一种高产降粘酶系的菌种及其应用

摘要

本发明涉及一种高产降粘酶系的菌种及其应用。本发明筛选出的一株降粘酶系高产菌株，命名为CMC-37，该菌株菌落为蓝绿色，菌丝有横隔，其分生孢子梗经过多次分枝，形成帚状体。其分类名为赭绿青霉(Penicillium ochrochloron Biourge)，保藏号为：CBS131817。本发明菌株利用农业废弃物玉米芯可以高产降粘酶系，作用于鲜甘薯粘度下降率高达91.26%，作用明显，成本低廉。有效解决制约我国薯类原料发酵的成本问题，大幅度提升我国薯类原料发酵的可行性和经济性。

权利要求

1.一种降粘酶系菌株CMC-37，其特征在于，其分类命名为赭绿青霉(Penicillium ochrochloron)，保藏于荷兰微生物菌种保藏中心，保藏号为：CBS131817。

2.权利要求1所述的降粘酶系菌株CMC-37用于发酵产生降粘酶的用途。

3.一种用权利要求1所述的降粘酶系菌株CMC-37产降粘酶降粘的方法，其特征在于所述方法包括：(1)打浆：甘薯块茎原料洗净、打浆；

(2)液化：按照90～150KNU/kg淀粉在甘薯浆中添加α-淀粉酶，80～90℃液化至碘反应为红棕色，冷却至室温后按所需的料水比添加自来水；酶活定义为在37℃，pH5.6时，每小时水解5.26克淀粉的酶量为1个KNU；

(3)高温处理：液化后将甘薯浆在115℃高温下作用20min；

(4)预处理：温度降低至30～50℃时，每公斤甘薯浆中添加40mL降粘酶，50℃作用

2h；

其中，降粘酶为权利要求1所述的降粘酶系菌株CMC-37发酵后经过离心，上清液再经过0.22μm过滤器过滤获得；

所述的降粘酶系菌株CMC-37发酵的发酵培养基为g/L：玉米芯20，KH2PO42.0，NH4NO3

4.5，MgSO4 0.15，CaCl2 0.3，FeSO4·7H2O 0.0005，ZnSO4·7H2O 0.0014，MnSO4·H2O 0.0016，CoCl2·6H2O 0.0016，Tween80 3.3，pH6.5；

所述的降粘酶系菌株CMC-37发酵的发酵条件为30℃，130rpm，5天。

说明书

一种高产降粘酶系的菌种及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于微生物技术领域，涉及一种高产降粘酶系的菌种及其应用。

背景技术

[0002] 随着石油枯竭和环境污染问题日益严重，生物燃料乙醇的发展受到了世界各国的普遍的关注和重视。作为第一代燃料乙醇，玉米（美国）和甘蔗（巴西）等粮食作物为主要原料(Srichuwong S et al,2009)，在过去的几十年里得到了迅速的发展。但是在一些土地资源紧缺和粮食危机的一些发展中国家，以粮食为原料生产燃料乙醇是不经济也不切实际的策略。因此以农业、林业和工业废弃物如秸杆等纤维素和半纤维素原料生产燃料乙醇第二代生物燃料乙醇得到了广泛的研究(Kumar et al.,2008;Sukumaran et al.,2009;Yang et al.,2011)。但是生物质抗性（biomass recalcitrance）(Himmel et al.,2007)导致植物纤维中的结构性多糖难以被微生物利用，如果不提高纤维素降解为可发酵性糖类的动力学参数和转化率，不解决这些原料难以降解的化学结构特征，整个生产过程也是非常困难和昂贵的。美国计划到2011年将生物燃料乙醇的产量提高到1.05亿吨，欧盟计划到2030年欧盟的运输业的1/4的燃料将由生物燃料代替。在中国的十二五计划中，燃料乙醇的产量要提高到500万吨。在这些规划中，要经济且高效的生产燃料乙醇还有很大的空间。

