一种重组人多功能生长因子Pleiotrophin融合蛋白及其制备方法

摘要

本发明公开了一种重组人多功能生长因子Pleiotrophin融合蛋白及其制备方法，该融合蛋白在人多功能生长因子Pleiotrophin的N端还依次连接有纯化标记序列、凝血酶和肠激酶酶切位点，以及Nus序列。本发明通过构建原核表达载体pET44a(+)-pleiotrophin，并转化入大肠杆菌获得转化体，再对大肠杆菌转化体进行诱导表达，分离纯化后得到pleiotrophin融合蛋白。生物活性验证表明，对Pleiotrophin融合蛋白具有促进细胞生长的作用，可用于营养神经药物的制备。

权利要求

1.一种重组人多功能生长因子Pleiotrophin融合蛋白，其特征在于，包括人多功能生长因子Pleiotrophin，在人多功能生长因子Pleiotrophin的N端还依次连接有纯化标记序列、凝血酶和肠激酶酶切位点，以及Nus序列；

所述的重组人多功能生长因子Pleiotrophin融合蛋白的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

2.一种表达重组人多功能生长因子Pleiotrophin融合蛋白的原核表达载体，其特征在于，该原核表达载体为pET44a(+)-Pleiotrophin，是通过EcoR I/XHo I酶切位点将如SEQ.ID.NO.3所示的人多功能生长因子Pleiotrophin基因片段，克隆入pET44a(+)表达载体。

3.一种重组人多功能生长因子Pleiotrophin融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)以包含完整人Pleiotrophin基因编码框的cDNA为模板，PCR扩增人Pleiotrophin基因片段；

所述的PCR扩增人Pleiotrophin基因片段，是以引物对P作为引物，所述的引物对P为：上游引物P1：aggaattcat gcaggctcaa cagtacc；

下游引物P2：agctcgagta aatccagcat cttctcc；

2)将PCR扩增的人Pleiotrophin基因片段酶切后得到带粘性末端的片段；并将该片段与同样双的pET44a(+)载体连接，得到表达载体pET44a(+)-Pleiotrophin；

3)将表达载体pET44a(+)-Pleiotrophin转染到感受态的大肠杆菌，筛选得到目的基因表达的阳性转化子；

4)将阳性转化子在37℃恒温箱培养12h后挑取边缘整齐、生长状态良好的菌落，接种于含氨苄青霉素100mg/L的LB培养液中，摇床37℃培养过夜；次日接种于新鲜的含氨苄青霉素100mg/L的LB培养液中，37℃继续培养至细菌密度达到OD600＝0.4～0.6，加入0.2mM浓度的IPTG诱导培养2～4h，使得表达载体pET44a(+)-pleiotrophin得到表达，然后离心收集细菌；

5)按5～10mL/g细菌沉淀的比例加入裂解液，重悬细菌，在冰浴下超声裂菌，然后离心分离，并收集上清；

所述的裂解液为pH8.5、浓度50mmol/L的Tris·Cl，5mmol/L的β-巯基乙醇和1mmol/L的PMSF的混合溶液；

6)将收集的上清上样于金属螯合亲和层析柱，用10倍柱体积的缓冲液A洗柱以

0.5mL/min的流速洗脱，然后用2倍柱体积的缓冲液B洗柱，最后用缓冲液C洗脱结合蛋白，收集洗脱峰；

所述的缓冲液A为pH 8.5、浓度20mmol/L的Tris·Cl，100mmol/L的KCl，5mmol/L的β-巯基乙醇和20mmol/L的咪唑的混合溶液；所述的缓冲液B为pH 8.5、浓度20mmol/L的Tris·Cl，1mol/L的KCl和5mmol/L的β-巯基乙醇的混合溶液；所述的缓冲液C为pH

8.5、浓度20mmol/L的Tris·Cl，100mmol/L的KCl，5mmol/L的β-巯基乙醇和100mmol/L的咪唑的混合溶液；

将收集的洗脱峰上样于离子交换层析，用洗脱液D洗脱结合的蛋白，收集洗脱峰，得到纯化的重组人多功能生长因子Pleiotrophin融合蛋白；所述的洗脱液D为pH 7.4、浓度

