一种对产ESBLs大肠杆菌产生耐药抑制的中药筛选方法

摘要

一种对产ESBLs大肠杆菌产生耐药性影响的中药筛选方法，在96孔板上采用微量试管二倍稀释法测定西药和拟筛选中药对产ESBLs大肠杆菌株的最小抑菌浓度，然后在培养基中加入亚抑菌浓度的中药再次使用微量试管二倍稀释法培养测定西药的最小抑菌浓度；利用连续传代法在加有同样亚抑菌浓度中药和同样浓度西药的培养基中传代培养，直至观测到的西药最小抑菌浓度与传代前相比变小4倍以上，即可判断为该中药对西药具有耐药逆转作用。本发明不受细菌被中药作用后是否仍能培养的限制，能够避免中药杀菌作用和耐药逆转作用的冲突，扩大了中药的筛选种类和范围，操作方便，能够准确快速地判断筛选结果。

权利要求

1.一种对产ESBLs大肠杆菌产生耐药抑制的中药鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将耐药产ESBLs的大肠杆菌菌株进行分离，鉴定，并保存备用；

（2）在第一批96孔板上，采用微量试管二倍稀释法，分别测定西药和拟筛选中药对步骤（1）得到的耐药产ESBLs的大肠杆菌菌株的最小抑菌浓度，从而得出西药的最小抑菌浓度和拟筛选中药的亚抑菌浓度；

（3）根据步骤（2）所得的拟筛选中药的亚抑菌浓度，在培养基中加入亚抑菌浓度的拟筛选中药后，将该培养基加入第二批96孔板中，在第二批96孔板上再次采用微量试管二倍稀释法，测定西药对耐药产ESBLs的大肠杆菌菌株的最小抑菌浓度；

（4）根据步骤（2）所得的拟筛选中药的亚抑菌浓度，在培养基中加入亚抑菌浓度的拟筛选中药后，将该培养基加入第三批96孔板中；按照步骤（3）中的第二批96孔板上所有长菌的孔所对应的西药浓度，在第三批96孔板中加入同样浓度的西药，再采用连续传代法，将第二批96孔板上所有长菌的孔上的菌传至加有同样浓度西药的第三批96孔板中进行传代，培养16h后观测西药的最小抑菌浓度；

（5）按照步骤（4）所述的连续传代法，将第三批96孔板上所有长菌的孔上的菌传至加有同样亚抑菌浓度拟筛选中药和同样浓度西药的第四批96孔板中进行传代，培养16h后观测西药的最小抑菌浓度；依此传代，直至观测到的西药最小抑菌浓度与步骤（3）所得的西药最小抑菌浓度相比变小4倍以上，即判断拟筛选中药对耐药产ESBLs的大肠杆菌菌株具有耐药抑制作用，即拟筛选中药和西药体外作用于耐药产ESBLs的大肠杆菌菌株具有较好的抑制作用；

所述的西药为对产ESBLs的大肠杆菌耐受的西药；

所述的传代的传代数不超过10代。

说明书

一种对产ESBLs大肠杆菌产生耐药抑制的中药筛选方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种对产ESBLs大肠杆菌产生耐药抑制的中药筛选方法。

