一种类产碱假单胞菌及其应用

摘要

本发明公开了一株类产碱假单胞菌及其应用。本发明从南美白对虾养殖塘底泥中筛选到一株类产碱假单胞菌（Pseudomonas？pseudoalcaligenes）FX13，其保藏编号为CCTCC？NO:M2013069。该菌株具有好氧、反硝化性能，对水体环境中的硝酸盐及亚硝酸盐具有高效的降解作用。

权利要求

1.一株类产碱假单胞菌，其保藏编号为CCTCC NO:M2013069。

2.权利要求1所述的类产碱假单胞菌在水体净化中的应用。

3.权利要求1所述的类产碱假单胞菌在制备微生物制剂中的应用。

4.一种微生物制剂，所述的微生物制剂包含有权利要求1所述的类产碱假单胞菌。

5.权利要求4所述的微生物制剂在水产养殖及污水处理中的应用。

说明书

一种类产碱假单胞菌及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于微生物应用技术领域，具体涉及一株类产碱假单胞菌及其应用。

背景技术

[0002] 近几十年来，我国水产养殖业迅猛发展，集约化、高密度养殖规模日益扩大。但由于养殖水体中积累大量的残饵、粪便及动植物尸体，导致水体氮元素含量严重超标，富营养化加剧，使得养殖生态环境遭到破坏，鱼虾病害频发，最终造成巨大的经济损失。研究表明，水产动物致病的主要根源是养殖水体中亚硝态氮含量的严重超标，亚硝酸盐可以氧化鱼虾体内的亚铁血红蛋白，使其成为高铁血红蛋白，导致其失去运输氧的能力，最后造成鱼虾死亡。所以，控制水体中的亚硝态氮成为规模化养殖的关键之一。

[0003] 与物理脱氮法相比，生物脱氮有其独特的优点：无二次污染,脱氮彻底,经济安全等。由于生物脱氮技术具有成本低、易操作、达标排放可靠性强且无二次污染等优点，逐渐成为食品工业废水处理的主要方式。好氧反硝化作用是近年来提出的与传统的缺氧反硝化脱氮相比具有独特优势的生物脱氮技术：一方面，在有氧条件下进行反硝化，硝化作用和反硝化作用可同时在一个反应器中进行，设备与操作成本大幅下降；另一方面，硝化作用的产物可直接作为反硝化作用的底物，避免抑制硝化作用，硝化和反硝化进程加剧。因此，好氧反硝化作用越来越受到人们的关注，国内外对于好氧反硝化菌的筛选研究也比较多，但其成果仍旧远远不能满足工业生产的实际需求。通过筛选分离好氧反硝化细菌，并对好氧反硝化菌的各种生长特性和反硝化特性进行深入研究，对养殖废水、生活废水及工业污水的脱氮处理有着重要的理论价值和实际意义。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种类产碱假单胞菌及其在水产养殖及污水处理中的应用。所述类产碱假单胞菌筛选自南美白对虾养殖塘的底泥，具有好氧反硝化的性能，能显著降低水体中的硝酸盐及亚硝酸盐。

[0005] 本 发 明 一 方 面 提 供 了 一 株 类 产 碱 假 单 胞 菌 FX13（Pseudomonas pseudoalcaligenes FX13），已于2013年3月6日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO:M2013069。

[0006] 上述的类产碱假单胞菌在水体净化中的应用，用于处理养殖水或生活污水。

[0007] 上述类产碱假单胞菌FX13可以菌粉的形式制成微生物添加剂

[0008] 本发明的类产碱假单胞菌FX13株营养需求简单，具有降低水体中硝酸盐及亚硝酸盐的能力，可开发为水产微生态制剂及污水处理剂，应用前景广阔。

具体实施方式

[0009] 实施例1：类产碱假单胞菌FX13分离筛选及鉴定

[0010] 1、培养基：

[0011] BTB培养基(/L)：琼脂20g、KNO31g、KH2PO41g、FeCl2·6H2O0.5g、CaCl2·7H2O0.2g、MgSO4·7H2O1g、琥珀酸钠8.5g、溴百里酚蓝(1%乙醇溶液)1mL，用1mol/L的NaOH调节pH至7.0～7.3，121℃灭菌20min，备用。

[0012] LB液体培养基(/L)：KNO31g、KH2PO41g、FeCl2·6H2O0.05g、CaCl2·7H2O0.02g、MgSO4·7H2O1g、琥珀酸钠8.5g，121℃灭菌20min，备用。

[0013] DM反硝化培养基(/L)：KNO30.72g、KH2PO41g、MgSO4·7H2O1g、琥珀酸钠2.8g，121℃灭菌20min，备用。

[0014] 2、筛选方法

[0015] 采用梯度稀释法将污泥样品稀释至适当浓度，取0.1mL均匀涂布于BTB培养基表面，置入恒温培养箱，30℃下培养2～3d后，用接种环挑取使周围培养基出现蓝色晕圈的单菌落，进行分离纯化即为初筛菌株，本次试验挑取了20株单菌落，并依此命名为FX1、FX2、FX3……、FX20。接种初筛菌株至LB培养基，在30℃、160r/min条件下进行液体培养24h后，以10%的接种量接种到反硝化培养基(DM培养基)中，30℃、160r/min条件下进行摇瓶处理，48h后取样测定实验体系中硝基氮浓度和亚硝基氮浓度，本次试验筛选出了降解硝- -基氮和亚硝基氮能力较强的菌株FX13（表1）。NO3-N：用紫外分光光度法测定；NO2-N：用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法测定。菌体量：光密度法，用721型分光光度计在600nm处测定吸光度值。

[0016] 表1各菌株培养48h发酵液中NO3--N、NO2--N浓度及TIN去除率

[0017]

[0018]

[0019] 3、鉴定

[0020] 1）菌落形态特征：将FX13菌株在营养琼脂培养基上培养18-24小时，呈现为灰黄色、不透明、表面湿润、无皱褶、直径约2-3mm菌落，镜检其细胞为短杆状。

[0021] 2）利用试剂盒提取FX13菌株基因组DNA，利用PCR技术扩增16S rRNA序列，测序后获得长度为1771bp的片段。通过BLAST比对分析，其与公布的多株类产碱假单胞菌的16S rRNA序列相似度最高，鉴定证实FX13菌株为类产碱假单胞菌，与生化鉴定结果一致。

[0022] 将FX13菌株命名为类产碱假单胞菌FX13（Pseudomonas pseudoalcaligenes FX13），已于2013年3月6日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO:M2013069。

[0023] 实施例2：类产碱假单胞菌FX13降解水产养殖废水实验

[0024] 将本发明筛选的类产碱假单胞菌FX13活化、扩大培养，经液态发酵，离心收集菌泥，加入淀粉载体，烘干制成100亿/g的菌粉。养殖废水取自青岛田横海参保苗池，经测定其硝态氮含量为54.42±1.15mg/L，亚硝态氮为0.18±0.03mg/L，实验容器为塑料桶，实验水体为10L，实验组按照质量比10ppm和50ppm添加类产碱假单胞菌FX13菌粉，对照组不加菌粉，实验组和对照组均设置3个平行，实验期间不间断曝气，各容器曝气量调至一致，实验温度为28℃恒温。在第3d时测定各实验组及对照组水体中的硝态氮及亚硝态氮的含量（表2）。

[0025] 表2养殖废水处理第3d各组中TIN去除率

[0026]组别 NO3–N（mg/L） NO2–N（mg/L） TIN去除率(%)
对照组 51.37±2.72 0.21±0.07 4.80