50mmol/L的Tris·Cl和1mmol/L NaCl的混合溶液。

说明书

一种重组人多功能生长因子Pleiotrophin融合蛋白及其

制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及重组融合蛋白的表达，特别涉及一种重组人多功能生长因子Pleiotrophin融合蛋白及其制备方法。

背景技术

[0002] 多功能生长因子（pleiotrophin）是1989年由华盛顿大学医学中心纯化得到的一种生长因子，当时认为该因子为17kDa的蛋白，与肝素具有高度亲和性，并首次被命名为HBGF-8(heparin．binding growth factor-8）。Ptn基因位于7q33-q34，长度大于100kb，编码168个氨基酸，蛋白大小15.3kD，在SDS聚丙烯酰胺电泳表现为18kD。PTN正常表达于胚胎期，在成年的健康组织中很少表达，在大脑中表达水平最高，除此之外，还可表达于子宫、睾丸Leydig细胞等。PTN主要作用有：(1)对肿瘤的发生、生长与转移、肿瘤血管生成有重要作用；(2)在中枢神经系统内对轴突生长、突触生成、神经肌连接等有重要作用；(3)其他如促进有丝分裂、促进骨发育等作用；(4)促进造血干细胞扩增和及再生。因此pleiotrophin可作为营养支持多巴胺能神经元药物，同时缓解帕金森病的症状，为帕金森病的治疗提供一个新思路。

[0003] 鉴于Pleiotrophin重要的生物学功能，获得高纯度有活性的Pleiotrophin蛋白，可作为营养支持多巴胺能神经元的基因药物，具有应用于帕金森病治疗的前景。而由于Pleiotrophin基因的mRNA二级结构复杂，不利于真核系统的外源表达；且单独表达Pleiotrophin蛋白，由于表达量较小的原因，也会影响后期基因药物的效率。

发明内容

[0004] 本发明解决的问题在于提供一种重组人多功能生长因子Pleiotrophin融合蛋白及其制备方法，对Pleiotrophin基因进行了表达和纯化，并验证了该融合蛋白对神经经典细胞模型PC12细胞具有促进生长的活性。

[0005] 本发明是通过以下技术解决方案来实现：

[0006] 一种重组人多功能生长因子Pleiotrophin融合蛋白，在人多功能生长因子Pleiotrophin结构域的N端还依次连接有纯化标记序列、凝血酶和肠激酶酶切位点，以及Nus序列。

[0007] 所述的人多功能生长因子Pleiotrophin的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

[0008] 所述的纯化标记序列为6×His的标记序列。

[0009] 所述的重组人多功能生长因子Pleiotrophin融合蛋白的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

[0010] 一种表达重组人多功能生长因子Pleiotrophin融合蛋白的原核表达载体，该原核表达载体为pET44a(+)-pleiotrophin，是通过EcoR I/XHo I酶切位点将如SEQ.ID.NO.3所示的人多功能生长因子Pleiotrophin基因片段，克隆入pET44a(+)表达载体。

[0011] 一种重组人多功能生长因子Pleiotrophin融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：

[0012] 1）以包含完整人Pleiotrophin基因编码框的cDNA为模板，以引物对P作为引物，PCR扩增人pleiotrophin基因片段，所述的引物对P为：

[0013] 上游引物P1：aggaattcatgcaggctcaacagtacc；

[0014] 下游引物P2：agctcgagtaaatccagcatcttctcc；

[0015] 2）将PCR扩增的人pleiotrophin基因片段用EcoR I/XHo I双酶切得到双粘性末端的片段；并将该片段与EcoR I/XHo I双酶切的pET44a(+)载体连接得到表达载体pET44a(+)-pleiotrophin；

[0016] 3）将表达载体pET44a(+)-pleiotrophin转染到感受态的大肠杆菌，筛选得到目的基因表达的阳性转化子；

[0017] 4）将阳性转化子在37℃恒温箱培养12h后挑取边缘整齐、生长状态良好的菌落，接种于含氨苄青霉素100mg/L的LB培养液中，摇床37℃培养过夜；次日以1∶100的体积比接种于新鲜的含氨苄青霉素100mg/L的LB培养液中，37℃继续培养至细菌密度达到OD600=0.4～0.6，加入终浓度0.2mM浓度的IPTG诱导培养4h，使得表达载体pET44a(+)-pleiotrophin得到表达，然后离心收集细菌；

