSP AIB1探针筛选克隆及STS鉴定引物对

[0141]

[0142] 表5 GSP MDR1探针筛选克隆及STS鉴定引物对

[0143]

[0144] 注：引物序列均为5`到3`。

[0145] (2)探针制备及验证方法同实施例1～3。

[0146] 实施例5：人卵巢癌分子标志物荧光原位杂交检测试剂盒制备(两色)[0147] 以10人份/盒为例。

[0148] (1)杂交液配制

[0149] 将标记好的探针依次放好，首先溶解探针。使用1μl灭菌纯化水溶解按实施例1～4方法进行制备的基因探针干粉中，充分混匀。按表6方案配制荧光标记探针混合物：

[0150] 表6

[0151]

[0152] 按下表方案配制杂交液：

[0153] 表7

[0154]

[0155]

[0156] (2)DAPI复染剂配制

[0157] 抗褪色液：全程操作必须避光，10mg的对苯二胺溶于1ml的PBS中，调节pH为9.0，加入9ml甘油，反复震荡混匀，-20℃储存。终溶液应该为无色或者略带淡黄色，假如呈现黄色或者橙色则需废弃并重新配制。

[0158] 用去离子水配制1mg/ml DAPI储存液。

[0159] 取2.5μl的DAPI溶液(0.1mg/ml)溶于1ml抗褪色液中，避光条件下反复震荡混匀，-20℃避光密闭保存。

[0160] (3)成品组装

[0161]组分名称 规格 数量
杂交液1、2、3、4 各100μl/管 4管
DAPI复染剂 400μl/管 1管
说明书 1份

[0162] 检测结果如图10所示。

[0163] 实施例6：人卵巢癌分子标志物荧光原位杂交检测试剂盒制备(四色)[0164] 以10人份/盒为例。

[0165] (4)杂交液配制

[0166] 将标记好的探针依次放好，首先溶解探针。分别使用1μl灭菌纯化水溶解按实施例1～4方法进行制备的基因探针干粉中，充分混匀。按下表方案配制荧光标记探针混合物：

[0167] 表8

[0168]

[0169] 按下表方案配制杂交液：

[0170] 表9

[0171]

[0172] (5)DAPI复染剂配制

[0173] 同实施例5。

[0174] (6)成品组装

[0175]组分名称 规格 数量
杂交液1、2 各100μl/管 2管
DAPI复染剂 200μl/管 1管
说明书 1份

[0176] 检测结果如图11所示。

[0177] 实施例7：卵巢癌分子标志物荧光原位杂交检测试剂盒(四色)的使用方法[0178] 以福尔马林固定石蜡埋的卵巢组织样本为例。

[0179] (1)玻片预处理

[0180] 玻片放入65±5℃恒温箱中烤片过夜；取出玻片，放入室温二甲苯中30分钟，再将其放入室温1∶1(V∶V)的二甲苯∶无水乙醇中10分钟，放入室温无水乙醇中10分钟，再依次放入室温100％乙醇、90％乙醇、70％乙醇各3分钟；室温去离子水中静置3分钟，吸取多余水分；100±5℃的去离子水中煮片25分钟(切片水平放置于容器中，样本面朝上)，晾干后，放入37±1℃预热的蛋白酶K反应液中消化8～15分钟左右，室温2×SSC中漂洗5分钟，依次放入室温70％，90％，100％梯度乙醇脱水各3分钟。晾干玻片；继续杂交过程。

[0181] (2)样品和探针同时变性

[0182] 从试剂盒中取出杂交液，震荡混匀，瞬时离心；加10μl的杂交液到杂交区域，迅速盖上盖玻片，轻压使杂交液均匀分布，避免产生气泡；橡皮胶水沿盖玻片边缘封片，完全覆盖盖玻片与载玻片接触的边缘；85±1℃的热台上变性5分钟；将玻片放入预热的杂交盒中，避光，37±1℃孵育过夜(约16小时)；继续杂交后洗涤步骤。

[0183] (3)杂交后洗涤及复染

[0184] 取出孵育过夜的杂交盒，小心去除橡皮胶水和盖玻片；将玻片放入37±1℃2×SSC中10分钟；再将其放入37±1℃0.1％NP-40/2×SSC洗涤2分钟；室温
70％乙醇3分钟；暗处晾干。

[0185] 复染：滴加10μl DAPI到载玻片目标区域，盖上盖玻片，轻压，避免产生气泡，在暗处存放，待观察。

[0186] (4)结果分析

[0187] 在Olympus BX50荧光显微镜下，用滤镜组分别观察DAPI复染的杂交荧光信号，用CCD照相记录。在40×物镜下寻找，在100×物镜下计数；调整合适的焦距，对信号和背景有明确的概念；信号点因位于细胞内；当细胞外存在荧光信号点时，要注意与细胞内信号点区分，最好能避开该区域进行计数；调整焦距，在核的不同层次找到信号点；记录观察每个细胞中的各探针的数目。

[0188] (5)结果判定

[0189] 按处理方法要求进行操作，记录各基因探针的信号数目。荧光原位杂交结果显示，中期染色体上各基因探针均可见两个信号点，未见其它荧光信号；间期细胞核中仅见两个信号点，未见其它荧光信号(参见附图12)。

[0190] 实施例8：卵巢癌分子标志物荧光原位杂交检测试剂盒的临床使用评价[0191] 临床收集20例卵巢癌样本，分别使用本实施例7中所述卵巢癌荧光原位杂交检测试剂盒进行检测，按照实施例7进行操作和结果判断。检测结果如表10所述。

[0192] 表10临床样本病例信息

[0193]

[0194]

[0195] 表11卵巢癌分子标志物检测结果

[0196]

[0197] 注：正常N；扩增A；缺失D。

[0198] 检测结果解释：

[0199] ①BRCA1缺失提示卵巢肿瘤发生。

[0200] ②PTEN缺失提示卵巢肿瘤的发生及演进，可能为卵巢癌发生中早期分子事件。

[0201] ③WT1扩增与肿瘤分期分级相关，可能成为上皮性卵巢癌中抗原特异免疫治疗的新靶标，与临床预后差相关。

[0202] ④ZNF217扩增提示卵巢癌细胞增殖、生长和/或侵袭发生，可以作为靶向治疗的靶点。

[0203] ⑤PIK3CA参与肿瘤发生，扩增提示卵巢癌。

[0204] ⑥AURKA扩增是卵巢癌中普遍和重要的事件，可能会引起重要的癌前病变。

[0205] ⑦AIB1扩增预示患者预后差。

[0206] ⑧MDR1扩增提示铂类耐药，可预测疗效及毒副作用。

[0207] 从检测结果知，在对这些样本进行分子标志物检测后，可以据检测结果对样本进行分子分型，依据检测指标的意义，可以辅助卵巢癌的分期分级，同时，用于临床治疗方案制定、用药选择和疗效判断。

[0208] 因此，通过对疑似卵巢癌组织样本进行这八项指标的联合检测，有助综合评价各分子标志物，了解其与肿瘤发生等的联系。同时对于明确基因分类，指导临床用药/治疗和判断预后效果都极其有益。

[0209] 以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。