一种粒细胞集落刺激因子与聚乙二醇的共轭物

摘要

本发明涉及药物制剂和药物，即，涉及具有通式(I)的粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的新的生理活性的共轭物：其中：n为681到1000的整数；m为≥4的整数；NαH-G-CSF为具有G-CSF活性的天然或重组多肽。本发明还涉及含有所要求的通式(I)共轭物的药物，药物组合物，通式(I)共轭物在以粒细胞集落刺激因子作为活性成分用于预防或/和治疗中性粒细胞减少症的药物中的应用，含有药物组合物的容器。

权利要求

1.一种人粒细胞集落刺激因子与聚乙二醇的共轭物，其特征在于，具有如下结构式(I)：其中：

n为681到1000的整数；

m为＝4的整数；

a

NH-G-CSF为具有G-CSF活性的天然或重组多肽；

其中的N-末端基团是甲硫氨酸残基(Met)；其中聚乙二醇的平均分子量是从30到

40kDa。

2.根据权利要求1所述的共轭物，其特征在于：其中聚乙二醇的分子量是30kDa。

3.一种药物组合物，其特征在于：具有相应于粒细胞集落刺激因子的活性，含有有效量的权利要求1所述的共轭物和药学可接受的辅料。

4.权利要求3所述的药物组合物用于制备治疗中性粒细胞减少症的药物用途。

5.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于：含有有效量的权利要求1所述的共轭物、吐温、甘露醇、三水乙酸钠、醋酸和注射用水。

6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于：其中的pH值是3到5。

7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于：其中的pH值为4。

8.一种药用试剂，其特征在于：具有相应于粒细胞集落刺激因子的活性，含有权利要求1所述的共轭物。

9.权利要求8所述的药用试剂用于制备治疗中性粒细胞减少症的药物用途。

10.一种权利要求1所述共轭物的用途，其特征在于：用于制备具有相应于粒细胞集落刺激因子活性的药用试剂。

11.一种在无菌环境下密封的含有权利要求3-7中任一项所述的药物组合物的容器。

12.根据权利要求11所述的容器，其特征在于：所述容器是玻璃瓶或自动注射器。

13.一种试剂盒，其特征在于：包括权利要求11所述的容器和处方信息。

说明书

一种粒细胞集落刺激因子与聚乙二醇的共轭物

技术领域

[0001] 本发明涉及药物制剂和药物，即，涉及粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的新的生理活性的共轭物(conjugates)，尤其涉及G-CSF与聚乙二醇的新的共轭物，其适于医药用途，例如，适于治疗白细胞减少，主要是接受骨髓抑制剂化疗的病人、接受造血干细胞移植的病人、患有慢性中性粒细胞减少症的病人以及患有AIDS和其它感染的病人中的各种中性粒细胞减少症。

背景技术

[0002] G-CSF是一种造血生长因子，其刺激粒细胞的增殖、分化和成熟(Metcalf,1992)。外源G-CSF的介入导致外周血中性粒细胞迅速、特异性、剂量依赖性的增加(Welte等人,1985;Hartung等人,1995)。

[0003] 在细菌和哺乳动物细胞中克隆并表达了人G-CSF基因；由此，开发和纯化了多种不同的重组人G-CSF(rhG-CSF)变体(Nagata等人,1986;Souza等人,1986;Komatsu等人,1987)。

[0004] 有两种rhG-CSF的变体-非格司亭和来诺拉提，分别来自E.coli和CHO细胞。非格司亭由175个氨基酸组成，其是非糖基化的，并且与天然蛋白质的氨基酸序列相同，但在分子的N-末端含有一个额外的甲硫氨酸残基。来诺拉提由174个氨基酸组成，其是糖基化的，并且其氨基酸序列与天然人G-CSF完全一致。

[0005] 不同的rhG-CSF产品在糖基化和/或蛋白质序列上有所不同，其可用于临床上治疗化疗后的中性粒细胞减少症，自发性、先天性和周期性的中性粒细胞减少症；可以与抗生素联合或在中性白细胞减少的AIDS病人中用于治疗严重感染(Molineux,2004)。

[0006] 但是，rhG-CSF的临床应用已被限制，由于其快速被皮下注射位点所吸收，对蛋白水解不稳定，分布容量大，快速消除、并具有很短的血清半衰期(Mashkovsky,2006;de Wit等人,1996)。

[0007] 因此，rhG-CSF必须通过每日注射的方式施用于病人才能获得最佳效果。并且要每日监控全外周白细胞计数。

[0008] 可以通过使用具有更长久活性的药物形式来改进G-CSF的疗效，其中天然蛋白分子以化学方法连接到单甲氧基聚乙二醇(mPEG)。G-CSF的聚乙二醇化改进了药代动力学特性，增加了半衰期，减少了消除，降低了血液中的浓度波动，降低了免疫原性和毒性，增加了体内活性并增强了稳定性(Molineux,2003;Molineux,2004)。