[0018] 5）按10mL/g细菌沉淀的比例加入裂解液，重悬细菌，在冰浴下超声裂菌，然后离心分离，并收集上清；

[0019] 所述的裂解液为pH8.5、浓度50mmol/L的Tris·Cl，5mmol/L的β-巯基乙醇和1mmol/L的PMSF的混合溶液；

[0020] 6）将收集的上清上样于金属螯合亲和层析柱，用10倍柱体积的缓冲液A洗柱以0.5mL/min的流速洗脱，然后用2倍柱体积的缓冲液B洗柱，最后用缓冲液C洗脱结合蛋白，收集洗脱峰；

[0021] 所述的缓冲液A为pH8.5、浓度20mmol/L的Tris·Cl，100mmol/L的KCl，5mmol/L的β-巯基乙醇和20mmol/L的咪唑的混合溶液；所述的缓冲液B为pH8.5、浓度20mmol/L的Tris·Cl，1mol/L的KCl和5mmol/L的β-巯基乙醇的混合溶液；所述的缓冲液C为pH8.5、浓度20mmol/L的Tris·Cl，100mmol/L的KCl，5mmol/L的β-巯基乙醇和100mmol/L的咪唑的混合溶液；

[0022] 将收集的洗脱峰上样于离子交换层析，用洗脱液D洗脱结合的蛋白，收集洗脱峰，得到纯化的重组人多功能生长因子Pleiotrophin融合蛋白；

[0023] 所述的洗脱液D为pH7.4、浓度50mmol/L的Tris·Cl和1mmol/L NaCl的混合溶液。

[0024] 与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

[0025] 1、由于Pleiotrophin为碱性蛋白质，其理论pI值为9.66，从而决定了若要单独表达此蛋白较难表达。而本发明通过构建原核表达载体pET44a(+)-pleiotrophin，并转化大肠杆菌，进行诱导表达之后分离纯化得到具有Pleiotrophin融合蛋白的重组人多功能生长因子Pleiotrophin的融合蛋白，该融合蛋白具有营养支持神经元，促进神经细胞增殖的生物活性，对肿瘤细胞具有细胞周期的阻滞作用，可以用于制备营养促进神经细胞增殖的基因药物。

[0026] 2、本发明构建的原核表达载体pET44a(+)-pleiotrophin是在克隆人pleiotrophin基因的基础上，通过EcoR I/XHo I双酶切位点克隆入表达载体pET44a(+)，连接能够被凝血酶和肠激酶识别的序列，而且构建的pleiotrophin融合蛋白还包含6×His的纯化标记序列，这样便于融合蛋白的纯化；并且在必要的时候通过凝血酶和肠激酶的限制性酶切反应可以去除标记序列，从而能够得到pleiotrophin多肽。

[0027] 3、该融合蛋白利用原核大肠杆菌系统进行表达，具有经济，易于扩大培养的优势，融合蛋白促使表达量大大增加，纯化标签易于纯化，产量高，纯度高都是该融合蛋白的优势。

附图说明

[0028] 图1是PCR扩增获得pleiotrophin基因片段的电泳检测图；

[0029] 图2是pET44a(+)载体的质粒图谱；

[0030] 图3是pET44a(+)-pleiotrophin表达载体的EcoR I和XHo I双酶切鉴定电泳图；

[0031] 图4是SDS-PAGE检测pleiotrophin融合蛋白表达的结果图；

[0032] 图5是Western Blot检测pleiotrophin融合蛋白可溶性表达的结果图；

[0033] 图6是SDS-PAGE检测pleiotrophin融合蛋白纯化后的结果图；

[0034] 图7是MTT检测pleiotrophin融合蛋白生物活性的柱状图。

具体实施方式

[0035] 本发明通过生物技术实现重组人Pleiotrophin的制备，通过构建原核表达载体pET44a(+)-Pleiotrophin，并转化入大肠杆菌获得转化体，再对大肠杆菌转化体进行诱导表达，分离纯化后得到Pleiotrophin融合蛋白。对Pleiotrophin融合蛋白进行SDS-PAGE和Western Blot分析，其分子量与预测结果一致；而生物活性验证表明，Pleiotrophin融合蛋白具有促进PC12细胞生长的作用。下面对本发明做详细的说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

