布渣叶中黄酮类成分含量的快速测定方法

摘要

本发明公开了布渣叶中黄酮类成分含量的快速测定方法，用来测定布渣叶中表儿茶素、牡荆苷、异牡荆苷和水仙苷含量，其特征在于，其采用HPLC法对含量进行快速测定，该方法能一次性同时测定布渣叶中表儿茶素、牡荆苷、异牡荆苷和水仙苷4种黄酮类成分的含量。本发明提供的测定方法快速、简单、准确，灵敏度高，精密度、稳定性好，非常有利于在制药过程中布渣叶药材快速质量控制中的应用。

权利要求

1.一种布渣叶中黄酮类成分含量的快速测定方法，其特征在于其包括以下步骤：(1)色谱条件

色谱柱：Shiseido Capcell pak MG C18，4.6×250mm、5μm柱；流动相：以甲醇为流动相A，以水为流动相B，进行梯度洗脱；检测波长：280nm；流速：1.0mL/min；柱温：25℃；

梯度洗脱条件：

0～35分钟，流动相A21～35％，流动相B79～65％；

35～60分钟，流动相A35～48％，流动相B65～52％；

60～62分钟，流动相A48～80％，流动相B52～20％；

(2)对照品溶液的制备

取表儿茶素、牡荆苷、异牡荆苷和水仙苷对照品适量，精密称定，加70％甲醇制成每mL含表儿茶素60μg、牡荆苷25μg、异牡荆苷40μg和水仙苷60μg的混合溶液，即得；

(3)供试品溶液的制备

取布渣叶药材粉末过三号筛约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇

50mL，密塞，称定重量，超声功率200W频率40kHz，处理1小时，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

(4)测定法

分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪进行测定，得表儿茶素、牡荆苷、异牡荆苷和水仙苷的含量。

说明书

布渣叶中黄酮类成分含量的快速测定方法

技术领域

[0001] 本发明涉及中药的质量控制方法，具体涉及布渣叶中黄酮类成分含量的快速测定方法，可同时测定布渣叶中表儿茶素、牡荆苷、异牡荆苷和水仙苷4种黄酮类成分的含量的快速测定，属于中药质量检测技术领域。

背景技术

[0002] 布渣叶为椴树科植物破布叶Microcos paniculata L.的干燥叶，产于广东、广西、海南、云南等地，印度、印度尼西亚亦有分布；在我国，尤以两广地区资源丰富，其中广东的阳西、湛江为主产地，均以野生为主。本品味微酸，性凉，无毒，具有清热利湿、健胃消滞的功效，用于治疗感冒发热、黄疸、食欲不振、消化不良、脘腹胀痛、泄泻、疮疡、蜈蚣咬伤等。

[0003] 布渣叶主要含有黄酮、生物碱、有机酸、挥发油、鞣质、酚类等成分。其中的黄酮类成分具有多方面的生物活性，如抗脂质过氧化、抗衰老、清除自由基、降低血脂及血胆固醇、抗菌消炎、抗病毒、增强免疫功能等。

[0004] 现有技术中采用HPLC法仅公开对布渣叶中表儿茶素、牡荆苷、异牡荆苷和水仙苷4种黄酮类成分分别进行含量测定，已知的HPLC的含量快速测定方法均是对其中一种或两种黄酮进行测定，未公开记载同时对四种黄酮类成份进行测定的HPLC的含量快速测定方法，因此其过程较长、用时较多、效率不高。

[0005] 因此，目前亟需建立一种可同时测定布渣叶4种黄酮类成分的快速快速测定方法，该方法满足制药过程中布渣叶药材快速质量控制的要求。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供一种可同时测定布渣叶4种黄酮类成分的快速快速测定方法。

[0007] 本发明为实现上述目的所提供的技术方案是：

[0008] 一种布渣叶中黄酮类成分含量的快速测定方法，其特征在于，其采用HPLC法，该方法为一次性同时测定布渣叶中表儿茶素、牡荆苷、异牡荆苷和水仙苷4种黄酮类成分的含量。

