岩白菜素在动物体内代谢产物的测定方法

摘要

本发明涉及岩白菜素在动物体内代谢产物的测定方法，将给药后的待测血浆、尿液、胆汁、粪便样及未给药的空白血浆、尿液、胆汁、粪便加入乙腈混旋、离心、取清、吹干、复溶得待测液，将待测液进样高效液相色谱/四极杆-飞行时间/串联质谱进行分析得到各待测液总离子流色谱图，用代谢物鉴定软件对空白样本和给药样本总离子流色谱图对比鉴定，然后对空白样本和给药样本总离子流色谱图提取离子与二级碎片进行分析，得出岩白菜素在动物体内代谢产物为葡糖醛酸结合产物，硫酸结合产物，水解和甲基结合产物。本发明首次建立一种灵敏度高，特异性强，方便可行的HPLC/Q-TOF MS/MS法并成功测定到动物体内岩白菜素的代谢产物。

权利要求

1.岩白菜素在动物体内代谢产物的测定方法，其特征是，所述的动物体指哺乳动物，包括步骤如下：（1）将给药后的待测血浆、尿液、胆汁样及未给药的空白血浆、尿液、胆汁样分别按体积比0.3:2加入乙腈，涡旋混合1-3min，10800rpm速度离心2-5min，取上清液，40℃水浴中用氮气吹干后，加入原样体积1/3的乙腈复溶；

将给药后待测粪便及未给药的空白粪便按比例500:4，mg:mL第一次加入乙腈，涡旋

3-5min后将混悬液超声1h，5000rpm速度离心8-10min，分离获得上清液I，剩余下层另加入乙腈，重复上述步骤获得上清液II，混合上清液I和II，40℃水浴中用氮气吹干后，加入第一次用量5%的乙腈复溶；

（2）将上述制备的各待测液分别取10μL进样，高效液相色谱/四极杆-飞行时间/串联质谱进行分析，色谱柱为C18，柱温25℃，流动相A为水，流动相B为乙腈，先后以流动相比例为5%–95%B流动0–20min，95%B流动20–22min，95%-5%B流动22-25min，流速：-1

0.8ml/min；离子源为ESI源，负离子模式，喷雾气压力350Pa，干燥气流速10.0L·min ，干燥气温度为350℃，毛细管电压3500V，碎片电压选择120V；质量数扫描范围m/z100～

1000；上述条件下得到各待测液总离子流色谱图；

（3）用代谢物鉴定软件对空白样本和给药样本总离子流色谱图对比，然后对空白样本和给药样本总离子流色谱图提取离子与二级碎片进行对比鉴定，得到岩白菜素M0：m/z,327.07，三种代谢产物M1：m/z,503.11，M2：m/z,407.03，M3：m/z,359.09；

（4）对比分析M1、M2、M3与岩白菜素的二级碎片得出岩白菜素在动物体内代谢产物为葡糖醛酸结合产物，硫酸结合产物，水解和甲基结合产物。

说明书

岩白菜素在动物体内代谢产物的测定方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种代谢产物的测定方法，特别是岩白菜素在生物体内代谢产物的测定方法。

背景技术

[0002] 岩白菜素(bergenin)，分子式是C14H16O9，分子量为328.27，结构式如下：

[0003]

[0004] 又称岩白菜内脂、矮茶素、虎耳草素、岩白菜宁、佛手配质、鬼灯檠素、Bergenit，Vakrint，AmlisieacidB．，Cuscutin，Pehaphorin,白色疏松针状结晶或结晶性粉末，遇光和热变色，在甲醇中溶解，在水或乙醇中溶解较少。《中国药典》收为镇咳祛痰药，用于慢性支气管炎的治疗。目前岩白菜素的制剂有单方和复方制剂，单方为普通片，复方制剂中添加了马来酸氯苯那敏，含量为岩白菜素125mg、马来酸氯苯那敏2mg/片，复方的主要剂型有普通片、滴丸、口含片、软胶囊、糖浆、颗粒剂、口服液等，其中以复方普通片应用最广,以岩白菜素为原料的多种复方制剂已用于临床。

[0005] 岩白菜的化学成份及其药动/药效学一直是国内外岩白菜研究的热点之一,关于其活性成分岩白菜素原形的测定方法有很多,有纸上层析法、紫外吸收法、薄层扫描法,高效液相色谱法、反相高效液相色谱法等。但是多局限于针对天然植物或药片中的原形药物的含量测定；限于检测技术及其体内浓度过低，对其体内药代动力学研究国内外一直是难点，近年来有极少数文献报道了给药后原形药物的体内测定方法；而给药后测定其体内代谢产物的灵敏准确方法至今国内外未见报道，药物体内代谢研究的不完善使人们对岩白菜素类药物的认识和掌握仍未全面。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，提供一种岩白菜素在动物体内代谢产物的测定方法，灵敏度高，特异性强，方便可行。

