本发明的大鼠CYP450酶亚型质谱绝对定量方法，属于蛋白质组学技术领域。本发明基于LC/MS/MS技术，利用CYP450酶经胰酶水解产生的特异性肽段对酶进行定量的策略，实现了同时对大鼠肝微粒体等体系中5种CYP450酶亚型CYP2D3、CYP2C70、CYP2A1、CYP2D26、CYP2B2的绝对定量。本发明主要包括如下步骤：蛋白样品的预处理、标准曲线的制备、质控样品的制备以及蛋白样品的测定。本发明的方法线性关系良好、准确度高、重现性好而且灵敏、精密、可靠，可用于新药开发、药物代谢研究及药物相互作用的评价。
1.一种大鼠CYP450酶质谱绝对定量方法，涉及5种CYP450酶亚型CYP2D3、CYP2C70、CYP2A1、CYP2D26、CYP2B2；过程有蛋白样品预处理，标准曲线制备，最后进行蛋白样品中CYP450酶亚型含量测定；
加入50mg固体变性剂，涡流溶解混匀，所述的固体变性剂，是尿素；
加入10μL pH缓冲液，涡流混匀，所述的pH缓冲液，是500mM的碳酸氢氨溶液；
加入4μL还原剂，涡流混匀，所述的还原剂，是300mM的二硫苏糖醇溶液；
于反应液中加入12μL半胱氨酸封闭剂，涡流混匀；室温孵育40min；所述的半胱氨酸封闭剂，是300mM的碘乙酰胺溶液；
经半胱氨酸封闭的反应液中加入400μL消化缓冲液，再加入20μL胰酶溶液，涡流混合，37℃孵育12～16h得到肝微粒体样品反应液，后13000g离心5min得肝微粒体样品酶解反应上清溶液；所述的消化缓冲液，是50mM的碳酸氢氨溶液；所述的胰酶溶液，是0.5mg/mL的胰酶溶液；
于固相萃取柱中加入1mL甲醇溶液，至液体自然流完；
于固相萃取柱中加入1mL洗脱溶液，至液体自然流完；
于固相萃取柱中加入1mL淋洗溶液，至液体自然流完，两遍洗；
于固相萃取柱中加入1mL淋洗溶液，至液体自然流完，三遍洗；
于固相萃取柱中加入1mL洗脱溶液，至液体自然流完，得肝微粒体样品洗脱液，置于聚乙烯管中；
所述的洗脱溶液，是按体积比乙腈/水/三氟乙酸=80/20/0.1的溶液，所述的淋洗溶液，是按体积比水/三氟乙酸=100/0.1的溶液；
将肝微粒体样品洗脱液真空离心蒸干，加入100μL去离子水，涡流混匀，得到肝微粒体样品复溶液；
利用去离子水将特异性肽段标准品溶解至5μg/μL，得到特异性肽段储备液；所述 的 特 异 性 肽 段 是 GNPESSFNDANLR、YIDFVPIPLPR、VHEEIEQVIG、FADIVPTNIPHMTSR、FADLAPIGLPHR；
利用去离子水将特异性肽段储备液分别稀释至50、100、300、1000、3000、10000pg/μL；
取20μL进行液相色谱-串联质谱分析，记录色谱图，以特异性肽段浓度为横坐标，特2
异性肽段峰面积为纵坐标，用加权W=1/x 最小二乘法进行回归运算，求得的直线回归方程，即为标准曲线；
所述的蛋白样品中CYP450酶亚型含量测定，是取肝微粒体样品复溶液20μL进行液相色谱-串联质谱分析，记录色谱图，将肽段峰面积代入标准曲线，求得肽段浓度，此肽段浓度即为对应CYP450酶亚型浓度；经样品蛋白浓度校正，即将CYP450酶亚型浓度除以蛋白浓度，得到蛋白样品中CYP450酶亚型含量；
在标准曲线制备及蛋白样品中CYP450酶亚型含量测定过程中，色谱条件为：LC-20ADXR SHIMADZU型液相色谱系统；色谱柱：peptideC18柱，
50mm×2.1mm I.D.，5μm粒径；流动相：甲酸体积百分数占0.1%的水和甲酸体积百分数占
0.1%的乙腈，梯度洗脱；柱温40℃；流速0.5mL/min；进样量20μL；所述的梯度洗脱程序，过程如下表所示：其中A是甲酸体积百分数占0.1%的水溶液，B是甲酸体积百分数占0.1%的乙腈混合溶液；
质谱条件为：Qtrap5500型线性离子阱液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾离子化源和AnaLyst1.5数据处理软件；离子源：电喷雾离子化源；正离子方式检测；离子喷射电压
5000V；温度500℃；源内气体1：氮气压力45psi；气体2：氮气压力45psi；气帘气体：氮气压力25psi；扫描方式为多重反应监测。
