无菌斑马鱼的生产方法

摘要

本发明公开了一种无菌斑马鱼的生产方法。该方法包括如下步骤：1）将斑马鱼受精卵置于AB-GZM溶液中，于25-29℃培养3-8h；2）用所述AB-GZM溶液漂洗；3）用0.005g/L的聚维酮碘水溶液浸泡1-2min；4）用无菌GZM溶液漂洗；5）用漂白剂漂白10-20min；6）用所述无菌GZM溶液漂洗，漂洗后，将受精卵置于所述无菌GZM溶液中培养，温度为25-29℃，光周期为L10：D14至L14：D10；7）待胚胎孵化后，每天进行所述无菌GZM溶液的半量换液；从孵化后的斑马鱼中获得无菌斑马鱼。本发明通过自然繁殖获得斑马鱼受精卵，最终获得无菌斑马鱼；本发明为研究微生物与斑马鱼之间的相互作用及多生物学进程提供了方便的材料，对进一步研究微生物和其脊椎动物宿主之间关系的内在机制也具有十分重要的参考意义。

权利要求

1.无菌斑马鱼的生产方法，包括如下步骤：

（1）将离体的斑马鱼受精卵置于AB-GZM溶液中，于25-29℃培养3-8h；

（2）将步骤（1）处理后的所述受精卵用所述AB-GZM溶液进行漂洗；

（3）将步骤（2）漂洗后的所述受精卵置于浓度为0.005g/L的聚维酮碘水溶液中，浸泡

1-2min；

（4）将步骤（3）浸泡后的所述受精卵用无菌GZM溶液进行漂洗；

（5）将步骤（4）漂洗后的所述受精卵用漂白剂漂白10-20min；

（6）将步骤（5）漂白后的所述受精卵用所述无菌GZM溶液进行漂洗，漂洗后将所述受精卵置于所述无菌GZM溶液中培养，培养温度为25-29℃，光周期为L10：D14至L14：D10，直至所述受精卵孵化得到幼体鱼；

（7）对所述幼体鱼每天进行所述无菌GZM溶液的半量换液培养，直至所述幼体鱼长成为目的大小的斑马鱼，从所述目的大小的斑马鱼中获得目的无菌斑马鱼；

所述无菌GZM溶液的溶剂为水，溶质为海盐；所述海盐在所述无菌GZM溶液的含量为每升所述无菌GZM溶液中含有60mg所述海盐；

所述AB-GZM溶液的溶剂为水，溶质及其浓度如下：250ng/mL的两性霉素B、5μg/mL的卡那霉素、100μg/mL的氨苄霉素、10U/ml的青霉素、10U/ml的链霉素、59μg/mL的海盐。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述培养的温度为28.5℃；

或

所述培养的时间为4.5h。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述浸泡的时间为1min。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（5）中，所述漂白的时间为15min。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤（6）中，所述培养的温度为28.5℃；

或

所述培养的光周期为L14:D10。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤（6）中，将所述受精卵置于所述无菌GZM溶液中培养，培养密度为每100mL所述无菌GZM溶液中培养40-60个所述受精卵。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤（7）中，从所述目的大小的斑马鱼中获得所述目的无菌斑马鱼的方法包括如下步骤：对已用于培养所述目的大小的斑马鱼的所述无菌GZM溶液进行无菌性检测，经检测无菌的所述无菌GZM溶液中培养的所述目的大小的斑马鱼即为目的无菌斑马鱼。

8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于：在所述方法中，还包括自所述受精卵后第5天对孵化所得斑马鱼进行喂食的步骤；所喂食物为无菌的四膜虫。

9.AB-GZM溶液，其特征在于：所述AB-GZM溶液的溶剂为水，溶质及其浓度如下：250ng/mL的两性霉素B、5μg/mL的卡那霉素、100μg/mL的氨苄霉素、10U/ml的青霉素、10U/ml的链霉素、59μg/mL的海盐。

