抗IL-17的抗体转让专利
申请号 : CN201180048098.2
文献号 : CN103154026B
文献日 : 2016-07-06
发明人 : R·霍里克 , D·金 , P·鲍尔斯 , J·道尔顿 , B·吴 , T·罗伯茨 , X·张 , L·阿尔托贝尔三世
申请人 : 安奈普泰斯生物有限公司
摘要 :
本发明涉及一种分离的IL-17结合剂，其包括包含SEQ ID NO:1的免疫球蛋白重链多肽，以及任选地包含SEQ ID NO:23的免疫球蛋白轻链多肽，但SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:23的一个或多个特定残基被不同残基取代。本发明还包括使用IL-17结合剂治疗IL-17介导的疾病的载体、组合物和方法。
权利要求 :
1.一种分离的IL-17结合剂，其包括
(a)免疫球蛋白重链多肽，其包括互补决定区1(CDR1)氨基酸序列，所述CDR1氨基酸序列位于SEQ ID NO:78的氨基酸残基25至35之间，包含25和35在内；CDR2氨基酸序列，所述CDR2氨基酸序列位于SEQ ID NO:78的氨基酸残基50-67之间，包含50和67在内；CDR3氨基酸序列，所述CDR3氨基酸序列位于SEQ ID NO:78的氨基酸残基99至102之间，包含99和102在内，和(b)免疫球蛋白轻链多肽，其包括CDR1氨基酸序列，所述CDR1氨基酸序列位于SEQ ID NO:24的氨基酸残基24至35之间，包含24和35在内；CDR2氨基酸序列，所述CDR2氨基酸序列位于SEQ ID NO:24的氨基酸残基51-57之间，包含51和57在内；CDR3氨基酸序列，所述CDR3氨基酸序列位于SEQ ID NO:24的氨基酸残基90至98之间，包含90和98在内。
2.根据权利要求1所述的分离的IL-17结合剂，其中所述免疫球蛋白重链多肽包括SEQ ID NO:47、48、52-57、59-63、78或79中的任意一个。
3.根据权利要求2所述的分离的IL-17结合剂，其中所述免疫球蛋白重链多肽包括SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:78。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的分离的IL-17结合剂，其中所述免疫球蛋白轻链多肽包括SEQ ID NO:24。
5.根据权利要求1-3任意一项所述的分离的IL-17结合剂，其是抗体、抗体偶联物或其抗原结合片段。
6.根据权利要求5所述的分离的IL-17结合剂，其为人抗体、非人抗体、或嵌合抗体。
7.一种载体，其包含核酸序列，所述核酸序列编码权利要求1-6任意一项所述的分离的IL-17结合剂。
8.一种组合物，其包含如权利要求1-6任意一项所述的分离的IL-17结合剂或如权利要求7所述的载体以及药学上可接受的载体。
9.一种如权利要求8所述的组合物用于制备在哺乳动物中治疗IL-17介导的疾病的药物中的用途，其中所述IL-17介导的疾病选自下组：强直性脊柱炎、结直肠癌、骨质疏松症、牛皮癣、牛皮癣关节炎、类风湿性关节炎和葡萄膜炎。
10.根据权利要求9所述的用途，其中所述IL-17结合剂(a)在哺乳动物中的半衰期为5至28天，(b)与IL-17结合的KD值小于或等于1纳摩尔，和/或(c)与IL-17结合的KD值小于或等于200皮摩尔。
说明书 :
抗IL-17的抗体
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本专利申请要求2010年8月5日提交的美国临时专利申请号61/370,978的优先权，其通过引用并入本文。
[0003] 通过引用并入的以电子形式提交的材料
[0004] 与本文一并提交的计算机可读核苷酸/氨基酸序列表通过整体引用并入本文，所述序列表为2011年8月1日创建的名为“708661_ST25.TXT”的ASCII（TXT）文件，其大小为
119,414字节。
119,414字节。
发明背景
[0005] 白介素-17（IL-17）是一种由活化的T-细胞分泌的促炎性细胞因子。细胞因子IL-17家族包括IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E（也称为IL-25）和IL-17F，以及该家族的原型成员被称为IL-17A（参见，例如，Moseley等,Cytokine Growth Factor Rev.,14(2):155-74
(2003)）。IL-17家族的所有成员均具有类似的蛋白结构，其具有对其三维形状发挥关键作用的四个高度保守的半胱氨酸残基，但其与任何其他已知的细胞因子均不具有序列相似
性。然而，在猴疱疹病毒的开放阅读框13中发现了IL-17A的病毒同系物（参见，例如Yao等,Immunity,3:811(1995)），其与人IL-17A具有72%的氨基酸残基同一性。
(2003)）。IL-17家族的所有成员均具有类似的蛋白结构，其具有对其三维形状发挥关键作用的四个高度保守的半胱氨酸残基，但其与任何其他已知的细胞因子均不具有序列相似
性。然而，在猴疱疹病毒的开放阅读框13中发现了IL-17A的病毒同系物（参见，例如Yao等,Immunity,3:811(1995)），其与人IL-17A具有72%的氨基酸残基同一性。
[0006] 已报道了IL-17家族成员的多种功能，其主要涉及免疫应答的调控。例如，IL-17参与上调粘附分子和诱导多种类型的细胞产生多种炎性细胞因子和趋化因子，所述多种细胞类型包括滑膜细胞、软骨细胞、成纤维细胞、内皮细胞、上皮细胞、角化细胞、和巨噬细胞。而且，IL-17通过诱导趋化因子的释放来诱导中性粒细胞募集至炎症部位，刺激前列腺素和金属蛋白酶产生、以及抑制蛋白多糖合成。IL-17在造血祖细胞的成熟过程中发挥了重要作