2.根据权利要求1所述的大鼠CYP450酶质谱绝对定量方法，其特征在于，样品测定期间利用质量控制样品对方法进行验证；所述的质量控制样品按照如下步骤制备：①利用去离子水将特异性肽段标准品溶解至5μg/μL，得到特异性肽段储备液；
②利用去离子水将特异性肽段储备液分别稀释至100、1000、3000pg/μL；
③标准肽段每浓度取三个样本，根据标准曲线，得出标准肽段浓度，计算质量控制样品准确度。
一种大鼠CYP450酶质谱绝对定量方法
技术领域
[0001] 本发明属于蛋白质组学的技术领域，涉及一种同时测定大鼠5种CYP450酶亚型生物质谱绝对定量方法。
背景技术
[0002] 药物进入体内后可经过代谢过程以一种或多种有活性或无活性的代谢产物形式排出体外。由于遗传多态性及表观遗传的因素，使得作用于药物代谢过程的酶有明显的种族差异和个体差异。因此，药物代谢酶的定性和定量分析对于药物开发，评价药物的代谢过程以及研究药物-药物相互作用具有重要的参考价值和意义。目前，用于酶定量分析的方法主要包括探针药物法、Western bLotting法、2-D电泳法和mRNA检测法，但这些方法都存在着一定的不足。例如，CYP450酶家族属于同工酶，其底物常常具有交叉现象，很难找到CYP450酶绝对专一的探针药物，至今只有极少数CYP450酶底物的专一性得到了全面的验证；CYP450酶特别是亚家族内同工酶序列存在高度同源性，这为Western bLotting法中所需特异性抗体的制备和纯化提出了很高的要求；2-D电泳法，操作连续性强，劳动密集，而且不能用于CYP450膜结合蛋白的分析；由于蛋白质的表达受到多种机制的调控，利用mRNA表达的水平代表其对应的蛋白含量并不十分可靠。这些方法的最大的不足是专属性差，无法区分同源性很高的如CYP2B1和CYP2B2等CYP450酶亚型；并且定量时仅能给出相对含量的信息，而酶的绝对含量对于评价其生物学意义是十分重要的。因此，建立一种药物代谢酶亚型绝对定量方法是十分必要的。
[0003] 与本发明相近的现有技术是CN102175804的发明专利申请。涉及的是测定人的CYP450酶亚型生物质谱绝对定量方法；在蛋白样品预处理中没有进行固相萃取和浓缩复溶，影响检测的定量准确性。
发明内容
[0004] 本发明要解决的技术问题是，建立一种可以同时测定大鼠的5种CYP450酶亚型生物质谱绝对定量方法。涉及的CYP450酶亚型是CYP2D3、CYP2C70、CYP2A1、CYP2D26、CYP2B2。
[0005] 本发明采取的技术方案是，选取经胰酶水解CYP450酶获得的特异性肽段，其中特异性是指肽段只由其相对应的CYP450酶经胰酶水解产生，其他蛋白质经胰酶水解并不能产生该肽段。基于液相色谱-串联质谱（LC/MS/MS）技术，利用多重反应监测（MRM）模式对特异性肽段进行扫描分析，建立特异性肽段稳定、可靠的LC/MS/MS定量方法。所测得特异性肽段浓度经由蛋白浓度校正获得CYP450酶亚型绝对含量。采取上述方法即可实现利用正常肽段定量CYP450酶亚型水平。正常肽段即是待测肽段。
[0006] 本发明的具体技术方案如下所述。
[0007] 一种大鼠CYP450酶质谱绝对定量方法，涉及5种CYP450酶亚型CYP2D3、CYP2C70、CYP2A1、CYP2D26、CYP2B2；过程有蛋白样品预处理，标准曲线制备，最后进行蛋白样品中CYP450酶亚型含量测定；
[0008] 所述的蛋白样品预处理，有如下5步骤，
[0009] （1）蛋白样品的还原，
[0010] 于聚乙烯管中加入100μL大鼠肝微粒体样品；
[0011] 加入50mg固体变性剂，涡流溶解混匀，所述的固体变性剂，是尿素；
[0012] 加入10μL pH缓冲液，涡流混匀，所述的pH缓冲液，是500mM的碳酸氢氨溶液；
[0013] 加入4μL还原剂，涡流混匀，所述的还原剂，是300mM的二硫苏糖醇溶液；
[0014] 37℃孵育1小时，得到反应液；
[0015] （2）半胱氨酸的封闭，
[0016] 于反应液中加入12μL半胱氨酸封闭剂，涡流混匀；室温孵育40min；所述的半胱氨酸封闭剂，是300mM的碘乙酰胺溶液；