背景技术

[0002] 大肠杆菌是常见的条件致病菌，即可原发引起鸡急性败血症、腹膜炎、肝炎、肺炎、肠炎等多部位严重感染，亦可继发或混发于病毒病，给养殖业造成巨大的经济损失。其中阿莫西林、氨苄西林、头孢噻呋、头孢曲松、阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林/舒巴坦等β-内酰胺环类抗生素是防治该病的常用的重要药物，随着养殖规模集约化程度愈来愈大，用药愈来愈泛滥，其耐药菌株愈来愈多，关于大肠杆菌耐药性报道较多，目前研究证实耐药的主要机制之一是产生β-内酰胺酶，尤其是超广谱β-内酰胺酶，以下简称ESBLs，ESBLs可较强和快速的水解β-内酰胺环，使这类抗生素丧失抗菌活性。ESBLs是β-内酰胺酶的最主要酶型，ESBLs不仅对头孢三代和氨曲南耐药，而且对氨基糖苷类、喹诺酮类和磺胺类呈交叉耐药，仅对碳青霉烯类、头霉烯类药物敏感。目前许多文献已经报道大肠杆菌的多重耐药性与产生ESBLs有密切关系，国内外对其较为关注。本人开展了鸡源致病菌ESBLs的检测、提取、酶对抗生素的水解率及舒巴坦、他唑巴坦以及中药的抑酶保护作用等研究。对部分ESBLs大肠杆菌的药敏试验表明，其多重耐药率明显高于非ESBLs菌株。另外结果还表明产ESBLs菌株不仅对头孢噻呋等第三代头孢菌素严重耐药，而且亦对氟喹诺酮类、氨基糖苷类和磺胺类等多种抗菌药耐药，呈严重的多重耐药。目前细菌耐药性已成为人类的巨大挑战，尤其在2010年出现的“超级细菌”，使人类更加意识到耐药性细菌对人类产生的威胁。在2010年9月9日的《信息时报》中有报道称，超级细菌无药可治。钟南山院士提到滥用抗生素等于作茧自缚。还有报道提到未来十年，全世界将无抗生素可以应对超级细菌，如果滥用抗生素的势头不能得到遏制，人类将回到无抗生素时代，也就意味着重新回到用中药进行治疗的时代。

[0003] 目前关于研究中药对耐药菌的耐药抑制的研究报道也较多，其中的研究方法主要有两种：一种是影印药理学方法，另一种是耐药质粒消除方法。这两种方法成功的条件是中药作用细菌后，必须保证被作用后的细菌还能继续存活才能被培养成功再进行下一步耐药消除的验证实验。由于中药成分复杂，可以多靶位地作用于细菌，影响细菌不同阶段的生长，进而影响细菌不同的部位和不同的繁殖生长代谢环节，所以，不是所有中药作用细菌消除耐药性后仍能保证细菌生长。而利用上述两种方法进行筛选，只有不影响细菌生长的中药才能被筛选出来，严重地缩小了筛选中药的范围，另外还存在筛选时作用时间长短难以判断、筛选速度慢、操作繁琐和结果准确性难以判断的缺点。因此，实际生产中迫切需要一种可以快速准确地对耐药菌产生耐药影响的中药筛选方法。

发明内容

[0004] 本发明的目的是针对上述现有技术存在的不足，提供一种对产ESBLs大肠杆菌产生耐药抑制的中药筛选方法，使中药作用后的细菌无论是否能存活都能验证中药是否具有耐药抑制作用，扩大筛选的中药和西药范围，准确快速地判断筛选结果。

[0005] 本发明实现上述目的所采取的技术方案是：一种对产ESBLs大肠杆菌产生耐药抑制的中药筛选方法，包括以下步骤：

[0006] （1）将耐药产ESBLs的大肠杆菌菌株进行分离，鉴定，并保存备用；

[0007] （2）在第一批96孔板上，采用微量试管二倍稀释法，分别测定西药和拟筛选中药对步骤（1）得到的耐药产ESBLs的大肠杆菌菌株的最小抑菌浓度，从而得出西药的最小抑菌浓度和拟筛选中药的亚抑菌浓度；

[0008] （3）根据步骤（2）所得的拟筛选中药的亚抑菌浓度，在培养基中加入亚抑菌浓度的拟筛选中药后，将该培养基加入第二批96孔板中，在第二批96孔板上再次采用微量试管二倍稀释法，测定西药对耐药产ESBLs的大肠杆菌菌株的最小抑菌浓度；

[0009] （4）根据步骤（2）所得的拟筛选中药的亚抑菌浓度，在培养基中加入亚抑菌浓度的拟筛选中药后，将该培养基加入第三批96孔板中；按照步骤（3）中的第二批96孔板上所有长菌的孔所对应的西药浓度，在第三批96孔板中加入同样浓度的西药，再采用连续传代法，将第二批96孔板上所有长菌的孔上的菌传至加有同样浓度西药的第三批96孔板中进行传代，培养16h后观测西药的最小抑菌浓度；