[0009] PEG-G-CSF共轭物的生物学特性很大程度上取决于分子量和使用的活化的mPEG的种类。活化的PEGs的活性官能团可以被附着于蛋白质的特定位点，主要是在一种胺、巯基或其他亲核的基团上。在大多数情况下，优选的修饰位点是赖氨酸的氨基基团和多肽链的N-末端(Kinstler等人，1996,Roberts等人,2002)。大范围的mPEG衍生物已被用于胺的聚乙二醇化，例如：PEG-三嗪、PEG-琥珀酰亚氨基碳酸酯,PEG-琥珀酰亚胺琥珀酸,PEG三氟乙基磺酸酯,PEG-乙醛,PEG-N-羟基琥珀酰亚胺-活性酯,等)。

[0010] 已有数种已知的PEG-G-CSF共轭物。

[0011] 美国专利US2007/0014762描述了PEG-G-CSF共轭物的生产，使用不同的具有5000Da分子量的活化mPEG，特别是mPEG-琥珀酰亚胺基丁醇，mPEG-琥珀酰亚胺基丙酸，mPEG-琥珀酰亚胺基a-甲基丁醇。要获得共轭物，使用了来源于CHO细胞的rhG-CSF，其含有数个不同位点的氨基酸取代。偶联反应在pH7～9下进行。生成的PEG-G-CSF共轭物由数个位点异构体组成；每个异构体由赖氨酸残基的ε氨基基团和N-氨基酸的α氨基基团与一个PEG5000在不同的位点偶联。PEG-G-CSF共轭物在SP-琼脂糖柱上通过离子交换色谱纯化。

[0012] 该专利中没有关于获得的共轭物的活性和纯度数据。

[0013] 生成的共轭物的缺点如下：

[0014] 1、偶联到G-CSF的mPEG分子量小；

[0015] 2、形成数种位点异构体，其中PEG通过不同的赖氨酸残基和N-末端氨基酸的自由氨基基团被偶联到G-CSF分子；

[0016] 欧洲专利EP0401384描述了PEG-G-CSF共轭物，其使用分子量为4,500～10,000Da的线性和分支结构的mPEG，通过不同的活性基团(琥珀酰亚胺琥珀酸,氯-s-三嗪,聚氧乙烯二氨)激活而得到。这些PEG-G-CSF共轭物在体内有更长时间的效果，延长的程度取决于偶联的PEG的分子量。具有PEG10000和未改性G-CSF的PEG-G-CSF共轭物的半衰期分别为7.05和1.79小时。

[0017] 产生的共轭物的缺点是：

[0018] 琥珀酰亚胺琥珀酸-PEG通过mPEG与琥珀酸酐反应，随后将羧酸激活形成琥珀酰亚胺酯而制备。该多聚体的骨架含有第二个酯链，其在与一种蛋白质发生偶联反应后保留。该酯链在多聚体被附着于蛋白质后高度易水解。这种水解不但导致PEG附着的减少，而且水解后保留与蛋白质上的琥珀酸酯标签可作为半抗原起作用，并导致剩余蛋白的免疫原性(Roberts,2002)。

[0019] 1、氯-s-三嗪mPEG衍生物能够与赖氨酸和半胱氨酸残基的官能团发生偶联，其导致许多异构体的出现，其中有一些的特征是具有不稳定的键。并且，由于具有高毒性，目前三嗪mPEG衍生物并未得到应用(Veronese&Pasut,2005)。

[0020] 欧洲专利EP0335423描述了G-CSF与具有300～30000Da的分子量的三嗪mPEG的衍生物的共轭物。这些PEG-G-CSF共轭物具有更长时间的活性，其特异活性是未修饰的G-G-CSF活性的11%到60%。

[0021] 产生的共轭物的缺点是：

[0022] 1、低特异活性；

[0023] 2、使用mPEG-三嗪的衍生物，产生了大量的位点异构体，其中一些的特征是具有不稳定的键。并且，由于具有高毒性，目前mPEG-三嗪衍生物并未得到应用(Veronese&Pasut,2005)。

[0024] 作为本发明的原型，选择一种描述与美国专利US5,824,784实施例2的PEG-G-CSF共轭物。该专利描述了来源于E.coli的rhG-CSF与具有6,000到25000分子量的线性mPEG的还原烷基化反应，所述mPEG具有活化的丙醛基(ALD-mPEG)。聚乙二醇化反应在pH5下进行。在酸性条件下，乙醛对N-末端α-胺具有很大程度的选择性，这是由于α-胺与其他亲核物质相比具有更低的pK值。乙醛偶联是通过希夫碱进行原位还原以获得稳定的仲胺健(Kinstler等人,1996)。

[0025] 用PEG20kDa对rhG-CSF的N-末端聚乙二醇化的这种制备方法被用于开发聚乙二醇非格司亭("Neulasta")，用于治疗和预防不同的中性白细胞减少症状。