[0017] （3）肝微粒体样品的胰酶消化，
[0018] 经半胱氨酸封闭的反应液中加入400μL消化缓冲液，再加入20μL胰酶溶液，涡流混合，37℃孵育12～16h得到肝微粒体样品反应液，后13000g离心5min得肝微粒体样品酶解反应上清溶液；所述的消化缓冲液，是50mM的碳酸氢氨溶液；所述的胰酶溶液，是0.5mg/mL的胰酶溶液；
[0019] （4）肝微粒体样品酶解反应液的固相萃取，
[0020] 于固相萃取柱中加入1mL甲醇溶液，至液体自然流完；
[0021] 于固相萃取柱中加入1mL洗脱溶液，至液体自然流完；
[0022] 于固相萃取柱中加入1mL淋洗溶液，至液体自然流完，两遍洗；
[0023] 取肝微粒体样品酶解反应上清溶液，至液体自然流完；
[0024] 于固相萃取柱中加入1mL淋洗溶液，至液体自然流完，三遍洗；
[0025] 于固相萃取柱中加入1mL洗脱溶液，至液体自然流完，得肝微粒体样品洗脱液，置于聚乙烯管中；
[0026] 所述的洗脱溶液，是按体积比乙腈/水/三氟乙酸=80/20/0.1的溶液，所述的淋洗溶液，是按体积比水/三氟乙酸=100/0.1的溶液；
[0027] （5）肝微粒体样品洗脱液的浓缩、复溶，
[0028] 将肝微粒体样品洗脱液真空离心蒸干，加入100μL去离子水，涡流混匀，得到肝微粒体样品复溶液；
[0029] 所述的标准曲线制备，是
[0030] 利用去离子水将特异性肽段标准品溶解至5μg/μL，得到特异性肽段储备液；
[0031] 利用去离子水将特异性肽段储备液分别稀释至50、100、300、1000、3000、10000pg/μL；
[0032] 取20μL进行液相色谱-串联质谱分析，记录色谱图，以特异性肽段浓度为横坐2
标，特异性肽段峰面积为纵坐标，用加权W=1/x 最小二乘法进行回归运算，求得的直线回归方程，即为标准曲线；
[0033] 所述的蛋白样品中CYP450酶亚型含量测定，是
[0034] 取肝微粒体样品复溶液20μL进行液相色谱-串联质谱分析，记录色谱图，将肽段峰面积代入标准曲线，求得肽段浓度，此肽段浓度即为对应CYP450酶亚型浓度；经样品蛋白浓度校正，即将CYP450酶亚型浓度除以蛋白浓度，得到蛋白样品中CYP450酶亚型含量；
[0035] 在标准曲线制备及蛋白样品中CYP450酶亚型含量测定过程中，
[0036] 色谱条件为：LC-20ADXR SHIMADZU型液相色谱系统；色谱柱：peptideC18柱，50mm×2.1mm I.D.，5μm粒径；流动相：甲酸体积百分数占0.1%的水和甲酸体积百分数占
0.1%的乙腈，梯度洗脱；柱温40℃；流速0.5mL/min；进样量20μL；所述的梯度洗脱程序，过程如下表所示：
[0037]
[0038] 其中A是甲酸体积百分数占0.1%的水溶液，B是甲酸体积百分数占0.1%的乙腈混合溶液；
[0039] 质谱条件为：Qtrap5500型线性离子阱液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾离子化源和AnaLyst1.5数据处理软件；离子源：电喷雾离子化源；正离子方式检测；离子喷射电压5000V；温度500℃；源内气体1：氮气压力45psi；气体2：氮气压力45psi；气帘气体：氮气压力25psi；扫描方式为多重反应监测。
[0040] 本发明的CYP450酶亚型生物质谱绝对定量方法，还可以在样品测定期间利用质量控制样品对方法进行验证；所述的质量控制样品，按照如下步骤制备：
[0041] ①利用去离子水将特异性肽段标准品溶解至5μg/μL，得到特异性肽段储备液；
[0042] ②利用去离子水将特异性肽段储备液分别稀释至100、1000、3000pg/μL；
[0043] ③标准肽段每浓度取三个样本，根据标准曲线，得出标准肽段浓度，计算质量控制样品准确度。
[0044] 本发明的优势在于：
[0045] 1、对多种CYP450酶亚型可同时进行分析和定量，具有高通量、灵敏度高、重现性好等特点。
[0046] 2、蛋白样品酶解液经过固相萃取和浓缩复溶后，减弱了样品测定过程中的基质干扰，使得测定结果更准确且定量下限降低。