10.权利要求9所述AB-GZM溶液在生产无菌鱼中的应用，所述无菌鱼为无菌斑马鱼。

说明书

无菌斑马鱼的生产方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种无菌斑马鱼的生产方法。

背景技术

[0002] 在1870年由巴斯德和科赫提出的细菌疾病理论极大的改变了我们的概念化，以及说明了我们与微生物的各种关系。细菌理论研究的成果在医学和公共卫生方面有着意义深远的进步，以及对微生物有一个广泛的概念化，例如病原体。在宿主与微生物相互作用关系中，那种长期以病原体为中心的观点会让我们忽视这一个事实，即动物所遇到的大多数微生物并没有引起明显的疾病，并且可以被认为是与宿主在共生或者互利共生关系的移住民。这些微生物居民包括细菌，古细菌以及真核微生物，其中有许多不能在体外培养。在基因组时代，对非致病的宿主与微生物之间相互作用的研究让我们受益巨大，并让我们对这些微生物群落的组成和能力的认知显著扩增。这项研究大主体已经建立，即动物微生物非致病成员在动物正常出生后的发育及生理方面发挥了显著的作用，从体内免疫稳态到新陈代谢方面。此外，微生物群还和许多疾病的发病有关，包括过敏，炎症性肠道疾病，癌症以及肥胖。对宿主和其定植微生物之间分子交流的理解的提高使我们有希望找到促进人类和动物健康的新医疗策略。

[0003] 我们现在所知道的关于微生物群落如何有助于宿主的生物学和病理学都是从研究无菌动物所获得的。无菌这个词是来源于希腊词语“gnosis”(knowledge)和“bios”(life)，并且指一种实验环境即环境里所有的微生物都是确定的或者是没有的。无菌实验的建立是根据在没有任何微生物条件下养殖动物的能力，用特定的微生物菌种在其体内定植或者更复杂的协作。无菌实验的概念可以追溯到巴斯德，他在1885提出的假设即动物在没有微生物的条件下是不可能存活的。这个假设仅在11年后就被推翻了，1896年Nuttal和Thierfelder用无菌剖腹产生产第一个无菌动物——豚鼠，并且养到13天。这一开始报导不久以后就成功生产出无菌小鸡，山羊和一群其他动物，鸟类和两栖动物。尽管这些早期的研究证实动物可以在没有微生物的条件下存活，但是无菌脊椎动物连续的生产至始至终都没有获得成功，直到1940年Reyniers和他的同事在圣母大学以及Gustafsson和他同事在伦德大学才能获得成功。无菌脊椎动物连续的生产的成功主要是由于在无菌动物营养学获得关键的进展。虽然无菌动物的可行性推翻了巴斯德的假设，但是在一方面是对的，即没有微生物情况下会影响动物生物学的许多方面。

[0004] 尽管大多数的无菌脊椎动物的研究都集中在哺乳动物和鸟类，但是也有人试图在无菌条件下养殖鱼类。Baker和Ferguson是第一次报导成功获得无菌鱼，卵胎生新月鱼，在卵黄吸收后用杀菌饲料喂养可以存活几周时间。在这一发现之后又成功获得了无菌卵生罗非鱼，多卵生鲑鱼种类，多卵胎生花鱂科鱼类和多卵生红鲈。尽管这些开创性的报导证实无菌鱼可以在一定时间内存活，但是他们不包括无菌鱼的基本形态和生理特性，也没有说明无菌鱼的特定营养需求，也没有评估用微生物在无菌鱼定植的结果，也不能获得生长到性成熟的无菌鱼。

[0005] 在过去的三十年里，斑马鱼已经成为一个重要的基础和生物医学研究的模式动物。斑马鱼卵是在体外受精的，这导致胚胎在孵化成为自由生活幼鱼之前----受精后3天是在它的保护膜内发育的。斑马鱼幼鱼开始进食是在受精后5天，以及幼体鱼到成鱼的变态发育是在受精后14天开始。斑马鱼具有额外的吸引性特征来分析宿主和微生物之间的相互作用，包括丰富的遗传学背景和基因资源，在发育过程中光透明特性允许我们在体内观察宿主和微生物细胞，并且可以控制进一步基因筛选（宿主和微生物都可以）和化学筛选。这些属性，结合斑马鱼和哺乳动物基因组，解剖水平和生理水平之间有广泛的同源性，让斑马鱼作为人类生物学和病理学一个有用的模式动物。

[0006] 无菌动物模式便于分子一系列的参数，首先，无菌动物可以用于研究微生物如何定植或者微生物代谢产物如何影响宿主生物进程，包括基因表达，发育，生理，免疫和寿命。这可以使无菌动物在特定时间点暴露在个别菌种，特定的微生物或者产物然后分析宿主的反应来完成。宿主的功能和微生物的基因产物可以通过在相应的菌种进行基因操作来检测。第二，无菌动物是一个非常好的平台去研究微生物与微生物之间的相互作用在活体宿主的生理环境内。我们可以用确定的微生物种类或者基因型组合让它们定植在无菌宿主体内，然后就可以用培养或DNA序列检测微生物群落在活体内之间的竞争。这些宿主与微生物以及微生物和微生物之间的相互作用可以作为一个函数用来分析微生物基因型，群落竞争，宿主基因型，宿主发育阶段，宿主生理，宿主体内定植微生物的历史，解剖学定位，饮食和其他环境和生理参数。