[0036] 1．人pleiotrophin基因（NM_002825.5）的扩增

[0037] 在GenBank中查找人Pleiotrophin基因（NM_002825.5）。根据其mRNA核苷酸序列，设计并人工合成特异性引物P，将EcoR I和XHo I引入pleiotrophin编码序列的两端；引物P具体为：

[0038] 上游引物P1：aggaattcatgcaggctcaacagtacc27；

[0039] 下游引物P2：agctcgagtaaatccagcatcttctcc27；

[0040] 以人胚肝cDNA为模板，以引物P为引物，按照以下程序进行扩增出含完整ORF（编码框）的pleiotrophin cDNA序列：95℃30s，56℃30s，72℃60s，30个循环，72℃10min。胶回收扩增获得的PCR产物，进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图1所示，泳道M为DNA Marker，泳道1为507bp的两端带有克隆位点的pleiotrophin基因。

[0041] 2.表达载体pET44a(+)-Pleiotrophin-MHD的设计与构建：

[0042] 为了便于人pleiotrophin基因的顺利表达以及pleiotrophin融合蛋白的纯化分离，本发明选用了pET44a(+)原核表达载体，将人pleiotrophin基因克隆入T7启动子的下游，该载体具有通过大量系统筛选而得到的一种过量表达时具有极高溶解性的大肠杆菌蛋白Nus.Tag融合伴侣和标签，可进一步提高重组融合蛋白的有效表达；在Nus.Tag的下游带有编码凝血酶和肠激酶识别氨基酸位点的序列，这样可对融合蛋白pleiotrophin进行后期的标签的切割；而含有的纯化His标签，使得融合蛋白被表达之后能够通过层析分离而纯化得到。

[0043] 具体通过以下步骤来构建：

[0044] a.载体质粒和人Pleiotrophin基因的酶切

[0045] 将回收的Pleiotrophin基因经EcoR I/XHo I双酶切，并用试剂盒回收带有粘性末端的人pleiotrophin基因片段；原核细胞表达质粒pET44a(+)购于Novagen公司，其质粒图谱如图2所示，其中，T7为T7启动子/引物位点，2426-2442bp；Nus.Tag为：Nus标签蛋白，834-2318bp；His.Tag为：组氨酸标签蛋白，2325-2342bp，801-818bp和512-529bp；多克隆酶切位点为：530-724bp；lacI为：lac Z等位基因，2833-3915bp；Ap为：氨苄青霉素抗药性基因，5870-6730bp；f1ori为：f1起始位点，6852-7299bp。将原核表达载体pET44a(+)用EcoR I/XHol双酶切，试剂盒回收线性化质粒大片段。

[0046] b.将酶切的人pleiotrophin序列和回收的pET44a(+)线性片段用T4DNA连接酶连接，将连接产物转化感受态DH5α细胞，37℃恒温箱培养12h后挑取单克隆菌落接种于含氨卞青霉素（Amp）100mg/L的LB培养液中，摇床37℃培养12h后收菌提取质粒进行酶切鉴定，EcoR I/XHo I双酶切鉴定电泳结果如图3所示，泳道1、2所示的重组质粒经酶切得到预期的约507bp大小的插入片段，经序列测定，说明人pleiotrophin序列正确插入到pET44a(+)载体当中，表达载体pET44a(+)-pleiotrophin构建成功。

[0047] 3.表达载体pET44a(+)-Pleiotrophin-MHD的转化与诱导表达

[0048] 将重组表达载体pET44a(+)-Pleiotrophin-MHD转化到表达宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，37℃恒温箱培养12h后，挑取边缘整齐、生长状态良好的菌落，接种于含氨苄青霉素100mg/L的LB培养液中，摇床37℃振荡培养过夜。次日，以1:100的体积比接种于新鲜的含氨苄青霉素100mg/L的LB培养液中，37℃继续振荡培养至细菌密度达到OD600=0.4～0.6，加入IPTG至终浓度为0.2mmol/L，诱导培养4h，使得表达载体pET44a(+)-pleiotrophin得到表达，然后离心收集细菌。