[0010] （5）按照步骤（4）所述的连续传代法，将第三批96孔板上所有长菌的孔上的菌传至加有同样亚抑菌浓度拟筛选中药和同样浓度西药的第四批96孔板中进行传代，培养16h后观测西药的最小抑菌浓度；依此传代，直至观测到的西药最小抑菌浓度与步骤（3）所得的西药最小抑菌浓度相比变小4倍以上，即判断拟筛选中药对耐药产ESBLs的大肠杆菌菌株具有耐药抑制作用，即拟筛选中药和西药体外作用于耐药产ESBLs的大肠杆菌菌株具有较好的抑制作用。

[0011] 所述的传代的传代数不超过10代。

[0012] 本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：

[0013] （1）能够准确快速地判断拟筛选中药降低西药最小抑菌浓度的作用时间，以及随着作用时间的延长引起西药最小抑菌浓度变化的准确值。

[0014] （2）能够一次性筛选拟筛选中药影响的大量西药，一个96孔板至少能够筛选8个西药，效率高。

[0015] （3）操作方便。

[0016] （4）不受细菌被中药作用后是否仍能培养的限制，能够避免中药杀菌作用和耐药抑制作用的冲突，扩大了中药的筛选种类和范围。

[0017] （5）能够判断中药和西药之间的关系，如拮抗、协同、增强和是否随着作用时间的增长而增加西药的最小抑菌浓度值。

具体实施方式

[0018] 下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。

[0019] 实施例1

[0020] 对产TEM型大肠杆菌具有耐药抑制作用的泽兰中药的筛选，按照以下步骤进行：

[0021] （1）采用常规产ESBLs大肠杆菌初筛方法筛选产酶菌株，然后用PCR扩增方法进行确证产ESBLs类型为TEM型，保存备用；

[0022] （2）在第一批96孔板上，采用微量试管二倍稀释法，测定泽兰对耐药产ESBLs的大肠杆菌菌株的亚抑菌浓度，测定西药的最小抑菌浓度，西药为阿莫西林、环丙沙星、诺氟沙星、左旋氧氟沙星、克林沙星、磺胺间甲氧嘧啶钠、加替沙星和氟苯尼考。

[0023] （3）根据步骤（2）所得的泽兰的亚抑菌浓度，在培养基中加入亚抑菌浓度的泽兰后，将该培养基加入第二批96孔板中，在第二批96孔板上再次采用微量试管二倍稀释法，分别测定阿莫西林、环丙沙星、诺氟沙星、左旋氧氟沙星、克林沙星、磺胺间甲氧嘧啶钠、加替沙星和氟苯尼考对耐药产ESBLs的大肠杆菌菌株的最小抑菌浓度；

[0024] （4）根据步骤（2）所得的泽兰的亚抑菌浓度，在培养基中加入亚抑菌浓度的泽兰后，将该培养基加入第三批96孔板中；按照步骤（3）中的第二批96孔板上所有长菌的孔所对应的各种西药浓度，在第三批96孔板中加入同样浓度的各种西药，再采用连续传代法，将第二批96孔板上所有长菌的孔上的菌传至加有同样浓度西药的第三批96孔板中进行传代，培养16h后观测并记录各种西药的最小抑菌浓度；

[0025] （5）按照步骤（4）所述的连续传代法，将第三批96孔板上所有长菌的孔上的菌传至加有同样亚抑菌浓度泽兰和同样浓度西药的第四批96孔板中进行传代，培养16h后观测并记录西药的最小抑菌浓度；依此继续传代，直至观测到的西药最小抑菌浓度与步骤（3）所得的西药最小抑菌浓度相比变小4倍以上。