[0026] 单-mPEG-G-CSF共轭物通过使用SP琼脂糖凝胶HP柱的离子交换色谱进行分离。产生的纯化PEG-G-CSF共轭物的生物活性为天然G-CSF活性的68%。产生的共轭物中未修饰的G-CSF的含量不超过5%。该共轭物的药代动力学参数比未修饰的G-CSF更好。动物实验已表明，PEG-G-CSF共轭物的注射导致白细胞计数的增加，该PEG-G-CSF共轭物相对于未修饰的G-CSF延长了有效期。当使用单剂量的G-CSF PEG-共轭物，动物白细胞的含量在注射1天后达到最大值，该水平在当天保持稳定，随后在注射4天后白细胞的水平降低到基线水平。随着未修饰G-CSF的注射，在注射1天后可观察到动物血液中的粒细胞的最高水平，随后粒细胞含量迅速下降。

[0027] 产生的共轭物的缺点：

[0028] 1、获得的共轭物的特异活性低（未修饰的G-CSF活性的68%）；

[0029] 2、在共轭物中存在未修饰的G-CSF。

发明内容

[0030] 本发明的目的是获得一种新的稳定的高度纯化的聚乙二醇化G-CSF共轭物，其具有高活性，更长的有效期，提高的稳定性，改进的药代动力学参数，具有理想的PEG分子量与特异活性的参数组合，具有高纯度且适于医用，以及基于要求保护的共轭物的适于药用的组合物。

[0031] 问题的解决是通过创造一种新的PEG-G-CSF的功能性活性分子，其具有G-CSF活性，其中具有30000Da分子量的线性PEG分子与G-CSF严格通过N-末端氨基酸（甲硫氨酸，methionine）的α氨基形成稳定的键而偶联，产生具有如下通式(I)的化合物：

[0032]

[0033] 其中：

[0034] n为681到1000的整数；

[0035] m为≥4的整数；

[0036] NαH-G-CSF为具有G-CSF活性的天然或重组多肽。

[0037] 在衍生的共轭物中，具有30000～40000Da分子量的线性PEG偶联到G-CSF分子的N-末端氨基酸的α氨基上。

[0038] 通过α氨基N-末端氨基酸修饰G-CSF的选择性是通过使用具有通式(II)的乙醛-活化的mPEG及在pH≤5条件下进行聚乙二醇化反应实现：

[0039]

[0040] n为681到1000的整数；PEG的分子量是大约30000-40000Da；

[0041] m为≥4的整数；

[0042] PEG分子量与特异性G-CSF活性的最优比是通过使用m值≥4的活性mPEG(II)实现，其使得要求保护的共轭物与受体产生更有效的相互作用，从而获得更高的生物活性。通过增加附着的PEG的分子量实现了免疫原性和毒性的降低，改善了药代动力学参数。与原型相比，本发明的新特性在于：

[0043] 1、活性mPEG(通式II)的乙醛衍生物用于生产要求保护的PEG-G-CSF；

[0044] 2、PEG-G-CSF共轭物的结构式是新颖的；

[0045] 3、PEG-IFN共轭物的分子量由于PEG的重量而增加；

[0046] 4、特异活性水平更高；

[0047] 5、药代动力学参数得到改善。

[0048] 要求保护的PEG-G-CSF共轭物是高度纯化的，具有延长的有效期，其特性是具有高特异性生物活性（至少是未修饰的G-CSF活性的84～94%），蛋白质纯度≥97%，热稳定性高，对蛋白降解酶的抗性增强，药代动力学参数得到改善。

[0049] 本发明也包括含有有效量、作为活性成分的所要求保护的PEG-G-CSF共轭物的药物组合物。这些组合物也可包括药学可接受的载体，缓冲剂（有机和无机酸及其盐，例如柠檬酸盐，琥珀酸盐，酒石酸盐，延胡索酸，葡糖酸盐，草酸盐，乳酸盐，醋酸盐的缓冲液），稳定剂（糖醇，氨基酸，有机糖或糖醇，肌糖，聚乙二醇，氨基酸多聚体，硫-还原剂（例如尿素，谷胱甘肽，硫代甘油等），具有低分子量蛋白质的多肽（例如人血清白蛋白，免疫球蛋白），亲水聚合物（例如聚乙烯吡咯烷酮），单糖（例如甘露糖，木糖，果糖，葡萄糖），双糖（例如乳糖，麦芽糖，蔗糖），三糖（例如棉子糖），和多糖（例如葡聚糖）），防腐剂(石碳酸，苯甲醇，间甲酚，对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸丙酯，十八烷基二甲基苯甲基氯化铵，苯甲烃铵，卤化物，烷基对羟苯甲酸酯)，抗氧化剂（甲硫氨酸，维生素E，维生素C)，等渗剂(糖醇，氯化钠，山梨(糖)醇,甘露醇,阿(拉伯)糖醇，木糖醇等)，非离子型表面活性剂和去污剂(多山醇酯，多元醇，吐温)，共溶剂，赋形剂(淀粉)，螯合剂(例如，EDTA)。这些药物组合物可以以不同的形式应用，例如，冻干物或液体形式（注射液、喷雾剂、滴剂等）。