用，并且IL-17在不同器官和组织中具有信号传导的作用，所述器官和组织包括肺、关节软骨、骨、脑、造血细胞、肾、皮肤和肠（参见，例如Kolls and Linden,Immunity,21:467-476(2004)，和Fossiez等,Int.Rev.Immunol.,16:541(1998)）。IL-17还能够诱导金属蛋白酶
（MMP）的产生并且使金属蛋白酶组织抑制剂（TIMP）下调（参见，例如Jovanovic等,
J.Rheumatol.,28:712-718(2001)），以及阻断IL-1和IL-17在体内对炎症和骨破坏具有协
同作用（参见，例如Chabaud等,Arthritis Rheum.,44:1293-1303(2001)）。
用，并且IL-17在不同器官和组织中具有信号传导的作用，所述器官和组织包括肺、关节软骨、骨、脑、造血细胞、肾、皮肤和肠（参见，例如Kolls and Linden,Immunity,21:467-476(2004)，和Fossiez等,Int.Rev.Immunol.,16:541(1998)）。IL-17还能够诱导金属蛋白酶
（MMP）的产生并且使金属蛋白酶组织抑制剂（TIMP）下调（参见，例如Jovanovic等,
J.Rheumatol.,28:712-718(2001)），以及阻断IL-1和IL-17在体内对炎症和骨破坏具有协
同作用（参见，例如Chabaud等,Arthritis Rheum.,44:1293-1303(2001)）。
[0007] IL-17（即，IL-17A）不适宜的产生或产生增加与多种疾病相关，如气道炎症、哮喘、类风湿性关节炎（RA）、骨关节炎、骨质疏松、骨质侵蚀、腹膜内脓肿和粘连、炎性肠病（IBD）、慢性阻塞性肺病（COPD）、艾迪生氏病、丙种球蛋缺乏症、过敏性哮喘、斑秃、乳糜泻、查加斯病、原发性肺纤维化、克隆氏病、溃疡性结肠炎、同种异体移植排斥（例如，肾）、牛皮癣关节炎、葡萄膜炎、白塞氏病、某些类型的癌症、血管新生、动脉粥样硬化、多发性硬化症（MS）、系统性红斑狼疮、败血症、脓毒性或内毒素性休克、对过敏原暴露的应答、幽门螺杆菌相关性胃炎、支气管哮喘、强制性脊柱炎、狼疮肾炎、牛皮癣、缺血、系统性硬化症、中风以及其他炎性疾病（参见，例如Witowski等,Cell Mol.Life Sci.,61:567-579(2004)；Antonysamy等,J.Immunol.,162:577-584(1999),van Kooten等,J.Am.Soc.Nephrol.,9:1526-1534(1998)；Molet等,J.Allergy Clin.Immunol.,108:430-438(2001)；Teunissen等,
J.Invest.Dermatol.,111:645-649(1998)；和Kurasawa等,Arthritis Rheum.,43:2455-
2463(2000)）。
J.Invest.Dermatol.,111:645-649(1998)；和Kurasawa等,Arthritis Rheum.,43:2455-
2463(2000)）。
[0008] 从上述内容可以看出，IL-17可能是某些炎性或自身免疫性疾病的治疗靶点。出于这个目的，已有研究提出采用与IL-17结合的抗体治疗IL-17介导的疾病和病症（参见，例如国际专利申请公开号WO2006/013107和WO2007/117749；以及美国专利申请公开号2008/
0269467A1和2009/0280131A1）。此外，通过IL-17特异性抗体或与IL-17结合的可溶性受体阻断IL-17的生物活性，能够在多种动物关节炎模型中减轻炎症和骨侵蚀（参见，例如
Lubberts等,Arthritis&Rheumatism,50:650-659(2004)）。但是，由于其在体内的药代动力学性质、稳定性和疗效不理想，导致目前IL-17抗体的治疗应用受到局限。
0269467A1和2009/0280131A1）。此外，通过IL-17特异性抗体或与IL-17结合的可溶性受体阻断IL-17的生物活性，能够在多种动物关节炎模型中减轻炎症和骨侵蚀（参见，例如
Lubberts等,Arthritis&Rheumatism,50:650-659(2004)）。但是，由于其在体内的药代动力学性质、稳定性和疗效不理想，导致目前IL-17抗体的治疗应用受到局限。
[0009] 因此，需要一种IL-17结合剂（例如，抗体），其与IL-17具有较高的结合亲和性，在体内显示出增加的稳定性、改善的药代动力学性质、和有效中和IL-17的活性。本发明即提供了这样一种IL-17结合剂。
[0010] 发明概述
[0011] 本发明提供了一种分离的IL-17结合剂，其包括下述中的一种或两种：（a）免疫球蛋白重链多肽，其包括SEQ ID NO:1，但其中SEQ ID NO:1的残基32、53和59中的一个或多个被不同残基取代，以及任选地SEQ ID NO:1的残基30、31、35、40、50、52、53、59、62、66、69、75、79、88和97中的一个或多个被不同残基取代，或其包含至少五个氨基酸的片段，以及（b）免疫球蛋白轻链多肽，其包括SEQ ID NO:23，但其中SEQ ID NO:23的残基9、10、11、13、17、
20、21和22中的一个或多个被不同残基取代，或者与SEQ ID NO:23具有至少85%同一性的氨基酸序列。
20、21和22中的一个或多个被不同残基取代，或者与SEQ ID NO:23具有至少85%同一性的氨基酸序列。