[0009] 其具体包括以下步骤：

[0010] （1）色谱条件

[0011] 色谱柱：Shiseido Capcell pak MG C18(4.6×250mm，5μm)柱；流动相：以甲醇为流动相A，以水为流动相B，进行梯度洗脱；检测波长：280nm；流速：1.0mL/min；柱温：25℃；

[0012] 梯度洗脱条件为：

[0013] 0～35分钟，流动相A21～35%，流动相B79～65%；

[0014] 35～60分钟，流动相A35～48%，流动相B65～52%；

[0015] 60～62分钟，流动相A48～80%，流动相B52～20%；

[0016] （2）对照品溶液的制备

[0017] 取表儿茶素、牡荆苷、异牡荆苷和水仙苷对照品适量，精密称定，加70%甲醇制成每mL含表儿茶素60μg、牡荆苷25μg、异牡荆苷40μg和水仙苷60μg的混合溶液，即得；

[0018] （3）供试品溶液的制备

[0019] 取布渣叶药材粉末（过三号筛）约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇50mL，密塞，称定重量，超声处理(功率200W，频率40kHz)1小时，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

[0020] （4）测定法

[0021] 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪进行测定，得表儿茶素、牡荆苷、异牡荆苷和水仙苷的含量。

[0022] 本发明的快速测定方法简单、快速、准确，灵敏度高、精密度、稳定性好，可一次性同时测定未知含量的布渣叶样品中表儿茶素、牡荆苷、异牡荆苷和水仙苷含量，可用于制药过程中布渣叶药材快速质量控制。

附图说明

[0023] 图1，本发明实施例中布渣叶HPLC谱图，A.供试品；B.混合对照品；1表儿茶素；2牡荆苷；3异牡荆苷；4水仙苷。

具体实施方式

[0024] 本发明提供的采用HPLC法，同时测定布渣叶4种黄酮类成分的快速测定方法的步骤为：

[0025] 1仪器与试药

[0026] Agilent1200高效液相色谱仪，Mettler XS205DU型电子分析天平（瑞士）。

[0027] 布渣叶样品分别采收自广东省各市县及在各大医药公司购买，共收集10份，所有样品经广东省中医研究所刘法锦教授鉴定为：椴树科植物破布叶Microcos paniculata L.的干燥叶，为《中国药典》2010年版收载的品种。表儿茶素（批号：878-200102）、牡荆苷（批号：111687-200602）购于中国药品生物制品检定所；异牡荆苷（批号：Y-127-110705）、水仙苷（批号：S-063-110926）购于成都瑞芬思生物科技有限公司；甲醇为色谱纯，液相用水为屈臣氏蒸馏水，其余试剂均为分析纯。

[0028] 2方法与结果

[0029] 2.1色谱条件

[0030] 色谱柱：Shiseido Capcell pak MG C18(4.6×250mm，5μm)柱；流动相：以甲醇为流动相A，以水为流动相B，按下表进行梯度洗脱；检测波长：280nm；流速：1.0mL/min；柱温：25℃。

[0031] 梯度洗脱条件为：

[0032] 0～35分钟，流动相A21～35%，流动相B79～65%；

[0033] 35～60分钟，流动相A35～48%，流动相B65～52%；

[0034] 60～62分钟，流动相A48～80%，流动相B52～20%；

[0035] 2.2对照品溶液的制备

[0036] 取表儿茶素、牡荆苷、异牡荆苷和水仙苷对照品适量，精密称定，加70%甲醇制成每mL含表儿茶素145.80μg、牡荆苷58.10μg、异牡荆苷95.80μg和水仙苷144.40μg的混合溶液，作为储备液。

[0037] 2.3供试品溶液的制备

[0038] 取布渣叶药材粉末（过三号筛）约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇50mL，密塞，称定重量，超声处理(功率200W，频率40kHz)1小时，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