[0050] 本发明也包括基于要求保护的共轭物的药物，特别是，用于治疗中性粒细胞减少症的药物。

[0051] 要求保护的聚乙二醇化的G-CSF及基于其的药物组合物和医用产品可用于治疗发生于化疗后的中性粒细胞减少症，以增强对骨髓移植中免疫抑制药物的耐受性，以改善AIDS和其他感染患者的免疫状况，尤其是系统性或获得性念珠菌病。

[0052] 式(I)的共轭物，伴随一种任意的药学可接受的赋形剂，稀释剂和/或药学可接受的辅料，可以通过静脉、皮下、肌内或其他适宜的方式给药。给药途径的不同取决于，例如，症状和年龄，给药次数和注射间隔取决于疾病及其严重性或给药的目的（治疗性或预防性用途），PEG-G-CSF剂的有效剂量根据前述因素选择。

[0053] 为获得要求保护的共轭物PEG-G-CSF，使用了高度纯化的重组人G-CSF（非格司亭，由CJSC"Biocad"公司生产）以及式(II)的具有30000～40000Da分子量的丁醛活化的mPEG衍生物。

[0054] 偶联反应是在pH低于5.0、温度≤20℃并存在还原剂的条件下进行。PEG/蛋白的摩尔比为2.5～5/1。反应过程通过RP-HPLC和在还原条件下的SDS-PAGE来监测。单PEG-G-CSF(每个G-CSF分子具有单一PEG链)通过离子交换色谱从反应产物(未修饰的G-CSF和每个蛋白分子含有两个或更多的PEG链的非期望形式的PEG-G-CSF)中纯化分离。单PEG-IFN共轭物的洗脱通过线性浓度梯度（从0.05到0.2M）且pH低于5的氯化钠缓冲液进行。纯化的单PEG-G-CSF在pH4～5的10～50mM的缓冲液中进行透析，缓冲液中加入盐，或多糖，或醇，或聚乙烯吡咯烷酮，或单糖，和氨基糖，或蛋白质，或氨基酸，和非离子化去污剂，并在4±2℃存储于表面硅化处理的塑料或玻璃瓶中。

[0055] 为表征产生的单PEG-G-CSF共轭物的纯度，均一性，物-化，生物学和药代动力学参数，研究了其与未修饰的G-CSF的比较结果。

附图说明

[0056] 本发明通过如下附图来阐明：

[0057] 图1为G-CSF聚乙二醇化的动力学；

[0058] 图2为PEG-G-CSF共轭物的反相高效液相色谱(RP-HPLC)；

[0059] 图3为PEG-G-CSF共轭物的体积排阻高效液相色谱(SEC-HPLC)；

[0060] 图4为PEG-G-CSF共轭物（道1）和未修饰的G-CSF（道2）的SDS-PAGE分析；

[0061] 图5为未修饰的G-CSF(A)和PEG-G-CSF共轭物(B)的MALDI质谱；

[0062] 图6为G-CSF(A)和PEG-G-CSF共轭物(B)的胰蛋白酶肽的质谱比较；

[0063] 图7为在(50±2)℃下PEG-G-CSF共轭物和未修饰的G-CSF的热稳定性；

[0064] 图8为PEG-G-CSF共轭物和未修饰的G-CSF的蛋白水解稳定性；

[0065] 图9为PEG-G-CSF共轭物和未修饰的G-CSF的免疫反应性；

[0066] 图10为PEG-G-CSF共轭物和未修饰的G-CSF的药代动力学。

具体实施方式

[0067] PEG-G-CSF生产方法的具体操作以及研究其性质的例子如下。

[0068] 实施例1：制备重组人G-CSF(rhG-CSF,非格司亭)

[0069] 如专利RU2278870中描述的方法分离和纯化rhG-CSF。

[0070] 实施例2：制备聚乙二醇化rhG-CSF

[0071] 将50mL1M的氰基硼氢化钠溶液加入2300mL缓冲液（50mM醋酸钠，pH5.0±0.2），含有2500mg纯化的rhG-CSF，根据实施例1的方法制备。将混合物搅拌，随后添加平均分子量为30kDa的固体mPEG-ButyrALD(甲氧基-PEG-丁醛)10克。将偶联反应混合物在(20±2)℃下搅拌22小时。经过不同的时间间隔，从反应混合物中取出50微升样品，使用SDS-PAGE在12.5%凝胶上在还原条件下分析PEG-G-CSF共轭物形成的动力学。为此，想选择的样品中加入含有125mM Tris-HC1,pH6.8,20%甘油,3%SDS,15%2-巯基乙醇,0.005%溴酚蓝的缓冲液17微升，在沸水浴中加热3分钟。向每个孔中载入体积为5微升的样品。使用伯乐小型垂直电泳槽(mini Protean System(BioRad))进行SDS-PAGE。凝胶用考马斯R-250(Coomassie R-250)染色。G-CSF聚乙二醇化的动力学显示于图1。当PEG-G-CSF的含量大于70%的时候，用pH4.8±0.2的10mM乙酸钠缓冲液将反应混合物稀释3倍。