[0012] 本发明还提供了一种包含免疫球蛋白重链多肽的分离的IL-17结合剂，所述免疫球蛋白重链多肽包括氨基酸序列SEQ ID NO:1，但其中SEQ ID NO:1的残基50被S、A、或I残基取代，以及任选地SEQ ID NO:1的残基31、32、35、40、52、62、66、88、和97中的一个或多个被不同残基取代，或者与SEQ ID NO:1具有至少85%同一性的氨基酸序列。
[0013] 本发明进一步提供了一种包含免疫球蛋白重链多肽的分离的IL-17结合剂，所述免疫球蛋白重链多肽包括氨基酸序列SEQ ID NO:1，但其中SEQ ID NO:1的残基104、109、和
115中的一个或多个被不同残基取代，以及任选地SEQ ID NO:1的残基100、101、102、106、
107、108、和111中的一个或多个被不同残基取代，或者与SEQ ID NO:1具有至少85%同一性的氨基酸序列。
115中的一个或多个被不同残基取代，以及任选地SEQ ID NO:1的残基100、101、102、106、
107、108、和111中的一个或多个被不同残基取代，或者与SEQ ID NO:1具有至少85%同一性的氨基酸序列。
[0014] 本发明提供了一种包含免疫球蛋白重链多肽的分离的IL-17结合剂，所述免疫球蛋白重链多肽包括氨基酸序列SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:78、或SEQ ID NO:
79，或者与所述序列具有至少85%同一性的氨基酸序列。
79，或者与所述序列具有至少85%同一性的氨基酸序列。
[0015] 附图简述
[0016] 图1显示了皮下给予每只小鼠1、3、和10μg剂量的hIL-17后，KC（CXCL1）随时间变化的曲线。
[0017] 图2显示了给予小鼠hIL-17两小时后，抗IL17抗体（与SEQ ID NO:24与SEQ ID NO:4配对）对血清KC水平的剂量依赖性的抑制。
[0018] 图3显示了实施例2中描述的HC和LC结合的BIACORETMA100解离曲线。
[0019] 图4显示了实施例3中描述的人类风湿性关节炎（RA）滑膜成纤维细胞中IL-6释放试验的结果。
[0020] 图5显示了ELISA的检测结果，ELISA用于检测实施例4中描述的抗IL17a抗体对受体-配体结合的抑制。
[0021] 发明详述
[0022] 本发明提供了一种分离的IL-17结合剂，其包括免疫球蛋白重链多肽和/或分离的免疫球蛋白轻链多肽，或其片段（例如，免疫原性片段）。“IL-17结合剂”指与细胞因子IL-17特异性结合的分子，尤其是蛋白质分子。优选地，IL-17结合剂是抗体或其片段（例如，免疫原性片段）。如本文所使用的，术语“免疫球蛋白”或“抗体”指在脊椎动物血液或其他体液中发现的蛋白，其被免疫系统用于识别和中和外源性物质，如细菌和病毒。完整的免疫球蛋白通常由四个多肽组成：两个相同的重链（H）多肽和两个相同的轻链（L）多肽。各重链均含有一个N端可变（VH）区和三个C端恒定（CH1、CH2和CH3）区，并且各轻链均含有一个N端可变（VL）区和一个C端恒定（CL）区。根据其恒定结构域的氨基酸序列，可以将抗体的轻链分成两种不同类型，即κ或λ。在典型的免疫球蛋白中，各轻链与重链通过二硫键连接，并且两条重链之间通过二硫键相互连接。轻链可变区与重链可变区对齐，轻链恒定区与重链第一恒定区对
齐。重链其余的恒定区相互对齐。
齐。重链其余的恒定区相互对齐。
[0023] 各对轻链和重链的可变区形成抗体的抗原结合位点。VH和VL区具有相同的基本结构，各区域均包含四个框架区，其序列相对保守。框架区通过三个互补决定区（CDR）相连。三个CDR，已知为CDR1、CDR2、和CDR3，形成抗体的“高变区”，其负责与抗原结合。四个框架区（FW或FR）大部分采用β-片层构象，CDR形成环状连接，在某些情况下包括β-片层构象。轻链和重链的恒定区并不直接涉及抗体与抗原的结合，但是表现出不同的效应器功能，如通过
效应器分子和细胞之间的相互作用来参与抗体依赖性细胞毒作用。
效应器分子和细胞之间的相互作用来参与抗体依赖性细胞毒作用。
[0024] 本发明的IL-17结合剂能够优选地与白介素-17（IL-17或IL-17A）结合。IL-17A是称为IL-17家族的一组细胞因子的重要成员。最初将IL-17A鉴定为啮齿类动物T-细胞杂交
瘤的转录产物，在啮齿类动物中被称为CTLA8（Rouvier等,J.Immunol.,150(12):5445-5456(1993)）。IL-17A与被称为IL-17R的I型细胞表面受体结合，IL-17R至少具有三个变体
IL17RA、IL17RB、和IL17RC（Starnes等,J.Immunol.,169(2):642-646(2002)）。除了IL-17A以外，IL-17家族还包括细胞因子IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E（也称为IL-25）、和IL-
17F。IL-17家族的所有成员均具有相似的蛋白结构，其具有对其三维结构十分关键的四个
高度保守的半胱氨酸残基，但其与任何其他已知的细胞因子均不具有序列相似性。
瘤的转录产物，在啮齿类动物中被称为CTLA8（Rouvier等,J.Immunol.,150(12):5445-5456(1993)）。IL-17A与被称为IL-17R的I型细胞表面受体结合，IL-17R至少具有三个变体
IL17RA、IL17RB、和IL17RC（Starnes等,J.Immunol.,169(2):642-646(2002)）。除了IL-17A以外，IL-17家族还包括细胞因子IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E（也称为IL-25）、和IL-