[0039] 2.4测定法

[0040] 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪进行测定。

[0041] 2.5线性关系考察

[0042] 精密量取混合对照品溶液0.5、1、2、4、6、8、10ml，分别置10ml量瓶中，加入70%甲醇溶解并稀释至刻度，得表儿茶素质量浓度为7.290、14.580、29.160、58.320、87.480、116.640、145.800μg/ml，牡荆 苷质量 浓度为 2.905、5.810、11.620、23.240、34.860、
46.480、58.100μg/ml，异牡荆苷质量浓度为4.790、9.580、19.160、38.320、57.480、
76.640、95.800μg/ml，水 仙 苷 质 量 浓 度 为 7.220、14.440、28.880、57.760、86.640、
115.520、144.400μg/ml的系列溶液。精密吸取上述系列溶液各10μl注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件进行测定。以峰面积积分值（Y）为纵坐标，进样量（X，μg/ml）为横坐标，进行线性回归，得回归方程为Y表儿茶素=6.1847X-9.3822（r=0.9999，n=7）；Y牡荆苷=14.671X-12.085（r=0.9999，n=7）；Y异牡荆苷=19.632X-26.722（r=0.9999，n=7）；Y水仙苷=8.1311X-13.749（r=0.9999，n=7）。结果表明，牡荆苷和异牡荆苷的进样量分别在
7.290-145.8、2.905-58.10、4.790-95.80、7.220-144.4μg/ml范围内与各自峰面积积分值呈良好线性关系。

[0043] 2.6精密度试验

[0044] 精密吸取同一混合对照品溶液（表儿茶素58.32μg、牡荆苷23.24μg、异牡荆苷38.32μg和水仙苷57.76μg）10μl，注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件重复进样6次，记录色谱图。结果，表儿茶素、牡荆苷、异牡荆苷和水仙苷峰面积的RSD分别为0.96%、
1.22%、1.04%和0.80%（n均为6），表明仪器精密度良好。

[0045] 2.7稳定性试验

[0046] 精密吸取同一供试品溶液（S10）10μl，分别于0、1、2、4、8、12、24h进样测定，记录峰面积。结果，表儿茶素、牡荆苷、异牡荆苷和水仙苷峰面积的RSD分别为1.08%、0.87%、0.56%和0.67%（n均为7），表明供试品溶液在24h内稳定性良好。

[0047] 2.8重复性试验

[0048] 精密称取同一批布渣叶样品（S9）适量，共6份，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算样品中表儿茶素、牡荆苷、异牡荆苷和水仙苷的质量分数。结果，表儿茶素的平均质量分数为0.0929%，RSD=1.18%（n=6）；牡荆苷的平均质量分数为0.1224%，RSD=0.89%（n=6）；异牡荆苷的平均质量分数为0.1604%，RSD=0.92%（n=6）；水仙苷的平均质量分数为0.2189%，RSD=0.98%（n=6），表明本方法重复性良好。

[0049] 2.9加样回收率试验

[0050] 取同一批已知质量分数的布渣叶样品(S9)9份，每份约0.5g，精密称定，分别精密加入一定质量浓度的表儿茶素、牡荆苷、异牡荆苷和水仙苷混合对照品的70%甲醇溶液50ml，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算加样回收率，结果分别见表1～4。

[0051] 表1表儿茶素加样回收率试验结果（n=9）

[0052]

[0053] 表2牡荆苷加样回收率试验结果（n=9）

[0054]

[0055] 表3异牡荆苷加样回收率试验结果（n=9）

[0056]

[0057] 表4水仙苷加样回收率试验结果（n=9）

[0058]

[0059] 2.10样品含量测定

[0060] 取不同来源的布渣叶样品适量，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进行含量测定，结果见表5；色谱见图1。

[0061] 表5样品含量测定结果

[0062]

[0063] 由以上实验结果可以得出，本发明的快速测定方法简单、快速、准确，灵敏度高、精密度、稳定性好，可同时测定未知含量的布渣叶样品中表儿茶素、牡荆苷、异牡荆苷和水仙苷含量，可用于制药过程中布渣叶药材快速质量控制。

[0064] 已经根据上述优选实施例对本发明作出了描述。应当理解的是前面的描述和实施例仅仅为了举例说明本发明。在不偏离本发明的精神和范围的前提下，本领域技术人员可以设计出本发明的多种替换方案和改进方案，其均应被理解为在本发明的保护范围之内。