[0049] 4．pleiotrophin融合蛋白的鉴定

[0050] a.10%SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）检测pleiotrophin融合蛋白的表达[0051] 以未进行诱导的pET44a(+)-pleiotrophin/BL21重组细胞作为对照，IPTG诱导4h后离心收集，用裂解液溶解细菌，加入50μl5×上样缓冲液煮沸10min。取总蛋白进行
10%的SDS-PAGE电泳。考马斯亮蓝染色后可见明显诱导后的新生条带，分子量约82.5kDa；
具体结果如图4所示：图中，泳道M为蛋白质Marker，分别为97.2、66.4、44.3、29.0、20.1、
14.3kDa；泳道1为未诱导的pET44a(+)-pleiotrophin/BL21重组细胞，泳道2为0.2mM IPTG诱导表达4h；与其他泳道相比，泳道2在进行IPTG诱导后，产生分子量约82.5kDa的pleiotrophin融合蛋白。

[0052] b.pleiotrophin融合蛋白的Western Blot检测

[0053] 收集IPTG诱导后的pET44a(+)-pleiotrophin/BL21(DE3)重组菌，分别提取细菌胞质上清和包涵体（收集细菌裂菌后离心的上清和沉淀），Western Blot分析融合pleiotrophin蛋白的表达。在融合蛋白表达检测的SDS-PAGE电泳结束后，拆下凝胶，按照Bio-Rad产品说明，将凝胶靠近阴极一侧，硝酸纤维（NC）膜靠近阳极一侧，在预冷的转移缓冲液(25mM Tris、192mM Glycine、20%甲醇)中100V恒压电泳60分钟，将蛋白转移至NC膜上；电泳结束后，取出NC膜，洗涤液TBST(20mM Tris-HCl，pH7.5、150mM NaCl，0.05%Tween-20)清洗后浸入封闭液(含2%BSA的TBST)中室温封闭1h，TBST室温洗3次，每次5min；然后加入鼠源His标签抗体，室温孵育1h，TBST室温洗3次，每次5min；再加入荧光素酶标记的二抗，室温孵育1h，TBST室温洗3次，每次5min，红外蛋白扫膜仪扫膜显示在胞质上清和包涵体中均可见被标记的诱导后pleiotrophin融合蛋白条带，分子量与SDS-PAGE电泳检测一致，说明pleiotrophin融合蛋白为可溶性表达。具体结果如图5所示，其中，泳道M为蛋白质Marker，分别为97.2、66.4、44.3、29.0、20.1、14.3kDa；泳道1为未诱导的pET44a(+)-pleiotrophin/BL21重组细胞；泳道2为pET44a(+)-pleiotrophin/BL21用0.2mM IPTG诱导后的上清；泳道3为pET44a(+)-pleiotrophin/BL21用0.2mM IPTG诱导后的的包涵体；对比泳道1、2、3可见：pleiotrophin融合蛋白在包涵体沉淀中有表达。

[0054] 而根据pET44a(+)载体的表达，pleiotrophin融合蛋白从氨基端开始，依次含有Nus序列、凝血酶和肠激酶酶切位点、His标签，含744个氨基酸，具体的Pleiotrophin的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，pleiotrophin融合蛋白的氨基酸序列为（或者如SEQ.ID.NO.2所示）：

[0055] MGSSHHHHHHSSMNKEILAVVEAVSNEKALPREKIFEALESALATATKKK YEQEIDVRVQIDRKSGDFDTFRRWLVVDEVTQPTKEITLEAARYEDESLNL GDYVEDQIESVTFDRITTQTAKQVIVQKVREAERAMVVDQFREHEGEIITG VVKKVNRDNISLDLGNNAEAVILREDMLPRENFRPGDRVRGVLYSVRPEA RGAQLFVTRSKPEMLIELFRIEVPEIGEEVIEIKAAARDPGSRAKIAVKTND KRIDPVGACVGMRGARVQAVSTELGGERIDIVLWDDNPAQFVINAMAPAD VASIVVDEDKHTMDIAVEAGNLAQAIGRNGQNVRLASQLSGWELNVMTV DDLQAKHQAEAHAAIDTFTKYLDIDEDFATVLVEEGFSTLEELAYVPMKE LLEIEGLDEPTVEALRERAKNALATIAQAQEESLGDNKPADDLLNLEGVD RDLAFKLAARGVCTLEDLAEQGIDDLADIEGLTDEKAGALIMAARNICWF GDEATSGSGHHHHHHSAGKETAAAKFERQHMDSPPPTGLVPRGSAGSGTI DDDDKSPGARGSEFMQAQQYQQQRRKFAAAFLAFIFILAAVDTAEAGKK EKPEKKVKKSDCGEWQWSVCVPTSGDCGLGTREGTRTGAECKQTMKTQ RCKIPCNWKKQFGAECKYQFQAWGECDLNTALKTRTGSLKRALHNAECQ KTVTISKPCGKLTKPKPQAESKKKKKEGKKQEKMLDLLEHHHHHH[0056] pleiotrophin融合蛋白的理论分子量约为82.5kDa，与SDS-PAGE和Western Blot检测一致。