17F。IL-17家族的所有成员均具有相似的蛋白结构，其具有对其三维结构十分关键的四个
高度保守的半胱氨酸残基，但其与任何其他已知的细胞因子均不具有序列相似性。
[0025] 如上文所讨论的，IL-17蛋白家族成员表现出多种免疫调节功能，这主要是由于其能够诱导免疫信号分子。特别地，IL-17表现出能够诱导和介导促炎性应答，其通常与过敏应答相关。IL-17诱导细胞因子，如IL-6、G-CSF、GM-CSF、IL-1β、TGF-β、TNF-α、趋化因子（例如，IL-8、GRO-α、和MCP-1）和前列腺素（例如，PGE2）从多种细胞类型（例如，成纤维细胞、内皮细胞、上皮细胞、角化细胞、和巨噬细胞）产生。细胞因子的释放可引起多种功能，如气道重塑，其是IL-17应答的特征。趋化因子的表达增加吸引包括中性粒细胞在内的其他细胞，但不包括嗜酸性粒细胞。IL-17的功能对CD4+T-细胞亚类也是必须的，CD4+T-细胞亚类被称为T辅助17（Th17）细胞的。如此，IL-17蛋白家族与多种免疫和自身免疫相关疾病的病理学相关，包括但不限于，类风湿性关节炎、哮喘、狼疮、同种异体移植排斥、和抗-肿瘤免疫（参见，例如Aggarwal等,J.Leukoc.Biol.,71(1):1-8(2002)）。本发明的IL-17结合剂能够与本文所述的IL-17蛋白家族的任意成员，例如IL-17A和/或IL-17F，结合。在一个优选实施方式中，IL-17结合剂与IL-17A蛋白结合。在另一个实施方式中，IL-17结合剂能够与IL-17A人
和/或非人直系同源物结合或交叉反应。
和/或非人直系同源物结合或交叉反应。
[0026] 本发明的分离的IL-17结合剂包括免疫球蛋白重链多肽，或其中的包含至少五个氨基酸的片段，和/或免疫球蛋白轻链多肽，或其中的包含至少五个氨基酸的片段。在一个实施方式中，分离的IL-17结合剂包括免疫球蛋白重链多肽或免疫球蛋白轻链多肽。在另一个实施方式中，分离的IL-17结合剂包括免疫球蛋白重链多肽和免疫球蛋白轻链多肽。能够与IL-17蛋白家族中的一个或多个成员结合的若干免疫球蛋白重链和轻链的氨基酸序列均
为本领域所公知的（参见，国际专利申请公开号WO2006/013107和WO2007/117749；以及美国专利申请公开号2008/0269467A1和2009/0280131A1）。
为本领域所公知的（参见，国际专利申请公开号WO2006/013107和WO2007/117749；以及美国专利申请公开号2008/0269467A1和2009/0280131A1）。
[0027] 与IL-17结合的免疫球蛋白重链多肽的一个例子包括SEQ ID NO:1，或与SEQ ID NO:1具有至少85%同一性的氨基酸序列（例如，与其具有至少86%、至少87%、至少88%、至少
89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的同一性）。在本发明中，免疫球蛋白重链多肽包括SEQ ID NO:1，但其中SEQ ID NO:1的一个或多个残基被不同氨基酸残基取代。在这一方面，SEQ ID NO:1中残基
32、53、和59中的一个或多个被不同残基取代，并且任选地SEQ ID NO:1中残基30、31、35、
40、50、52、53、59、62、66、69、75、79、88、和97中的一个或多个被不同残基取代。SEQ ID NO:1中的各氨基酸残基30、31、35、40、50、52、53、59、62、66、69、75、79、88、和97均可以被任意适宜的氨基酸残基取代，其在各位置可以相同或不同。氨基酸的“替换”或“取代”指在给定位置的一个氨基酸或残基被在相同位置的另一个氨基酸或多肽序列内的残基取代。
89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的同一性）。在本发明中，免疫球蛋白重链多肽包括SEQ ID NO:1，但其中SEQ ID NO:1的一个或多个残基被不同氨基酸残基取代。在这一方面，SEQ ID NO:1中残基
32、53、和59中的一个或多个被不同残基取代，并且任选地SEQ ID NO:1中残基30、31、35、
40、50、52、53、59、62、66、69、75、79、88、和97中的一个或多个被不同残基取代。SEQ ID NO:1中的各氨基酸残基30、31、35、40、50、52、53、59、62、66、69、75、79、88、和97均可以被任意适宜的氨基酸残基取代，其在各位置可以相同或不同。氨基酸的“替换”或“取代”指在给定位置的一个氨基酸或残基被在相同位置的另一个氨基酸或多肽序列内的残基取代。
[0028] 氨基酸可被大致分成“芳香族”或“脂肪族”。芳香族的氨基酸包含芳环。“芳香族”氨基酸的例子包括组氨酸（H或His）、苯丙氨酸（F或Phe）、酪氨酸（Y或Tyr）、和色氨酸（W或Trp）。非芳香族氨基酸可被大致分为“脂肪族”。“脂肪族”氨基酸的例子包括甘氨酸（G或Gly）、丙氨酸（A或Ala）、缬氨酸（V或Val）、亮氨酸（L或Leu）、异亮氨酸（I或Ile）、甲硫氨酸（M或Met）、丝氨酸（S或Ser）、苏氨酸（T或Thr）、半胱氨酸（C或Cys）、脯氨酸（P或pro）、谷氨酸（E或Glu）、天冬氨酸（A或Asp）、天冬酰胺（N或Asn）、谷氨酰胺（Q或Gln）、赖氨酸（K或Lys）、和精氨酸（R或Arg）。