[0072] 实施例3：单PEG-G-CSF共轭物纯化

[0073] 将根据实施例2制备的稀释反应混合物上柱，该柱装有300mL CM-琼脂糖并用pH4.8的10mM乙酸钠缓冲液（缓冲液A）平衡，流速为10mL/分钟。将物料上柱后，用1500mL缓冲液A洗脱除去非结合物料。使用线性梯度0～0.2M的溶于缓冲液A(6000mL)的NaCl将单PEG-G-CSF由柱上洗脱下来，流速为5mL/分钟。收集馏分(50mL)，在280和260纳米波长下进行吸光度检测。含有蛋白的馏分通过RP-HPLC和如实施例2中描述的SDS-PAGE进行分析。含有纯度大于95%的单聚乙二醇化G-CSF的馏分，用10倍体积的pH4.0±0.2的1.6mM乙酸钠缓冲液进行透析。随后进行过滤除菌并将样品储存在4±2℃。

[0074] 实施例4：通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)对PEG-G-CSF共轭物进行纯度分析[0075] 纯化的PEG-G-CSF共轭物根据实施例3制备，用20mM、pH5.0的乙酸钠缓冲液将其稀释到蛋白浓度为0.3mg/mL。进行RP HPLC分析，使用梯度Waters'Breeze'色谱仪、C4对称柱(4.6×150mm)、UV检测波长为214nm。将100微升获得的样品注射到柱中。单PEG-G-CSF通过RP-HPLC(图2)显示，其由柱上洗脱并产生单独的对称峰，由于在主UV-吸收峰之前或之后只存在较少的杂质(图2)，将其鉴定为是高度纯化的。杂质的含量少于洗脱主峰的1.15%。因此，由表现出来的数据可以推断，根据RP-HPLC，要求保护的PEG-G-CSF共轭物的纯度≥98%。

[0076] 实施例5：通过体积排阻高效液相色谱(SEC-HPLC)对PEG-G-CSF共轭物进行纯度分析

[0077] 纯化的PEG-G-CSF共轭物根据实施例3制备，用20mM、pH5.0的乙酸钠缓冲液将其稀释到蛋白浓度为0.3mg/mL。进行SEC-HPLC分析，使用Waters'Breeze'色谱仪、TSKG3000SWX柱(30cm×7.8mm)、UV检测波长为214nm。将100微升获得的样品注射到柱中。SEC-HPLC的结果显示于图3。可以观察到由柱上洗脱的PEG-G-CSF样品是分离的对称峰，组成98.47%。由图3的结果，显示出要求保护的PEG-G-CSF共轭物不含有未修饰的G-CSF。在共轭物中的高分子量聚集物的含量不超过1.53%。根据SEC-HPLC测得所要求保护的PEG-G-CSF共轭物的纯度大于98%。

[0078] 实施例6：测定PEG-G-CSF共轭物中的内毒素水平

[0079] 由实施例3制备的PEG-G-CSF共轭物样品中的细菌内毒素(BE)的含量，使用Limulus Amebocyte Lysate(LAL)方法（对凝胶块测试进行修正）进行体外检测，与FFS42-0002-00的要求一致。LAL测试中使用一种多组分诊断试剂盒（ACC公司，Associates of CAPE COD,Inc.），敏感性为0.03EU/mL的LAL-试剂 内毒素参比标准
(CSE,每支0.5mg)和水。表1中的结果显示出PEG-G-CSF共轭物样品中的BE含量少于每毫克蛋白3EU(内毒素单位)，该数值比基于重组蛋白药物允许的BE水平低很多。

[0080] 表1.PEG-G-CSF共轭物中的细菌内毒素含量

[0081]PEG-G-CSF共轭物 细菌内毒素含量（EU/mg蛋白）
PEG-G-CSF，按实施例3获得 ≤3.0

[0082] 实施例7：通过SDS-PAGE进行PEG-G-CSF共轭物的纯度分析

[0083] 对实施例3纯化获得的PEG-G-CSF共轭物样品按实施例2中的描述进行SDS-PAGE分析。含有40微克PEG-G-CSF和未修饰的G-CSF的样品被载入每个孔中。凝胶用考马斯R-250染色。图4表明PEG-G-CSF（道1）和未修饰的G-CSF（道2）的SDS-PAGE分布。纯化的PEG-G-CSF显示为单一的扩散带，分子量明显高于未修饰的G-CSF。值得注意的是，聚乙二醇化蛋白的确切分子量不能通过SDS-PAGE测定，这是因为亲水的PEG分子与蛋白质的偶联增加了聚乙二醇化蛋白质的斯托克斯半径。结果，PEG-蛋白质复合物在凝胶中的电泳迁移率减慢，并且其分子量值比未修饰的蛋白质和PEG的分子量之和高很多。

[0084] 实施例8：PEG-G-CSF共轭物相对于未修饰的G-CSF的质谱分子量的测定

[0085] 矩阵辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)被用于测定PEG-G-CSF的真正的分子量。MALDI TOF MS用配备UV激光发射器(Nd)的Ultraflex II(Bruker Daltonics)质谱仪进行。将实施例3制备的1微升PEG-G-CSF共轭物样品和0.3微升2,5-二羟基苯-1甲酸溶液(Aldrich,10mg×ml 溶于20%的乙腈水溶液中，其中含有0.5%三氟乙酸（TFA）)混合并在空气中干燥。用同样的方法制备未修饰的G-CSF样品。