[0026] 筛选结果记录如下表所示：

[0027] 亚抑菌浓度泽兰培养基传代引起产ESBLs大肠杆菌西药最小抑菌浓度的变化（ug/ml）

[0028]

[0029] 结果表明经过含有亚抑菌浓度泽兰培养基传代后，上述西药对产ESBLs大肠杆菌的最小抑菌浓度均减小4倍以上，即可判断为泽兰对产ESBLs大肠杆菌具有耐药抑制作用。

[0030] 实施例2

[0031] 对产CTX-M型大肠杆菌具有耐药抑制作用救必应中药的筛选，按照以下步骤进行：

[0032] （1）采用常规产ESBLs大肠杆菌初筛方法筛选产酶菌株，然后用PCR扩增方法进行确证产ESBLs类型为CTX-M型，保存备用；

[0033] （2）在第一批96孔板上，采用微量试管二倍稀释法，测定救必应对耐药产ESBLs的大肠杆菌菌株的亚抑菌浓度，测定西药的最小抑菌浓度，西药为阿莫西林、诺氟沙星、左旋氧氟沙星、痢菌净、克林沙星、磺胺间甲氧嘧啶钠、加替沙星和氟苯尼考。

[0034] （3）根据步骤（2）所得的救必应的亚抑菌浓度，在培养基中加入亚抑菌浓度的救必应后，将该培养基加入第二批96孔板中，在第二批96孔板上再次采用微量试管二倍稀释法，分别测定阿莫西林、诺氟沙星、左旋氧氟沙星、痢菌净、克林沙星、磺胺间甲氧嘧啶钠、加替沙星和氟苯尼考对耐药产ESBLs的大肠杆菌菌株的最小抑菌浓度；

[0035] （4）根据步骤（2）所得的救必应的亚抑菌浓度，在培养基中加入亚抑菌浓度的救必应后，将该培养基加入第三批96孔板中；按照步骤（3）中的第二批96孔板上所有长菌的孔所对应的各种西药浓度，在第三批96孔板中加入同样浓度的各种西药，再采用连续传代法，将第二批96孔板上所有长菌的孔上的菌传至加有同样浓度西药的第三批96孔板中进行传代，培养16h后观测并记录各种西药的最小抑菌浓度；

[0036] （5）按照步骤（4）所述的连续传代法，将第三批96孔板上所有长菌的孔上的菌传至加有同样亚抑菌浓度救必应和同样浓度西药的第四批96孔板中进行传代，培养16h后观测并记录西药的最小抑菌浓度；依此继续传代，直至观测到的西药最小抑菌浓度与步骤（3）所得的西药最小抑菌浓度相比变小4倍以上。

[0037] 筛选结果记录如下表所示：

[0038] 亚抑菌浓度救必应培养基传代引起产ESBLs大肠杆菌西药最小抑菌浓度的变化（ug/ml）

[0039]

[0040] 结果表明经过含有亚抑菌浓度救必应培养基传代后，上述西药对产ESBLs大肠杆菌的最小抑菌浓度均减小4倍以上，即可判断为救必应对产ESBLs大肠杆菌具有耐药抑制作用。

[0041] 实施例3

[0042] 对产TEM和CTX-M型大肠杆菌具有耐药抑制作用鬼针草中药的筛选，按照以下步骤进行：

[0043] （1）采用常规产ESBLs大肠杆菌初筛方法筛选产酶菌株，然后用PCR扩增方法进行确证产ESBLs类型为TEM和CTX-M型，保存备用；

[0044] （2）在第一批96孔板上，采用微量试管二倍稀释法，测定鬼针草对耐药产ESBLs的大肠杆菌菌株的亚抑菌浓度，测定西药的最小抑菌浓度，西药为头孢曲松钠、阿莫西林、阿米卡星、强力霉素、环丙沙星和诺氟沙星。