[0029] 可以将脂肪族氨基酸再分成四个亚组。“大脂肪族非极性亚组”由缬氨酸、亮氨酸、和异亮氨酸组成。“脂肪族微极性亚组”由甲硫氨酸、丝氨酸、苏氨酸、和半胱氨酸组成。“脂肪族极性/带电荷亚组”由谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、和精氨酸组成。“小残基亚组”由甘氨酸和丙氨酸组成。可以将带电荷/极性氨基酸组再细分成三个亚组：
“正电荷亚组”由赖氨酸和精氨酸组成，“负电荷亚组”由谷氨酸和天冬氨酸组成，以及“极性亚组”由天冬酰胺和谷氨酰胺组成。
“正电荷亚组”由赖氨酸和精氨酸组成，“负电荷亚组”由谷氨酸和天冬氨酸组成，以及“极性亚组”由天冬酰胺和谷氨酰胺组成。
[0030] 可以将芳香族氨基酸再分成两亚组：“氮环亚组”由组氨酸和色氨酸组成以及“苯基亚组”由苯丙氨酸和酪氨酸组成。
[0031] 短语“保守性氨基酸取代”或“保守性突变”指一个氨基酸被与其具有相同性质的另一个氨基酸取代。确定各氨基酸之间共同性质的有效方法为分析同源有机体相应蛋白间氨基酸变化的归一化频率（Schulz,G.E.and R.H.Schirmer,Principles of Protein
Structure,Springer-Verlag,New York(1979)）。根据这样的分析，可以将氨基酸的组定义为组内的氨基酸可以优选地互换，因而其对总体蛋白结构的影响彼此最为类似（Schulz,
G.E.and R.H.Schirmer，同上）。
Structure,Springer-Verlag,New York(1979)）。根据这样的分析，可以将氨基酸的组定义为组内的氨基酸可以优选地互换，因而其对总体蛋白结构的影响彼此最为类似（Schulz,
G.E.and R.H.Schirmer，同上）。
[0032] 保守性氨基酸取代的例子包括上述亚组内部的氨基酸取代，例如赖氨酸可换为精氨酸，反之亦然，这样可以保持其带有正电荷；谷氨酸可换为天冬氨酸，反之亦然，这样可以保持其带有负电荷；丝氨酸可换为苏氨酸，这样能够保持其具有游离的-OH；以及谷氨酰胺可换为天冬酰胺，这样能够保持其具有游离的-NH2。
[0033] “半保守性突变”包括用属于上文所列同一组但不属于同一亚组的氨基酸进行的氨基酸取代。例如，将天冬氨酸换成天冬酰胺，或将天冬酰胺换成赖氨酸的突变均涉及属于同一组但是不同亚组的氨基酸。“非保守性突变”涉及不同组之间的氨基酸取代，例如将赖氨酸替换成色氨酸，或将苯丙氨酸替换成丝氨酸等。
[0034] 在一个实施方式中，分离的IL-17结合剂包括免疫球蛋白重链多肽，其包含SEQ ID NO:1，但SEQ ID NO:1的残基32被H（组氨酸）、S（丝氨酸）、或F（苯丙氨酸）残基取代、SEQ ID NO:1的残基53被E（谷氨酸）或H（组氨酸）残基取代、SEQ ID NO:1的残基59被H（组氨酸）残基取代、或前述取代的任意组合。
[0035] 除了上文中讨论的氨基酸取代以外，免疫球蛋白重链多肽任选地可以包含其他氨基酸取代。在一个实施方式中，免疫球蛋白重链多肽包括SEQ ID NO:1，但SEQ ID NO:1的残基30、31、35、40、50、52、53、59、62、66、69、75、79、88、和97中的一个或多个被不同残基取代。
在另一个实施方式中，免疫球蛋白的重链多肽包括SEQ ID NO:1，但SEQ ID NO:1的残基30
被N（天冬酰胺）残基取代、SEQ ID NO:1的残基31被N（天冬酰胺）或D（天冬氨酸）残基取代、SEQ ID NO:1的残基35被T（苏氨酸）、N（天冬酰胺）、或D（天冬氨酸）残基取代、SEQ ID NO:1的残基40被T（苏氨酸）残基取代、SEQ ID NO:1的残基50被A（丙氨酸）、S（丝氨酸）、I（异亮氨酸）、或G（甘氨酸）残基取代、SEQ ID NO:1的残基52被N（天冬酰胺）或R（精氨酸）残基取代、SEQ ID NO:1的残基53被E（谷氨酸）或H（组氨酸）残基取代、SEQ ID NO:1的残基59被H（组氨酸）残基取代、SEQ ID NO:1的残基62被G（甘氨酸）残基取代、SEQ ID NO:1的残基66被V（缬氨酸）残基取代、SEQ ID NO:1的残基69被I（异亮氨酸）残基取代、SEQ ID NO:1的残基75被D（天冬氨酸）残基取代、SEQ ID NO:1的残基79被V（缬氨酸）残基取代、SEQ ID NO:1的残基88被V（缬氨酸）残基取代、SEQ ID NO:1的残基97被V（缬氨酸）、T（苏氨酸）、L（亮氨酸）、或F（苯丙氨酸）、或前述取代的任意组合。
在另一个实施方式中，免疫球蛋白的重链多肽包括SEQ ID NO:1，但SEQ ID NO:1的残基30
被N（天冬酰胺）残基取代、SEQ ID NO:1的残基31被N（天冬酰胺）或D（天冬氨酸）残基取代、SEQ ID NO:1的残基35被T（苏氨酸）、N（天冬酰胺）、或D（天冬氨酸）残基取代、SEQ ID NO:1的残基40被T（苏氨酸）残基取代、SEQ ID NO:1的残基50被A（丙氨酸）、S（丝氨酸）、I（异亮氨酸）、或G（甘氨酸）残基取代、SEQ ID NO:1的残基52被N（天冬酰胺）或R（精氨酸）残基取代、SEQ ID NO:1的残基53被E（谷氨酸）或H（组氨酸）残基取代、SEQ ID NO:1的残基59被H（组氨酸）残基取代、SEQ ID NO:1的残基62被G（甘氨酸）残基取代、SEQ ID NO:1的残基66被V（缬氨酸）残基取代、SEQ ID NO:1的残基69被I（异亮氨酸）残基取代、SEQ ID NO:1的残基75被D（天冬氨酸）残基取代、SEQ ID NO:1的残基79被V（缬氨酸）残基取代、SEQ ID NO:1的残基88被V（缬氨酸）残基取代、SEQ ID NO:1的残基97被V（缬氨酸）、T（苏氨酸）、L（亮氨酸）、或F（苯丙氨酸）、或前述取代的任意组合。