[0003] 甘薯等块茎类非粮原料具有高淀粉和可发酵性糖，且中国是世界上甘薯最大生产国，是较为理想的1.5代燃料乙醇的原料。但是这些块茎类的发酵醪液粘度很大，导致醪液输送困难，降低了工艺流程中的热传导效率和酵母的活性(Zhang et al,2010)。采用流加的发酵工艺和添加发酵用水不能解决实际问题。因此在甘薯等全原料发酵过程中开发了一种添加降粘酶系的工艺，即添加木聚糖酶、纤维素酶、果胶酶、葡聚糖酶等商品酶达到快速降粘的效果。但是商品降粘酶价格昂贵，应用于工业生产仍然增加了生产成本。

[0004] 因此成本问题已成为1.5代和2代燃料乙醇生产的共性问题，要降低生产成本必须从根源上解决问题。目前还没有针对自主开发降粘酶系的报道，因此，本发明公开一种高产降粘酶系的菌种及其应用，通过降粘酶系菌株的筛选和发酵产酶条件的优化，利用其发酵粗酶液，通过简单的操作工序，即可降低薯类原料粘度，达到很好的预处理效果。

发明内容

[0005] 本发明的目的就是为了解决以上问题，提供了一种产降粘酶并能有效地降低甘薯发酵醪液的粘度的菌株赭绿青霉Penicillium ochrochloron，以降低燃料乙醇生产成本。

[0006] 为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

[0007] 本发明公开了一种赭绿青霉Penicillium ochrochloron，保藏号为：CBS131817。该菌株为一株降粘酶系高产菌株，命名为CMC-37，该菌株菌落为蓝绿色，菌丝有横隔，其分生孢子梗经过多次分枝，形成帚状体。

[0008] 关于微生物保藏信息：

[0009] 菌株名称：赭绿青霉Penicillium ochrochloron

[0010] 保藏日期：27/01/2012

[0011] 保藏单位：荷兰微生物菌种保藏中心

[0012] 地址：荷兰乌特勒支3584邮政编码区，乌普萨拉兰8号，荷兰皇家艺术与科学学院－荷兰微生物菌种保藏中心（CBS-KNAW）真菌生物多样性中心（Centraalbureau voor Schimmelcultures，FungalBiodiversity Centre，Institute of the RoyalNetherlands Academy of Arts and Sciences，CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre，Uppsalalaan8，3584CT Utrecht，The Netherlands)

[0013] 保藏号：CBS131817

[0014] 本发明还公开了上述菌株赭绿青霉Penicillium ochrochloron筛选来源；

[0015] 具体地，所述的筛选来源于腐烂甘薯。

[0016] 本发明还公开了上述菌株赭绿青霉Penicillium ochrochloron筛选筛选过程；

[0017] 具体地，所述的筛选过程，腐烂甘薯经10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7稀释后，-5 -6 -7分别取100μL10 ，10 ，10 浓度菌悬液涂布于筛选培养基上，30℃培养3天后，挑取单菌落到PDA斜面培养基中，平板用刚果红染液染色，挑选黄色透明圈大且明显的菌株。

[0018] 所述的筛选培养基为(g/L)：CMC10，酵母膏4.5，(NH4)2SO44.5,NaCl5.0,K2HPO42.0,MgSO4.7H2O0.4,agar15。

[0019] 所述的刚果红染液染色步骤为：菌落挑取后，利用1%刚果红染液染色10min，倒掉染色液并用1M NaCl润洗三次。

[0020] 本发明还公开了上述菌株赭绿青霉Penicilium ochrochloron用于发酵产生降粘酶并应用于块茎类燃料乙醇发酵降粘预处理中的用途；

[0021] 具体地，所述的块茎类优选是鲜甘薯。

[0022] 本发明还公开了用上述赭绿青霉Penicillium ochrochloron产降粘酶的发酵培养基；

[0023] 具体地，所述的发酵培养基为(g/L)：玉米芯20,KH2PO42.0,NH4NO34.5,MgSO40.15,CaCl20.3,FeSO4.7H2O0.0005,ZnSO4.7H2O0.0014,MnSO4.H2O0.0016,COCl2.6H2O0.0016，Tween803.3,pH6.5。