[0007] 除了无菌斑马鱼和无菌哺乳动物之间这些实验技术是共享的，斑马鱼还有着独特的优势，所以斑马鱼应该在无菌生物学领域受到重视。其中一个优势是斑马鱼在发育的早期特性的光透明性允许我们观察宿主活体细胞，微生物细胞以及分子事件。尽管只能在光学亮视野内观察活斑马鱼的细胞和微生物的细胞，但是这些研究可以通过用宿主或者微生物的基因工程改造特定的调节序列去表达报告荧光蛋白来增强。此外，外界提供的荧光探针可以在体外或体内检测特定的细胞型和生物学进程。

发明内容

[0008] 本发明的目的是提供一种无菌斑马鱼的生产方法。

[0009] 本发明所提供的无菌斑马鱼的生产方法，具体可包括如下步骤：

[0010] （1）将斑马鱼受精卵置于AB-GZM溶液中，于25-29℃，且温差小于0.5℃的条件下培养3-8h；

[0011] （2）将步骤（1）处理后的所述受精卵用所述AB-GZM溶液进行漂洗；

[0012] （3）将步骤（2）漂洗后的所述受精卵置于浓度为0.005g/L的聚维酮碘水溶液中，浸泡1-2min（注意：不能超过2min，否则会增加胚胎死亡率）；

[0013] （4）将步骤（3）浸泡后的所述受精卵用无菌GZM溶液进行漂洗；

[0014] （5）将步骤（4）漂洗后的所述受精卵用漂白剂漂白10-20min，期间可轻轻摇晃几次，使所述受精卵悬浮在所述漂白剂中，注意溶液不要有汽包；

[0015] 所述漂白剂为浓度为0.02g/L的次氯酸钠水溶液。

[0016] （6）将步骤（5）漂白后的所述受精卵用所述无菌GZM溶液进行漂洗，漂洗后将所述受精卵置于所述无菌GZM溶液中培养，培养温度为25-29℃，光周期为L10：D14至L14：D10，直至所述受精卵孵化得到幼体鱼；

[0017] （7）对所述幼体鱼每天进行所述无菌GZM溶液的半量换液（即将旧的培养液去除一半体积，补充相应体积的新的所述无菌GZM溶液；同时注意第一次换液的时候须把卵膜吸出去以免影响水质）培养，直至所述幼体鱼长成为目的大小的斑马鱼，从所述目的大小的斑马鱼中获得目的无菌斑马鱼。

[0018] 在本发明的一个实施例中，所述目的大小的斑马鱼具体为所述受精卵孵化后1-6天的斑马鱼。

[0019] 所述GZM溶液的溶剂为水，溶质为海盐；所述海盐在所述GZM溶液的含量为每升所述GZM溶液中含有60mg所述海盐。

[0020] 所述AB-GZM溶液的溶剂为水，溶质及其浓度如下：250ng/mL的两性霉素B、5μg/mL的卡那霉素、100μg/mL的氨苄霉素、10U/ml的青霉素、10U/ml的链霉素、59μg/mL的所述海盐。

[0021] 在上述方法中，步骤（1）中，所述培养的温度具体为28.5℃；所述培养的时间具体为4.5h。

[0022] 在上述方法中，步骤（3）中，所述浸泡的时间具体为1min。

[0023] 在上述方法中，步骤（5）中，所述漂白的时间具体为15min。

[0024] 在上述方法中，步骤（6）中，所述培养的温度具体为28.5℃；所述培养的光周期具体为L14:D10；将所述受精卵置于所述无菌GZM溶液中培养，培养密度为每100mL所述无菌GZM溶液中培养40-60个（如50个）所述受精卵。

[0025] 在上述方法中，步骤（7）中，从所述目的大小的斑马鱼中获得所述目的无菌斑马鱼的方法具体可包括如下步骤：对已用于培养所述目的大小的斑马鱼的所述GZM溶液进行无菌性检测，经检测无菌的所述GZM溶液中培养的所述目的大小的斑马鱼即视为无菌斑马鱼。