[0086] 在正模式MS谱中获得质谱图，平均最大误差不超过10～15Da。

[0087] 图5显示了m/z10000～50000范围内的未修饰的G-CSF和PEG-偶联G-CSF的MALDI-TOF质谱。
+

[0088] 图5A显示G-CSF质谱含有相应于单带电离子[M] 的主峰，分子量为18,816Da。

[0089] 在图5B显示的PEG-G-CSF共轭物的质谱中，出现了一个质心大约49600Da的广谱峰。该广谱是由于PEG聚合物种类的异构体。

[0090] 考虑到G-CSF的分子量(19295Da)和PEG的分子量(30000Da)，所得到共轭物的质量与单独分子之和的计算质量极为相符。

[0091] 实施例9：PEG-G-CSF共轭物中的聚乙二醇化位点测定-1

[0092] 将修饰的胰岛素(Promega)溶于0.05M NH4HCO3形成15mcg×ml 浓度的溶液5微升加入5微升实施例3制备的PEG-G-CSF共轭物探针。在37℃下水解16小时，然后向该溶液中加入10微升含有0.5%三氟乙酸（TFA）的10%乙腈水溶液，并充分混合。用同样的方式制备未修饰的G-CSF样品。这些胰蛋白酶消化物通过MALDI-MS分析。

[0093] PEG与G-CSF分子偶联的位点通过比较PEG-G-CSF共轭物和未修饰的G-CSF的胰蛋白酶肽的质谱测定。在PEG-G-CSF共轭物的胰蛋白酶水解物中，没有相应于发生了修饰的蛋白质部分的肽。表2中显示了未修饰的G-CSF和PEG-G-CSF共轭物的实验的胰蛋白酶肽的质谱。此表显示了未修饰的G-CSF胰蛋白酶肽的质谱与PEG-G-CSF共轭物的几乎相同(表2)。但是在PEG-G-CSF共轭物的胰蛋白酶水解物中，没有分子量为1432.7的肽，该肽存在于未修饰的G-CSF的胰蛋白酶水解物中。实验获得的未修饰的G-CSF和PEG-G-CSF共轭物的胰蛋白酶肽的质谱如图6所示，其显示了在PEG-G-CSF共轭物的胰蛋白酶水解物中没有分子量为1432.7的肽。根据G-CSF的胰蛋白酶肽的理论质量分析，在m/z1432.7的峰相应于蛋白质的N-末端肽（表2）。其在PEG-G-CSF共轭物的胰蛋白酶水解物中不存在，与N-末端肽的修饰相吻合，其由于PEG的重量而变得更重，其在所研究的质谱区域之外。PEG与一个G-CSF分子的偶联只发生在N-末端甲硫氨酸的肽-氨基基团的自由氨基上。

[0094] 表2.PEG-G-CSF共轭物与未修饰的G-CSF的胰蛋白酶肽与理论值相比的实验质谱[0095]

[0096] 实施例10：测定PEG-G-CSF特异性共轭物与未修饰的rhG-CSF相比的特异活性[0097] PEG-G-CSF共轭物根据实施例3制备，将其在RPMI培养基中稀释到浓度为0.2ng/mL，待测样品的连续稀释物在测定培养基中制备。未修饰的G-CSF的连续稀释物与G-CSF活性的国际标准(1-st国际标准88/502,粒细胞集落刺激因子,人,来自于rDNA,10000IU/amp)进行平行分析。将100微升被稀释的蛋白样品加入平底96孔板培养皿的测试孔中。5
为进行生物检测，洗涤M-NFS细胞并以1.5×10/mL的浓度重悬浮于RPMI培养基中。将100微升的细胞悬浮液加入每个孔中，平板在37℃下在5%CO2组织培养箱中培养50小时，然后，向每个孔中加入20微升染料Alamar蓝（或类似的，如MTT），平板在相同条件下培养14小时。

[0098] 通过微孔板检测仪（microplate reader）检测545nm and630nm波长下的光密度的增加确定细胞数量的增加。待测样品的特异生物活性(B0)，以IU/mg为单位，通过如下公式计算：

[0099] 其中，B0为PEG-G-CSF或G-CSF的特异生物活性(IU/mg)；

[0100] Ao为PEG-G-CSF或G-CSF的生物活性(IU/ml)；

[0101] C为PEG-G-CSF或G-CSF溶液中的蛋白含量(mg/ml)。

[0102] 表3.PEG-G-CSF和未修饰的G-CSF的特异活性(Specific activity)

[0103]制备物 特异活性（IU/mg）
按实施例3制备的PEG-G-CSF共轭物 （0.845±0.091）×108
未修饰的G-CSF （1.00±0.081）×108