[0036] 示例性的免疫球蛋白重链多肽可以包含下述氨基酸序列中的任意一个：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3-5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10-20、SEQ ID NO:35-72、SEQ ID NO:76和SEQ ID NO:77。
[0037] 本发明还提供了一种分离的IL-17结合剂，其包括免疫球蛋白重链多肽，所述免疫球蛋白重链多肽含有氨基酸序列SEQ ID NO:1，但SEQ ID NO:1的残基50被不同残基取代，
和任选地SEQ ID NO:1中的残基31、32、35、40、52、62、66、88、和97中的一个或多个被不同残基取代。就此而言，SEQ ID NO:1的50、31、32、35、40、52、62、66、88、和97位的氨基酸残基可以被本文所描述的任意适宜的氨基酸残基取代。在一个实施方式中，SEQ ID NO:1的残基50被S、A、或I残基取代。在其他实施方式中，SEQ ID NO:1的残基31被N或D残基取代，SEQ ID NO:1的残基35被N、T、或D残基取代，SEQ ID NO:1的残基40被T残基取代，SEQ ID NO:1的残基52被N或R残基取代，SEQ ID NO:1的残基62被G残基取代，SEQ ID NO:1的残基66被V残基
取代、SEQ ID NO:1的残基88被V残基取代，SEQ ID NO:1的残基97被V、T、L、或F残基取代，或前述取代的任意组合。例如，免疫球蛋白重链多肽可以包括SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:74、或SEQ ID NO:75中的任意一个。
和任选地SEQ ID NO:1中的残基31、32、35、40、52、62、66、88、和97中的一个或多个被不同残基取代。就此而言，SEQ ID NO:1的50、31、32、35、40、52、62、66、88、和97位的氨基酸残基可以被本文所描述的任意适宜的氨基酸残基取代。在一个实施方式中，SEQ ID NO:1的残基50被S、A、或I残基取代。在其他实施方式中，SEQ ID NO:1的残基31被N或D残基取代，SEQ ID NO:1的残基35被N、T、或D残基取代，SEQ ID NO:1的残基40被T残基取代，SEQ ID NO:1的残基52被N或R残基取代，SEQ ID NO:1的残基62被G残基取代，SEQ ID NO:1的残基66被V残基
取代、SEQ ID NO:1的残基88被V残基取代，SEQ ID NO:1的残基97被V、T、L、或F残基取代，或前述取代的任意组合。例如，免疫球蛋白重链多肽可以包括SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:74、或SEQ ID NO:75中的任意一个。
[0038] 本发明进一步提供了一种分离的IL-17结合剂，其包括免疫球蛋白重链多肽，所述免疫球蛋白重链多肽含有氨基酸序列SEQ ID NO:1，但SEQ ID NO:1的残基104、109、和115中的一个或多个被不同残基取代，和任选地SEQ ID NO:1中的残基100、101、102、106、107、
108、和111中的一个或多个被不同残基取代。就此而言，SEQ ID NO:1的100、101、102、104、
106、107、108、109、111、和115位的氨基酸残基可以被本文所描述的任意适宜氨基酸残基取代。在一个实施方式中，SEQ ID NO:1的残基104被V残基取代、SEQ ID NO:1的残基109被V残基取代、SEQ ID NO:1的残基115被N或E残基取代、或前述取代的任意组合。在其他实施方式中，SEQ ID NO:1的残基100被H残基取代、SEQ ID NO:1的残基101被H或F残基取代、SEQ ID NO:1的残基102被E残基取代、SEQ ID NO:1的残基106被N残基取代、SEQ ID NO:1的残基107被S残基取代、SEQ ID NO:1的残基108被H或F残基取代、SEQ ID NO:1的残基111被S残基取
代、或前述取代的任意组合。例如，免疫球蛋白重链多肽可以包括SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、或SEQ ID NO:73。
108、和111中的一个或多个被不同残基取代。就此而言，SEQ ID NO:1的100、101、102、104、
106、107、108、109、111、和115位的氨基酸残基可以被本文所描述的任意适宜氨基酸残基取代。在一个实施方式中，SEQ ID NO:1的残基104被V残基取代、SEQ ID NO:1的残基109被V残基取代、SEQ ID NO:1的残基115被N或E残基取代、或前述取代的任意组合。在其他实施方式中，SEQ ID NO:1的残基100被H残基取代、SEQ ID NO:1的残基101被H或F残基取代、SEQ ID NO:1的残基102被E残基取代、SEQ ID NO:1的残基106被N残基取代、SEQ ID NO:1的残基107被S残基取代、SEQ ID NO:1的残基108被H或F残基取代、SEQ ID NO:1的残基111被S残基取
代、或前述取代的任意组合。例如，免疫球蛋白重链多肽可以包括SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、或SEQ ID NO:73。
[0039] 在另一个实施方式中，IL-17结合剂可以包括免疫球蛋白重链多肽，所述免疫球蛋白重链多肽含有氨基酸序列SEQ ID NO:1，但SEQ ID NO:1中被插入一个或多个氨基酸残