[0007] 为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

[0008] 岩白菜素在动物体内代谢产物的测定方法，包括步骤如下：

[0009] （1）将给药后的待测血浆、尿液、胆汁样及未给药的空白血浆、尿液、胆汁样分别按体积比0.3:2加入乙腈，涡旋混合1-3min，10800rpm速度离心2-5min，取上清液，40°C水浴中用氮气吹干后，加入原样体积1/3的乙腈复溶；

[0010] 将给药后待测粪便及未给药的空白粪便按比例500:4，mg/mL第一次加入乙腈，涡旋3-5min后将混悬液超声1h，5000rpm速度离心8-10min，分离获得上清液I，剩余下层另加入乙腈，重复上述步骤获得上清液II，混合上清液I和II，40°C水浴中用氮气吹干后，加入第一次用量5%的乙腈复溶；

[0011] （2）将上述制备的各待测液（包括空白样本及给药样本）分别取10μL进样，HPLC/Q-TOF MS/MS进行分析，色谱柱为ZORBAX Eclipse Plus C18 column(2.1×100mm,3.5μm)，柱温25°C，流动相A为水，流动相B为乙腈，先后以流动相比例为5%–95%B流动0–20min，95%B流动20–22min，95%-5%B流动22-25min，流速：0.8ml/min；离子源为ESI源，负离子模-1
式，喷雾气（N2）压力350Pa，干燥气（N2）流速10.0L·min ，干燥气温度为350℃，毛细管电压3500V，碎片电压选择120V；质量数扫描范围m/z100～1000；上述条件下得到各待测液（包括空白样本和给药样本）总离子流色谱图；

[0012] （3）用Aglient Metabolite ID软件对空白样本和给药样本总离子流色谱图对比，然后对空白样本和给药样本总离子流色谱图提取离子与二级碎片进行对比鉴定，得到岩白菜素M0(m/z,327.07)，三种代谢产物M1(m/z,503.11),M2(m/z,407.03)和M3(m/z,359.09)；

[0013] （4）对比分析M1、M2、M3与岩白菜素的二级碎片得出岩白菜素在动物体内代谢产物为葡糖醛酸结合产物，硫酸结合产物，水解和甲基结合产物。

[0014] 所述的动物体指哺乳动物。

[0015] 本发明首次建立一种灵敏度高，特异性强，方便可行的HPLC/Q-TOF MS/MS（高效液相色谱/四极杆-飞行时间/串联质谱）法并成功测定到动物体内岩白菜素的代谢产物，并在此基础上分析出其可能代谢途径，对进一步的体内药物代谢动力学研究和临床指导合理用药具有重要意义，也为进一步开发利用岩白菜素类药物提供了可靠基础。

附图说明

[0016] 图1为空白与给药胆汁样本岩白菜素及各代谢产物的提取离子色谱图；

[0017] 图2为空白与给药血浆样本岩白菜素及各代谢产物的提取离子色谱图；

[0018] 图3为空白与给药尿液样本岩白菜素及各代谢产物的提取离子色谱图；

[0019] 图4为空白与给药粪便样本岩白菜素及各代谢产物的提取离子色谱图；

[0020] 图5为岩白菜素的二级碎片裂解过程；

[0021] 图6为岩白菜素及其代谢产物的主要二级碎片离子质谱图，A:M0,B:M3,C:M1,t=0.9min,D:M1,t=1.3min,E:M2,t=0.9min,F:M2,t=1.3min；

[0022] 图7为M1二级碎片裂解过程；

[0023] 图8为M2二级碎片裂解过程；

[0024] 图9为M3二级碎片裂解过程；

[0025] 图10为大鼠体内岩白菜素的代谢途径。

具体实施方式

[0026] 下面结合附图对本发明做进一步详细说明。

[0027] 待测液的制备：

[0028] 岩白菜素标准品由上海玉森新药开发有限公司提供，岩白菜素原料药由陕西森弗高科实业有限公司提供，乙腈购于美国J.T.BAKER公司，实验用水购于杭州哇哈哈有限公司，10%水合氯醛购于山东大学齐鲁医院。18只Wistar大鼠（180-220g）购于山东大学动物中心，实验前12h禁食禁水。

[0029] 18只大鼠随机分为3组，分别灌胃给予250mg/kg岩白菜素原料药混悬液。

[0030] 第一组大鼠饲养于代谢笼中，于给药前12h和给药后12h内收集尿液和粪便。

[0031] 第二组用于收集胆汁，10%水合氯醛(0.4ml/100g,ip)麻醉后，将大鼠固定在木板上，分离胆总管进行胆管插管后收集给药前2h和给药后6h内的胆汁。

[0032] 第三组用于收集血浆，于给药前和给药后10min,20min,30min,1h,2h,3h,4h,6h,8h颈静脉窦取血0.8mL,放于含肝素的离心管中，5000rpm，10min离心后收集血浆，实验结束后将所有血浆收集到一起，备用。

[0033] 尿液、胆汁和血浆样本放于-20°C冰箱内备测，粪便在室温烘干磨碎后放于-20°C冰箱内备测。

[0034] 实施例1

[0035] 岩白菜素在动物体内代谢产物的测定方法：

[0036] （1）取300μL给药血浆、尿液和胆汁和未给药的空白样，分别加入乙腈2mL，涡旋混合2min，10800rpm离心5min，取上清液，40°C水浴氮气吹干后，100μL乙腈复溶，取10μL进样。