[0026] 在本发明的一个实施例中，所述“对已用于培养所述目的大小的斑马鱼的所述GZM溶液进行无菌性检测”的方法具体为TSA平板培养法或16sV3PCR法。

[0027] 更加具体的，所述TSA平板培养法包括如下步骤：将待测培养液涂布于TSA平板上，于25-29℃（如28.5℃）在有氧条件下培养一周，观察平板上是否有菌落生长。如果平板上有菌落生长，则用所测培养液饲养的斑马鱼并非无菌，再进一步培养过程中，将其去除；如果平板上没有菌落生长，则确定用所测培养液饲养的斑马鱼为无菌斑马鱼。所述16sV3PCR法包括如下步骤：以待测培养液为模板，用针对细菌16S核糖体DNAV3区的一段保守序列设计的引物进行PCR扩增；如果PCR扩增产物有大小为198bp的目的条带，则用所测培养液饲养的斑马鱼并非无菌，再进一步培养过程中，将其去除；如果PCR扩增产物没有大小为198bp的目的条带，则确定用所测培养液饲养的斑马鱼为无菌斑马鱼。

[0028] 在上述方法中，步骤（2）、步骤（4）和步骤（6）中的所述漂洗均可漂洗3次。

[0029] 在上述方法中，还包括自受精后第5天对斑马鱼进行喂食的步骤。所喂食物可为无菌的四膜虫。在本发明的一个实施例中，具体为无菌的嗜热四膜虫。其喂食频率为两天一次，每次喂食量为每1mL所述GZM溶液（饲养斑马鱼过程中所用的GZM溶液）添加300条所述无菌的嗜热四膜虫。

[0030] 本发明的再一个目的是提供一种AB-GZM溶液。

[0031] 本发明所提供的AB-GZM溶液，溶剂为水，溶质及其浓度如下：250ng/mL的两性霉素B、5μg/mL的卡那霉素、100μg/mL的氨苄霉素、10U/ml的青霉素、10U/ml的链霉素、59μg/mL的海盐。

[0032] 所述AB-GZM溶液在生产无菌鱼中的应用也属于本发明的保护范围。

[0033] 在上述应用中，所述无菌鱼具体可为无菌斑马鱼。

[0034] 在本发明中，所有的所述斑马鱼均具体为TU系斑马鱼。

[0035] 所述海盐为海水蒸发后所得的盐。在本发明中，所有的所述海盐均为红珊瑚海盐；具体为红珊瑚海盐销售中心（北京）产品，其产品目录号为h-38。

[0036] 本发明通过自然繁殖获得斑马鱼受精卵，然后通过一系列的抗生素和化学物质处理，获得无菌的胚胎，最后放置在无菌的环境中进行培养，最终获得无菌斑马鱼。本发明为研究微生物与斑马鱼之间的相互作用及许多生物学进程提供了方便的材料，对于人们进一步研究微生物和其脊椎动物宿主之间关系的内在机制也具有十分重要的参考意义。

具体实施方式

[0037] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0038] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0039] 下述实施例中，光周期Lx：Dy表示每天光照时长x小时，黑暗时长y小时，x+y=24。

[0040] 斑马鱼：为来自于北京大学的TU系斑马鱼，记载在“杨寒朔，汤明海，邓洪新等.纳升超高效液相色谱-飞行时间质谱检测斑马鱼胚胎中小分子多肽的初步研究.四川大学学报（医学版），2007年第06期”一文中，公众可从中国农业科学院饲料研究所获得。

[0041] 嗜热四膜虫（Tetrahymena thermophila）：记载在“张玉军，王清路，孔浩.淄博市孝妇河不同区段水质对四膜虫有性生殖的影响.安徽农学通报，2010，16（11）：58-59”一文中，公众可从中国农业科学院饲料研究所获得。

[0042] 两性霉素B、卡那霉素、氨苄霉素、聚维酮碘（聚乙烯吡咯烷酮与碘的络合物）（polyvinyl pyrrolidone-iodine complex，PVP-I）、青霉素购、链霉素均购自Sigma公司。

[0043] 漂白剂：母液：浓度为10g/L的次氯酸钠水溶液；工作液：浓度为0.02g/L的次氯酸钠水溶液。

[0044] 海盐：红珊瑚海盐，为红珊瑚海盐销售中心（北京）产品，其产品目录号为h-38。

[0045] GZM溶液：将1L水与1.5mL海盐溶液（40g海盐每L水）混合，混合后高压灭菌。合计所述GZM溶液中海盐的含量为60mg/L。

[0046] 两性霉素B储存液（250μg/mL），卡那霉素储存液（10mg/mL)，氨苄霉素储存液（20mg/mL），青霉素-链霉素储存液（青霉素和链霉素的含量均为1U/μL）。以上各储存液的溶剂均为水。