基。可以将任意数量的氨基酸残基插入SEQ ID NO:1。优选地，将至少一个氨基酸残基（例如，2个或更多、3个或更多、5个或更多、或者8个或更多的氨基酸残基），但是少于20个氨基酸残基（例如，18个或更少、15个或更少、12个或更少、或者10个或更少的氨基酸残基）插入SEQ ID NO:1。优选地，将约3至约20个氨基酸残基（例如，约3-5个氨基酸残基、约5-10个氨基酸残基、约10-15个氨基酸残基、或约15-20个氨基酸残基、或者任意两个前述值定义的范围）插入SEQ ID NO:1。在一个优选实施方式中，将不超过8个氨基酸残基插入SEQ ID NO:1。
例如，免疫球蛋白重链多肽可以包括SEQ ID NO:78或SEQ ID NO:79。
基。可以将任意数量的氨基酸残基插入SEQ ID NO:1。优选地，将至少一个氨基酸残基（例如，2个或更多、3个或更多、5个或更多、或者8个或更多的氨基酸残基），但是少于20个氨基酸残基（例如，18个或更少、15个或更少、12个或更少、或者10个或更少的氨基酸残基）插入SEQ ID NO:1。优选地，将约3至约20个氨基酸残基（例如，约3-5个氨基酸残基、约5-10个氨基酸残基、约10-15个氨基酸残基、或约15-20个氨基酸残基、或者任意两个前述值定义的范围）插入SEQ ID NO:1。在一个优选实施方式中，将不超过8个氨基酸残基插入SEQ ID NO:1。
例如，免疫球蛋白重链多肽可以包括SEQ ID NO:78或SEQ ID NO:79。
[0040] 对IL-17具有特异性的免疫球蛋白轻链多肽的一个例子包括SEQ ID NO:23，或与其具有至少85%同一性的氨基酸序列（例如，与其具有至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少
99%、或100%的同一性）。在本发明中，分离的IL-17结合剂包括免疫球蛋白轻链多肽，所述免疫球蛋白轻链多肽含有SEQ ID NO:23，但SEQ ID NO:23残基中的一个或多个被不同的氨基
酸残基取代。在这一方面，SEQ ID NO:23的残基9、10、11、13、17、20、21、和22中的一个或多个被不同残基取代。SEQ ID NO:23的氨基酸残基9、10、11、13、17、20、21、和22可以被本文所描述的任意适宜氨基酸残基取代。
99%、或100%的同一性）。在本发明中，分离的IL-17结合剂包括免疫球蛋白轻链多肽，所述免疫球蛋白轻链多肽含有SEQ ID NO:23，但SEQ ID NO:23残基中的一个或多个被不同的氨基
酸残基取代。在这一方面，SEQ ID NO:23的残基9、10、11、13、17、20、21、和22中的一个或多个被不同残基取代。SEQ ID NO:23的氨基酸残基9、10、11、13、17、20、21、和22可以被本文所描述的任意适宜氨基酸残基取代。
[0041] 在一个实施方式中，免疫球蛋白轻链多肽包括SEQ ID NO:23，但SEQ ID NO:23的残基9被Y（酪氨酸）残基取代、SEQ ID NO:23的残基10被R（精氨酸）残基取代、SEQ ID NO:23的残基11被T（苏氨酸）残基取代、SEQ ID NO:23的残基13被L（亮氨酸）或I（异亮氨酸）残基取代、SEQ ID NO:23的残基17被G（甘氨酸）残基取代、SEQ ID NO:23的残基20被K（赖氨酸）残基取代、SEQ ID NO:23的残基21被V（缬氨酸）残基取代、SEQ ID NO:23的残基22被D（天冬氨酸）残基取代、或前述取代的任意组合。例如，免疫球蛋白轻链多肽可以包括氨基酸序列SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:
80、或SEQ ID NO:81。
80、或SEQ ID NO:81。
[0042] 本发明不限于分离的IL-17结合剂，其包含被本文所述的特定氨基酸残基取代的免疫球蛋白重链多肽或轻链多肽。事实上，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:23的任意氨基酸残基均可以被不同氨基酸残基，以任意组合取代，或可以将任意数量的氨基酸残基插入SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:23，只要氨基酸取代或插入的结果是使得IL-17结合剂的生物活性增强
或改善即可。IL-17结合剂的“生物活性”指，例如与特定IL-17表位的结合亲和性、在体内对IL-17活性的中和作用（例如，IC50）、在体内的稳定性（包括但不限于热稳定性和蛋白水解稳定性）、药代动力学性质、IL-17结合剂的免疫原性、和交叉反应性（例如，与非人同源或直系同源的IL-17之间，或与其他蛋白或组织之间）。本领域公知的抗原结合剂的其他生物学性质或特性包括，例如亲和力、选择性、溶解性、折叠、免疫毒性、表达、制剂、和催化活性。可以采用标准技术对上述性质或特性进行观察、测量、和/或评价，所述标准技术包括但不限于，ELISA、竞争性ELISA、BIACORE或KINEXA表面等离子共振分析、体外或体内中和试验、受体结合试验、细胞因子或生长因子产生和/或分泌检测、以及信号转导和免疫组化检测。