[0104] 实施例11：PEG-G-CSF相对于未修饰的G-CSF的热稳定性分析

[0105] PEG-G-CSF共轭物的样品根据实施例3制备，将其用pH4.0的5mM乙酸钠缓冲液稀释，该缓冲液中含有140mM NaCl，蛋白浓度高达0.28mg/mL，将其置于(50±2)℃的水浴中，在不同的时间间隔通过测量在340nm波长处的吸光度来研究蛋白溶液浊度的出现。类似的，进行未修饰的G-CSF热稳定性的研究。在(50±2)℃温度下培养蛋白质导致形成不溶性聚集物，使得蛋白质溶液的浊度增加，浊度可通过测定在340nm波长下的溶液光密度进行确定。图7显示了研究结果，表明未修饰的G-CSF制备物的浊度随培养时间增加，而PEG-G-CSF制备物在整个观察阶段保持稳定。这些数据暗示着要求保护的PEG-G-CSF共轭物的热稳定性比未修饰的G-CSF高很多。

[0106] 实施例12：PEG-G-CSF相对于未修饰的G-CSF的蛋白水解稳定性

[0107] PEG-G-CSF共轭物的样品根据实施例3制备，将其稀释到浓度为0.6mg/mL，然后向850微升生成的样品中加入150微升的pH8.5的1M Tris-HCl，由此最终的样品pH为7.4。然后加入2微升0.5M CaCl2使终浓度为1mM，搅拌，然后加入15微升胰蛋白酶(Promega,Gold)使终浓度为0.02微克/mL。类似地制备含有未修饰的G-CSF的样品。将样品在37℃下培养。每60分钟取次级样本(100微升)，加入20微升10%SDS以终止胰蛋白酶的反应，并如实施例1的描述进行SDS-PAGE。用考马斯-R-250对电泳凝胶染色后，对染色凝胶进行光密度分析。通过计算机程序GelPro Analyser对该主条带区域进行测定。在初始（未用胰蛋白酶处理）样品中的主条带作为100%。图8显示了用胰蛋白酶处理的PEG-G-CSF共轭物和G-CSF的敏感性数据。表明，随着用胰蛋白酶处理时间的增加，PEG-G-CSF和G-CSF的含量降低，但是所要求保护的PEG-G-CSF共轭物相对于未修饰的G-CSF具有更强的抵抗胰蛋白酶作用。

[0108] 实施例13：PEG-G-CSF共轭物相对于未修饰的G-CSF的免疫反应性

[0109] 要求保护的PEG-G-CSF共轭物的免疫反应性通过抗体结合活性来确定，所述活性通过使用一系列ProCon G-CSF试剂（"Protein contour"LLC）的ELISA检测进行修正。PEG-G-CSF共轭物按实施例3制备，其用10mM pH7.2的Tris-HCl缓冲液，该缓冲液中含有
140mM NaCl和1%牛血清白蛋白，稀释到浓度为1mg/mL。然后将100微升获得的样品加入微孔板的孔中并迅速以抗G-CSF的单克隆抗体包被。在37℃下培养（60分钟）后，将针对独立抗原表位的生物素标记的单克隆抗体加入孔中。由此得到的免疫复合物用辣根过氧化酶标记的链霉菌抗生物素蛋白进行检测。为发生颜色反应，向孔中加入100微升底物溶液（200毫克/mL四甲基联苯胺(Sigma)）和溶有0.1%H2O2的0.05M的pH7.2的TB，直至培养到产生蓝色。通过向孔里引入50微升2M硫酸溶液来终止反应。通过在微孔板检测仪《Multiscan》EX检测在405nm波长下的吸光度来计算结果。类似地研究未修饰的G-CSF的免疫反应性。
未修饰的G-CSF与免疫球蛋白的相互作用被当作100%。从图9中显示的结果，可以看出要求保护的PEG-G-CSF共轭物的免疫反应性是未修饰的G-CSF免疫反应性的25%。

[0110] 实施例14：测定PEG-G-CSF共轭物在储存中的稳定性

[0111] 按实施例3制备样品，用1.6mM pH4.0±0.2的乙酸钠缓冲液稀释到1mg/mL。从稀释的样品中取等分部分并置于带盖的灭菌试管中，典型的是"Eppendorf'管。将其储存在(6±2)℃下。在不同储存时间间隔下测定PEG-G-CSF共轭物的特异活性(Specific activity)和均一性(homogeneity)。PEG-G-CSF的均一性使用分别在实施例1和实施例5中描述的SDS-PAGE和SEC-HPLC进行分析。

[0112] 表4显示了PEG-G-CSF共轭物在(6±2)℃下可以稳定储存至少24个月。

[0113] 表4所要求保护的PEG-G-CSF共轭物在(6±2)℃下的稳定性

[0114]

[0115] 实施例15：PEG-G-CSF共轭物的药代动力学分析

[0116] 按实施例3制备一个PEG-IFN共轭物的5毫克样品，将其腹膜内注射到ICR系列的20g雄性小鼠中。作为平行实验，另一组小鼠注射了未修饰的G-CSF。在注射后的不同时间，通过后眼窝穿刺提取血样。通过标准方法获得血清。