[0024] 本发明还公开了赭绿青霉Penicillium ochrochloron产降粘酶的发酵条件；

[0025] 具体地，所述的发酵条件为30℃，130rpm，5天。

[0026] 本发明还公开了用上述赭绿青霉Penicillium ochrochloron产降粘酶的降粘方法；

[0027] 具体地，所述的降粘方法包括：

[0028] （1）．打浆：甘薯块茎原料洗净、打浆。

[0029] （2）.液化：按照90～150KNU/kg淀粉在甘薯浆中添加α-淀粉酶，80～90℃液化至碘反应为红棕色，冷却至室温后按料水比3:1添加自来水。

[0030] （3）.高温处理：液化后将甘薯浆在115℃高温下作用20min。

[0031] （4）.预处理：温度降低至30～50℃时，每公斤甘薯浆中添加40mL降粘酶，50℃作用2h。

[0032] 所述的α－淀粉酶标准酶活力为90KNU/g，酶活定义为在37℃，pH5.6时，每小时水解5.26克淀粉的酶量为1个KNU。

[0033] 所述的降粘酶即由赭绿青霉Penicillium ochrochloron发酵后经过离心，上清液再经过0.22μm过滤器过滤获得。

[0034] 所述的粘度测定仪器为上海尼润智能科技有限公司生产的RDV-2+PRO型数字式旋转粘度计。

[0035] 本发明通过筛选获得了一株产降粘酶的菌株赭绿青霉Penicilliumochrochloron，该菌株利用农业废弃物玉米芯为主要原料发酵产生降粘酶，有效利用了农业废弃物，成本低廉，该降粘酶应用于以非粮甘薯块茎为原料生产燃料乙醇发酵降粘预处理工艺中，降粘效果明显，大大降低了燃料乙醇的成产成本。

具体实施方式

[0036] 以下以具体实施例来说明本发明的技术方案，但并非是对本发明的技术方案的限制，本领域技术人员应该理解，依然可以对发明进行修改或等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的保护范围之中。

[0037] 实施例1

[0038] 赭绿青霉Penicillium ochrochloron能够在羧甲基纤维素钠(CMC)为唯一碳源的筛选培养基生长，30℃培养3天后，刚果红染液实验显示较大的黄色透明圈。

[0039] 实施例2

[0040] 赭绿青霉Penicillium ochrochloron接种于未经优化的发酵培养基后，30℃，130rpm培养4天后，50g液化并经过高温后的甘薯浆加入2mL经过离心和0.22μm过滤器过滤获得酶液，50℃作用2h后粘度下降率为75.78%。

[0041] 实施例3

[0042] 赭绿青霉Penicillium ochrochloron接种于50mL经优化的发酵培养基后，30℃，130rpm培养4天后，50g液化并经过高温后的甘薯浆加入2mL经过离心和0.22μm过滤器过滤获得酶液，50℃作用2h后粘度下降率为84.10%。

[0043] 实施例4

[0044] 赭绿青霉Penicillium ochrochloron接种于50mL经优化的发酵培养基后，30℃，130rpm培养5天后，50g液化并经过高温后的甘薯浆加入2mL经过离心和0.22μm过滤器过滤获得酶液，50℃作用2h后粘度下降率为89.09%。

[0045] 实施例5

[0046] 赭绿青霉Penicillium ochrochloron接种于200mL经优化的发酵培养基后，30℃，130rpm培养5天后，100g液化并经过高温后的甘薯浆加入4mL经过离心和0.22μm过滤器过滤获得酶液，50℃作用2h后粘度下降率为84.96%。

[0047] 实施例6

[0048] 赭绿青霉Penicillium ochrochloron接种于20L经优化的发酵培养基后，30℃，130rpm培养5天后，150g液化并经过高温后的甘薯浆加入3L经过离心获得酶液，50℃作用
2h后粘度下降率为89.95%。

[0049] 实施例7

[0050] 赭绿青霉Penicillium ochrochloron接种于20L经优化的发酵培养基后，30℃，130rpm培养5天后，300g液化并经过高温后的甘薯浆加入6L经过离心获得酶液，50℃作用