[0047] 3、本发明所用试剂及药品较现有技术更廉价易得，且配制方法简单，利于方法推广。
[0048] 4、本发明的样品处理过程和定量方法简单易行，不仅适用于本发明中所述的5中CYP450酶亚型，对大鼠其他药物代谢酶亚型和不同种族药物代谢酶亚型的定性和定量研究具有指导借鉴意义，可用于新药开发、药物代谢研究及药物相互作用的评价。
附图说明
[0049] 图1是特异性肽段标准品典型色谱图。
[0050] 图2是实施例1得到的苯巴比妥诱导组肝微粒体样品中特异性肽段典型色谱图。
[0051] 图3是实施例1得到的空白对照组肝微粒体样品中特异性肽段典型色谱。
[0052] 图4是实施例1得到的苯巴比妥诱导组和空白对照组中相应的药物代谢酶亚型含量对比图。
具体实施方式
[0053] 实施例1：测定大鼠肝微粒体样品中5种CYP450酶亚型含量
[0054] 第一部分：大鼠肝微粒体样品的制备
[0055] A、大鼠的给药诱导过程
[0056] （1）选取体重为200g±10g两只雄性大鼠，自由饮食；
[0057] （2）购买市售苯巴比妥注射液，浓度为100mg/ml，使用前用生理盐水稀释至15mg/ml；
[0058] （3）给药过程如下
[0059] ①苯巴比妥诱导组：腹腔注射1mL苯巴比妥的生理盐水溶液（15mg/mL），连续3天，每日清晨给与一次，
[0060] ②空白对照组：腹腔注射1mL生理盐水溶液，连续3天，每日清晨给与一次；
[0061] B、大鼠肝微粒体的制备，
[0062] 两只大鼠分别进行如下操作：大鼠用断头法处死，放尽血液，迅速取出肝脏并称重。以下操作均在冰水浴中进行：用4℃的生理盐水反复冲洗肝脏，洗净血污，将肝脏剪3
碎，约2mm 大小，加入3倍于湿肝重量的50mM Tris-HCl缓冲液(150mM NaCl，5mM EDTA，
1%NP40，protease inhibitor cocktail，pH7.4)，用匀浆器制成匀浆。制得的肝匀浆在4℃下，9000g离心20min，取上层液经4层纱布过滤，滤液即为肝S9组分。肝S9组分在4℃下，
45000g离心3h，沉淀部分即为肝微粒体部分。肝微粒体部分用预冷的8M尿素，50mM碳酸氢铵溶液稀释成1/4原肝S9组分体积的混悬液，混匀，分装于冷冻管中，-80℃低温冰箱保存，得到两组（苯巴比妥诱导组和空白对照组）大鼠肝微粒体样品。
[0063] C、大鼠肝微粒体样品蛋白浓度的测定
[0064] 使用蛋白浓度测定仪测得两组大鼠肝微粒体样品的蛋白浓度如表2所示。
[0065] 表2大鼠肝微粒体样品蛋白浓度
[0066]
[0067] 第二部分：两组大鼠肝微粒体样品分别进行如下蛋白样品处理、CYP450酶亚型含量测定和考察酶亚型含量测定方法的准确性。
[0068] A、蛋白样品预处理
[0069] （1）肝微粒体样品的还原
[0070] ①于1.5mL聚乙烯管中加入100μL蛋白样品；
[0071] ②加入50mg固体变性剂，涡流溶解混匀，
[0072] ③加入10μL pH缓冲液，涡流混匀，
[0073] ④加入4μL还原剂，涡流混匀，
[0074] ⑤37℃孵育1小时，得到反应液；
[0075] （2）半胱氨酸的封闭
[0076] ①于(1)步骤反应液中加入12μL半胱氨酸封闭剂，涡流混匀；
[0077] ②室温孵育40min。
[0078] （3）肝微粒体样品的胰酶消化
[0079] ①于(2)步骤得到的反应液中加入400μL消化缓冲液；
[0080] ②加入20μL胰酶溶液，涡流混合；
[0081] ③37℃孵育过夜（12h至16h），
[0082] ④酶解液于13000g离心5min得上清溶液。
[0083] （4）肝微粒体样品酶解反应液的固相萃取，
[0084] ①于固相萃取柱中加入1mL甲醇溶液，至液体自然流完，
[0085] ②于固相萃取柱中加入1mL洗脱溶液，至液体自然流完，
[0086] ③于固相萃取柱中加入1mL淋洗溶液，至液体自然流完，两遍洗，
[0087] ④取肝微粒体样品酶解反应液上样，至液体自然流完，
[0088] ⑤于固相萃取柱中加入1mL淋洗溶液，至液体自然流完，三遍洗，