[0057] c.pleiotrophin融合蛋白的纯化

[0058] 扩大培养pET44a(+)-pleiotrophin/BL21重组菌，IPTG诱导后离心收集细菌，按10mL/g细菌沉淀加入裂解液(pH8.5，50mmol/L Tris·Cl，5mmol/Lβ-巯基乙醇，1mmol/L PMSF)，重悬细菌，在冰浴下超声裂菌(每次1min，5～10次)，12,000r/min离心10min，分离上清和沉淀，弃上清，收集沉淀–20℃冻存。

[0059] 金属螯合亲和层析：再生NI-NTA柱，缓冲液A(pH8.5，20mmol/LTris·Cl，100mmol/L KCl，5mmol/Lβ-巯基乙醇，20mmol/L咪唑)平衡NI-NTA层析柱，将上清上柱，保持0.5mL/min的流速，10倍柱体积的缓冲液A洗柱，以洗去杂蛋白；2倍柱体积的缓冲液B(pH8.5，20mmol/L Tris·Cl，1mol/L KCl，5mmol/Lβ-巯基乙醇)洗柱，洗去核酸；再用缓冲液C(pH8.5，20mmol/L Tris·Cl，100mmol/L，5mmol/Lβ-巯基乙醇，100mmol/L咪唑)洗脱结合蛋白，收集洗脱峰，聚丙烯酰胺凝胶电泳显示洗脱蛋白包含目的蛋白。

[0060] 离子交换层析进一步纯化：离子交换层析缓冲液(pH7.4，50mmol/L Tris·ci)平衡Q Sapharose HP层析柱，将经过Ni-NTA层析柱初步纯化的pleiotrophin融合蛋白加在Q Sapharose HP凝胶介质上，用缓冲液洗层析柱，用洗脱缓冲液（pH7.4、50mmol/L Tris·Cl，1mol/L NaCl)洗脱结合的蛋白，收集洗脱峰，聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定洗脱蛋白，结果如图6所示：其中，泳道M为蛋白质Marker，分别为97.2、66.4、44.3、29.0、20.1、14.3kDa；泳道1为未诱导的pET44a(+)-pleiotrophin/BL21重组细胞；泳道2为0.2mMIPTG诱导表达
4h；泳道3为纯化后的pleiotrophin融合蛋白。将纯化的重组人pleiotrophin融合蛋白分装后冻干备用。

[0061] d.pleiotrophin融合蛋白对细胞生长的促进

[0062] 常规方法培养至对数生长期的PC12细胞，制成细胞悬液，分成6组，每组5孔3
每孔细胞数为1×10 个体积为150μL。第1组加入25μL缓冲液A对照，第2组加入pleiotrophin融合蛋白液5μL缓冲液A20μL，第3组加入pleiotrophin融合蛋白液
10μL缓冲液A15μL，第4组加入pleiotrophin融合蛋白液15μL缓冲液A10μL，第5组加入pleiotrophin融合蛋白液20μL缓冲液A5μL，第6组加入pleiotrophin融合蛋白液
25μL，作用72小时后加入MTT溶液(5mg/ml用PBS配)20μl继续孵育4小时，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加150μl DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。选择490nm波长，在酶标仪上测定各孔光吸收值。六组样品的检测结果如图7所示（横轴为蛋白刺激浓度，纵轴为吸光值）随着蛋白液浓度的提高吸光值也随之增大，说明PC12细胞被pleiotrophin融合蛋白刺激后增长速度加快。