[0037] 称取500mg粪便，加入4mL乙腈，涡旋3min后混悬液超声1h，5000rpm离心10min，分离获得上清液(I)；剩余下层另加入4mL乙腈，重复上述步骤获得上清液(II)。混合上清液(I)和(II)，40°C水浴氮气吹干后，200μL乙腈复溶，取10μL进样。

[0038] （2）将上述制备的各待测液（包括空白样本及给药样本）分别取10μL进样，HPLC/Q-TOF MS/MS（Agilent 6538 QTOF-1200 HPLC，美国安捷伦仪器公司）进行分析，色谱柱为ZORBAX Eclipse Plus C18 column(2.1×100mm,3.5μm)，柱温25°C，流动相A为水，流动相B为乙腈，先后以流动相比例为5%–95%B流动0–20min，95%B流动20–22min，95%-5%B流动22-25min，流速：0.8ml/min，每个样本进样前流动相平衡10min；。

[0039] 离子源为ESI源，负离子模式，喷雾气（N2）压力350Pa，干燥气（N2）流速-110.0L·min ，干燥气温度为350℃，毛细管电压3500V，碎片电压选择120V，质量数扫描范围m/z100～1000。

[0040] 上述条件下得到各待测液（空白样本和给药样本）的总离子流色谱图[0041] （3）通过Aglient Metabolite ID软件（代谢物鉴定软件，美国安捷伦仪器公司）对空白样本和给药样本总离子流色谱图对比，然后对空白样本和给药样本总离子流色谱图提取离子与二级碎片进行对比鉴定代谢产物，发现岩白菜素(M0)(m/z,327.07)及其三种代谢产物M1(m/z,503.11),M2(m/z,407.03)和M3(m/z,359.09)（表1）。

[0042] 表1灌胃给药后大鼠胆汁、血浆、尿液和粪便中检测的岩白菜素代谢产物[0043]胆汁 血浆 尿液 粪便
M1 + - + +
M2 + - + +
M3 + + + +

[0044] 图1-4不同基质中空白样本与给药样本岩白菜素及三种代谢产物的提取离子色谱图

[0045] （4）对比M1、M2、M3与岩白菜素的二级碎片：

[0046] 进样500ng/mL的岩白菜素标准溶液，获得其主要二级碎片，主要二级碎片见表2及图6。主要母离子m/z为327.0722(C14H16O9).二级碎片m/z 312.0491(C13H13O9)为母离子去掉一个CH3.二级碎片m/z 249.0407(C12H10O6)为母离子去掉一个C2H6O3.二级碎片m/z234.0169(C11H7O6),207.0295(C10H8O5)及192.0061(C9H5O5)分别为母离子去掉C3H9O3,C4H8O4,and C5H11O4.岩白菜素的二级碎片裂解过程见图5。

[0047] 表2LC/Q-TOF-MS/MS负离子模式下的岩白菜素及其代谢产物的鉴定结果[0048]

[0049] 代谢产物M1 M1[M-H]-为m/z 503.10684，比岩白菜素增加了176。M1的二级碎片为m/z 327.0695,312.0597,249.0369,207.0312,192.0036,和113.0239（图6和表2）。m/z312.0597,249.0369,234.0175,207.0312,192.0036碎片为岩白菜素的二级碎片。M1和岩白菜素质合比相差176，正好是葡糖醛酸的分子量。M1裂解途径见图7。未发现双葡糖醛酸结合产物。在胆汁样本中，保留时间为0.9min和1.3min时均发现了M1代谢产物，其二级碎片图显示具有相同的二级碎片，提示M1由于结合位点不同可能存在同分异构体。

[0050] M2 M2[M-H]-为m/z 407.02961，与岩白菜素相比正好相差一个SO3-基团80Dalton，其二级碎片m/z 312.0500,249.0382,234.0168,207.0282,and 192.0050与岩白菜素相似，因此分析M2可能是岩白菜素单硫酸结合产物。M2裂解过程见图8。

[0051] 在胆汁样本中，M2同M1，在保留时间0.9min和1.3min均发现了M2代谢产物，其二级碎片图显示具有相同的二级碎片，提示M2由于结合位点不同可能存在同分异构体。

[0052] M3 M3[M-H]-为m/z 359.0983(C15H20O10)，与岩 白菜素相差32Dalton(O2 or H2O+CH2)，M3的二级碎片m/z 344.0764,239.0568and 224.0331比岩白菜素二级碎片m/z312.0491,207.0295and 192.0061多32Dalton，此结果显示代谢发生在内酯环上，分析可能是内酯环水解及甲基化。二级碎片m/z 211.0240和196.0376进一步验证了此结果。M3裂解过程见图9。

[0053] 通过岩白菜素代谢产物的结构验证，其代谢途径见图10，包括葡糖醛酸结合产物，硫酸结合产物，水解和甲基结合产物。