[0089] ⑥于固相萃取柱中加入1mL洗脱溶液，至液体自然流完，得洗脱液于聚乙烯管中；
[0090] （5）肝微粒体样品洗脱液的浓缩、复溶，
[0091] 将肝微粒体样品洗脱液真空离心蒸干，加入100μL去离子水，涡流混合，得到样品复溶液。
[0092] 上述步骤中涉及溶液配方如下：
[0093] 固体变性剂：尿素（carbamide），可以使用分析纯尿素固体粉末；
[0094] pH缓冲液：新鲜配置的500mM碳酸氢氨溶液（ammonium bicarbonate）；
[0095] 还原剂：300mM二硫苏糖醇溶液（dithiothreitoL）；
[0096] 半胱氨酸封闭剂：新鲜配制的300mM碘乙酰胺溶液（iodoacetamide）；
[0097] 消化缓冲液：50mM碳酸氢氨溶液（ammonium bicarbonate）；
[0098] 胰酶溶液：0.5mg/mL胰酶（trpsin）；
[0099] 洗脱溶液：乙腈/水/三氟乙酸=80/20/0.1(v/v/v)的溶液；
[0100] 淋洗溶液：水/三氟乙酸=100/0.1(v/v)的溶液。
[0101] B、标准曲线制备
[0102] ①利用去离子水将特异性肽段标准品溶解至5μg/μL，得到特异性肽段储备液；
[0103] ②利用去离子水将特异性肽段储备液分别稀释至50、100、300、1000、3000、10000pg/μL；
[0104] ③取20μL进行液相色谱-串联质谱分析，记录色谱图，以特异性肽段浓度为横坐2
标，特征肽段峰面积为纵坐标，用加权W=1/x 最小二乘法进行回归运算，求得的直线回归方程，即为标准曲线，如表3所示，特异性肽段标准品典型色谱图如图1所示。
[0105] 表3CYP450酶亚型特异性肽段典型标准曲线
[0106]
[0107] C、蛋白样品中CYP450酶亚型含量测定
[0108] 取经由A步骤处理后复溶液10μL进行LC/MS/MS分析，记录色谱图，苯巴比妥诱导组特异性肽段典型色谱图如图2，空白对照组特异性肽段典型色谱图如图3，将特异性肽段峰面积代入各自的标准曲线，求得肽段浓度。经蛋白浓度校正，即将CYP450酶亚型浓度(pg/μL)除以蛋白浓度(mg/mL)得到蛋白样品中CYP450酶亚型含量，所得结果如表4所示，两组肝微粒体样品中各CYP450酶亚型含量对比如图4所示。
[0109] 表4两组大鼠肝微粒体样品中5种CYP450酶含量
[0110]
[0111] D、质量控制样品制备
[0112] 按“标准曲线制备”项下操作，制备低、中、高三个浓度（100、1000、3000pg/μL）质量控制样品，每浓度至少三样本，根据标准曲线，得出肽段浓度。计算质量控制样品准确度，具体见表5，考察方法准确性。
[0113] 表5CYP450酶亚型特异性肽段质量控制样品准确度
[0114]
[0115] 上述步骤中涉及CYP450酶亚型特异性肽段测定的条件如下：
[0116] 1、色谱条件：日本岛津公司LC-20ADXR型液相色谱系统，包括二元输液泵，脱气机，自动进样器，柱温箱；色谱柱：peptide C18柱，50mm×2.1mm I.D.，5μm粒径；流动相：甲酸体积百分数占0.1%的水和甲酸体积百分数占0.1%的乙腈，梯度洗脱；柱温40℃；流速
0.5mL/min；进样量20μL。
[0117] 所述的梯度洗脱，其程序可参见表1。
[0118] 2、质谱条件：Qtrap5500型线性离子阱液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾离子化源和AnaLyst1.5数据处理软件；离子源：电喷雾离子化源；正离子方式检测；离子喷射电压5000V；温度500℃；源内气体1：氮气压力45psi；气体2：氮气压力45psi；气帘气体：氮气压力25psi；扫描方式为多重反应监测；各肽段离子对及其相应DP、CE以及CXP值见表6。
[0119] 表6肽段多重反应监测设定值
[0120]
[0121] 本发明所述的一种同时测定5种CYP450酶亚型生物质谱绝对定量方法线性关系良好、准确度高、重现性好而且灵敏、可靠，可用于上述5种CYP450酶亚型的绝对定量。