[0047] AB-GZM溶液：将49.6mL的GZM溶液、50μL的两性霉素B储存液、25μL的卡那霉素储存液、250μL的氨苄霉素储存液和500μL的青霉素-链霉素储存液混合，混合后用0.2μm过滤器过滤，分装到50-ml锥形管，-20℃保存。合计所述AB-GZM溶液中两性霉素B的含量为250ng/mL，卡那霉素的含量为5μg/mL，氨苄霉素的含量为100μg/mL，青霉素和链霉素的含量各为10U/mL，海盐的含量为59μg/mL。

[0048] 实施例1、无菌斑马鱼的生产及效果评价

[0049] （1）下午喂食后两个小时，将一对性成熟斑马鱼放到一个干净的斑马鱼孵化缸中，中间放置透明隔板把雌雄鱼隔开，水由无菌过滤系统提供。

[0050] （2）第二天早上8:00把隔板取走，自然状态下雌鱼产卵，雄鱼进行体外受精，1h后把鱼转移到另外一个鱼缸，立即用吸管收集受精卵，转移至装有AB-GZM溶液的灭菌的广口瓶中，28.5℃培养4.5h（提示：3-8h均可）。

[0051] （3）去除带白点或泛白的低质量受精卵，选取透明且保护膜完整的高质量受精卵进行以下操作，用时约30min；

[0052] （4）用AB-GZM溶液漂洗步骤（3）中选取的受精卵，漂洗3次（用时约10min），然后将受精卵轻轻浸入浓度为0.005g/L的PVP-I水溶液中，浸泡1min。（注意：不能超过2min，否则会增加受精卵胚胎的死亡率）

[0053] （5）用无菌的GZM溶液漂洗经步骤（4）处理后的受精卵，漂洗3次（用时约10min），然后用次氯酸钠浓度为0.02g/L的漂白剂工作液（用蒸馏水稀释漂白剂母液后获得）加满广口瓶，盖紧。漂白15min（提示：10-20min均可），期间隔段时间轻轻摇晃，使受精卵悬浮在漂白剂里。注意溶液中尽量不要有气泡。

[0054] （6）用无菌的GZM溶液漂洗经步骤（5）处理后的受精卵，漂洗3次（用时约10min），然后将受精卵转移至培养瓶中或者12孔板中培养，培养密度为每100ml的GZM溶液中养50个受精卵胚胎，放置于超净台或者细胞培养箱中，于温度28.5℃，光周期L14:D10的条件下进行养殖。

[0055] （8）48-72h后，受精卵胚胎孵化成幼体鱼，之后每天进行半量换液，即去除一半体积的旧的培养液，同时补充等体积的无菌的GZM溶液。

[0056] （9）自受精卵胚胎孵化成幼体鱼后，每天一方面定时观察斑马鱼生存状态并统计其存活率，另一方面定时取100μL培养液进行TSA平板培养，取10μL培养液进行16sV3PCR来检测所得斑马鱼的无菌性。

[0057] 其中，存活率=观察时存活的斑马鱼数目/步骤（3）中所选取的受精卵数目×100%；

[0058] 无菌率=无菌斑马鱼数目/存活的斑马鱼数目×100%

[0059] TSA平板培养法检测斑马鱼无菌性的操作方法：将待测的培养液涂布于TSA平板上，倒置后于28.5℃在有氧条件下培养一周，观察平板上是否有菌落生长。结果判断方法：如果平板上有菌落生长，则用所测培养液饲养的斑马鱼并非无菌，再进一步培养过程中，将其去除；如果平板上没有菌落生长，则确定用所测培养液饲养的斑马鱼为无菌斑马鱼。其中，TSA平板：Trypticase Soy Broth(OXOID，England),货号为CM0129，按30g/L加20g琼脂高压灭菌后，倒板，冷却后即可以用。

[0060] 16sV3PCR法检测斑马鱼无菌性的原理：根据细菌在16S核糖体DNA V3区的一段保守序列设计引物进行PCR扩增，扩增片段为198bp。检测方法：以待测的培养液为模板，用16s核糖体RNA目标基因来检测容器中任何细菌的存在。反应体系为：10×PCR buffer2.5μl，dNTP mix(2.5mmol/L)2μl，引物338F(20μmol/L)0.5μl，引物
519R(20μmol/L)0.5μl，rTaq(2.5U/μL)0.5μl，10μl模板，4μl水总体积20μl。PCR反应程序为：94℃ 5min；94℃ 30s，53℃ 30s，72℃ 30s，30个循环；72℃延伸10min。结果判断方法：如果PCR扩增产物有大小为198bp的目的条带，则用所测培养液饲养的斑马鱼并