[0117] 用于测量天然或单聚乙二醇化G-CSF的血清样品与针对人G-CSF不同抗原表位的小鼠单克隆免疫球蛋白一起用于ELISA检测。

[0118] 微量滴定板的孔用抗G-CSF单克隆抗体(250ng/孔，溶于100微升20mM Tris-HCl缓冲液(TB),pH9.0)包被。在4℃培养过夜后，将200微升含有1%牛血清白蛋白(BSA)和0.05%的吐温-20、pH7.4的TB加入孔里以阻断非特异性结合位点。

[0119] 然后向孔里加入100微升待分析的血清，该血清用含有1%BSA和0.05%吐温-20的TB稀释，稀释比率是1:2，1:4和1:8。为进行平行试验以获得标准校正曲线，将在25ng/mL到600ng/mL已知浓度的溶于缓冲液TB的PEG-G-CSF样品加入孔中，缓冲液TB中含有1%BSA和0.05%吐温-20。在37℃培养1小时后，将一种生物素化的抗人G-CSF单克隆抗体与链霉菌抗生物素蛋白－过氧化酶(streptavidin-peroxidase)的共轭物连续的加入孔中。培养以及洗去所有未结合的酶后，加入100微升的底物溶液(100mM乙酸钠缓冲液，pH5.0，含有0.015%过氧化氢和0.2mg/ml四甲基联苯胺)，以诱导显色反应产物。通过加入2M H2SO4以终止反应。用微孔板检测仪检测在450nm波长下的光密度。使用校正曲线来测定血清中G-CSF的浓度，同时考虑所研究血清的稀释因素。

[0120] 使用已知天然G-CSF浓度(范围在6.25ng/mL到200ng/mL之间，在含有1%BSA和0.05%吐温-20的TB缓冲液中)建立的校正曲线用于分析未修饰的G-CSF的药代动力学。

[0121] 所要求保护的PEG-G-CSF的药代动力学与未修饰的G-CSF相比较的结果显示在图10中。由图10结果可知，所要求保护的PEG-G-CSF共轭物具有显著延长的有效期。随着未修饰的G-CSF的注射，其在动物血液中的浓度在注射1小时候达到最大值并随后迅速下降。随着PEG-IFN共轭物的注射，在6小时后观察到动物血液中G-CSF浓度达到最大值（图10），随后可观察到G-CSF在血液中缓慢减少达140小时。基于该结果（图10），计算了所要求保护的PEG-G-CSF共轭物的主要药代动力学参数。结果显示，注射位点的吸光度、分布容量和PEG-G-CSF共轭物的清除与未修饰的G-CSF相比均明显的缓慢，使得所要求保护的PEG-G-CSF共轭物在血液中长期循环（超过140小时）。

[0122] 实施例16：所要求保护的PEG-G-CSF共轭物与在原型方法中描述的PEG-G-CSF共轭物的特性比较

[0123] 将按照实施例3获得的所要求保护的PEG-G-CSF共轭物的结构、基本物理化学和药代动力学参数与按原型方法获得的PEG-G-CSF共轭物进行比较（表5）。表5中的数据显示，所要求保护的PEG-G-CSF共轭物与按原型方法得到的共轭物相比具有显著改善的特性。

[0124] 表5所要求保护的PEG-G-CSF共轭物与在原型方法(专利US5,824,784)中描述的PEG-G-CSF共轭物的物理化学和药代动力学参数的比较

[0125]

[0126] *表示由原型方法获得的PEG-G-CSF共轭物结构式,《WHO药物信息)),2002,v.16，N.1，102，表47；

[0127] **表示未给出数据。

[0128] 实施例17：用于皮下注射的0.6mg/mL、1.0mg/mL、2.0mg/mL、3.0mg/mL溶液[0129] 作为药物使用的皮下注射溶液含有作为活性成分的聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子(PEG-G-CSF)和附加的药学可接受的组分，并具有如下比率：

[0130] 活性成分：

[0131] 聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子(PEG-G-CSF)0.6～3.0mg

[0132] 赋形剂:

[0133]

[0134] 实施例18：终产品的包装，例如，一种含有按实施例3获得的PEG-G-CSF的水溶液[0135] 装于水解等级I的具有焊接针头、保护帽的中性玻璃注射器中，以保护帽覆盖，塞有注射器柱塞。

[0136] 或者

[0137] 装于水解等级I的中性玻璃瓶中，塞有聚四氟乙烯树脂包被的氟橡胶或盖有铝盖的丁橡胶塞。

[0138] 实施例19：包含药品的一种试剂盒，例如，含有按实施例3获得的PEG-G-CSF作为活性成分的水溶液

[0139] 含有一个具有活塞的注射器，用聚合物薄膜制作的轮廓细胞包装，伴随放置在卡纸板包装中的使用说明书。

[0140] 或者

[0141] 含有一个在聚合物薄膜制作的轮廓泡内的玻璃瓶，伴随有放置在卡纸板包装中的使用说明书。