[0045] （3）根据步骤（2）所得的鬼针草的亚抑菌浓度，在培养基中加入亚抑菌浓度的鬼针草后，将该培养基加入第二批96孔板中，在第二批96孔板上再次采用微量试管二倍稀释法，分别测定头孢曲松钠、阿莫西林、阿米卡星、强力霉素、环丙沙星和诺氟沙星对耐药产ESBLs的大肠杆菌菌株的最小抑菌浓度；

[0046] （4）根据步骤（2）所得的鬼针草的亚抑菌浓度，在培养基中加入亚抑菌浓度的鬼针草后，将该培养基加入第三批96孔板中；按照步骤（3）中的第二批96孔板上所有长菌的孔所对应的各种西药浓度，在第三批96孔板中加入同样浓度的各种西药，再采用连续传代法，将第二批96孔板上所有长菌的孔上的菌传至加有同样浓度西药的第三批96孔板中进行传代，培养16h后观测并记录各种西药的最小抑菌浓度；

[0047] （5）按照步骤（4）所述的连续传代法，将第三批96孔板上所有长菌的孔上的菌传至加有同样亚抑菌浓度鬼针草和同样浓度西药的第四批96孔板中进行传代，培养16h后观测并记录西药的最小抑菌浓度；依此继续传代，直至观测到的西药最小抑菌浓度与步骤（3）所得的西药最小抑菌浓度相比变小4倍以上。

[0048] 筛选结果记录如下表所示：

[0049] 亚抑菌浓度鬼针草培养基传代引起产ESBLs大肠杆菌西药最小抑菌浓度的变化（ug/ml）

[0050]

[0051] 结果表明经过含有亚抑菌浓度鬼针草培养基传代后，上述西药对产ESBLs大肠杆菌的最小抑菌浓度均减小4倍以上，即可判断为鬼针草对产ESBLs大肠杆菌具有耐药抑制作用。

[0052] 实施例4

[0053] 对产TEM型大肠杆菌不具有耐药抑制作用四方藤中药的筛选，按照以下步骤进行：

[0054] （1）采用常规产ESBLs大肠杆菌初筛方法筛选产酶菌株，然后用PCR扩增方法进行确证产ESBLs类型为TEM型，保存备用；

[0055] （2）在第一批96孔板上，采用微量试管二倍稀释法，测定四方藤对耐药产ESBLs的大肠杆菌菌株的亚抑菌浓度，测定西药的最小抑菌浓度，西药为头孢曲松钠、阿莫西林、阿米卡星、强力霉素、环丙沙星和诺氟沙星。

[0056] （3）根据步骤（2）所得的四方藤的亚抑菌浓度，在培养基中加入亚抑菌浓度的四方藤后，将该培养基加入第二批96孔板中，在第二批96孔板上再次采用微量试管二倍稀释法，分别测定头孢曲松钠、阿莫西林、阿米卡星、强力霉素、环丙沙星和诺氟沙星对耐药产ESBLs的大肠杆菌菌株的最小抑菌浓度；

[0057] （4）根据步骤（2）所得的四方藤的亚抑菌浓度，在培养基中加入亚抑菌浓度的四方藤后，将该培养基加入第三批96孔板中；按照步骤（3）中的第二批96孔板上所有长菌的孔所对应的各种西药浓度，在第三批96孔板中加入同样浓度的各种西药，再采用连续传代法，将第二批96孔板上所有长菌的孔上的菌传至加有同样浓度西药的第三批96孔板中进行传代，培养16h后观测并记录各种西药的最小抑菌浓度；

[0058] （5）按照步骤（4）所述的连续传代法，将第三批96孔板上所有长菌的孔上的菌传至加有同样亚抑菌浓度四方藤和同样浓度西药的第四批96孔板中进行传代，培养16h后观测并记录西药的最小抑菌浓度；依此继续传代至第十代，或者直至观测到的西药最小抑菌浓度与步骤（3）所得的西药最小抑菌浓度相比变小4倍以上。

[0059] 筛选结果记录如下表所示：

[0060] 亚抑菌浓度四方藤培养基传代引起产ESBLs大肠杆菌西药最小抑菌浓度的变化