或改善即可。IL-17结合剂的“生物活性”指，例如与特定IL-17表位的结合亲和性、在体内对IL-17活性的中和作用（例如，IC50）、在体内的稳定性（包括但不限于热稳定性和蛋白水解稳定性）、药代动力学性质、IL-17结合剂的免疫原性、和交叉反应性（例如，与非人同源或直系同源的IL-17之间，或与其他蛋白或组织之间）。本领域公知的抗原结合剂的其他生物学性质或特性包括，例如亲和力、选择性、溶解性、折叠、免疫毒性、表达、制剂、和催化活性。可以采用标准技术对上述性质或特性进行观察、测量、和/或评价，所述标准技术包括但不限于，ELISA、竞争性ELISA、BIACORE或KINEXA表面等离子共振分析、体外或体内中和试验、受体结合试验、细胞因子或生长因子产生和/或分泌检测、以及信号转导和免疫组化检测。
[0043] 如本文所使用的，术语对IL-17结合剂活性的“抑制”或“中和”指基本上拮抗、抑制、阻止、限制、延缓、破坏、消除、终止、或逆转，例如IL-17生物活性，或与IL-17相关的疾病或病症的进程或严重程度的能力。本发明的分离的IL-17结合剂优选抑制或中和IL-17的活性达至少约20%、约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约80%、约90%、约95%、约100%，或上述值中任意两个所定义的范围。
[0044] 如本文所描述的，本发明的分离的IL-17结合剂可以是完整抗体，或抗体的片段。术语“抗体的片段”、“抗体片段”、或“抗体的功能性片段”在本文中可以互换使用，其是指抗体中保留与抗原特异性结合能力的一个或多个片段（参见，通常，Holliger等,
Nat.Biotech.,23(9):1126-1129(2005)）。分离的IL-17结合剂可以含有任意IL-17结合抗
体片段。抗体片段优选包含例如一个或多个CDR、可变区（或其部分片段）、恒定区（或其部分片段）、或其组合。抗体片段的例子包括，但不限于（，i）Fab片段，其是包含VL、VH、CL、和CH1结构域的单价片段；（ii）F(ab’)2片段，其是由两个Fab片段在铰链区通过二硫键连接组成的二价片段；以及（iii）Fv片段，其包含抗体单臂的VL和VH结构域。
Nat.Biotech.,23(9):1126-1129(2005)）。分离的IL-17结合剂可以含有任意IL-17结合抗
体片段。抗体片段优选包含例如一个或多个CDR、可变区（或其部分片段）、恒定区（或其部分片段）、或其组合。抗体片段的例子包括，但不限于（，i）Fab片段，其是包含VL、VH、CL、和CH1结构域的单价片段；（ii）F(ab’)2片段，其是由两个Fab片段在铰链区通过二硫键连接组成的二价片段；以及（iii）Fv片段，其包含抗体单臂的VL和VH结构域。
[0045] 在本发明的一个实施方式中，分离的IL-17结合剂是抗体或抗体片段，其包含（a）免疫球蛋白重链多肽，所述免疫球蛋白重链多肽含有SEQ ID NO:2-22，或SEQ ID NO:31-79中的任意一个氨基酸序列，或其片段，以及（b）免疫球蛋白轻链多肽，其含有SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:80、或SEQ ID NO:81的氨基酸序列，或其片段。在分离的IL-17结合剂包含免疫球蛋白重链或轻链多肽的实施方式中，所述片段可以是任意尺寸，只要片段能结合至IL-17，并能优选地抑制IL-17的活
性。在这一方面，免疫球蛋白重链多肽的片段优选包含约5至18个氨基酸（例如，约5、6、7、8、
9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、或前述值中任意两个所定义的范围）。类似地，免疫球蛋白轻链多肽的片段拟包含约5至18个氨基酸（例如，约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、
17、18、或前述值中任意两个所定义的范围）。当IL-17结合剂是抗体或抗体片段时，抗体或抗体片段包含任意合适类型的恒定区（Fc）。优选地，抗体或其片段包含基于野生型IgG1、IgG2、或IgG4抗体，或其变体的恒定区。
性。在这一方面，免疫球蛋白重链多肽的片段优选包含约5至18个氨基酸（例如，约5、6、7、8、
9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、或前述值中任意两个所定义的范围）。类似地，免疫球蛋白轻链多肽的片段拟包含约5至18个氨基酸（例如，约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、
17、18、或前述值中任意两个所定义的范围）。当IL-17结合剂是抗体或抗体片段时，抗体或抗体片段包含任意合适类型的恒定区（Fc）。优选地，抗体或其片段包含基于野生型IgG1、IgG2、或IgG4抗体，或其变体的恒定区。
[0046] IL-17结合剂还可以是单链抗体片段。单链抗体片段的例子包括，但不限于，（i）单链Fv（scFv），其是由Fv片段的两个结构域（即，VL和VH）组成的单价分子，由其由能够使两个结构域合成一条多肽链的合成连接子连接（参见，例如Bird等,Science,242:423-426(1988)；Huston等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:5879-5883(1988)；以及Osbourn等,
Nat.Biotechnol.,16:778(1998)）和（ii）双抗体，其为多肽链的二聚体，其中各多肽链均包含通过肽连接子连接至VL的VH，肽连接子非常短从而允许VH与VL之间能够在同一多肽链配
对，籍此使不同VH-VL多肽链的互补结构域之间配对，以产生具有两个功能性抗原结合位点的二聚体分子。抗体片段是本领域公知的，更加详细的描述参见例如美国专利申请公开号
2009/0093024A1。
Nat.Biotechnol.,16:778(1998)）和（ii）双抗体，其为多肽链的二聚体，其中各多肽链均包含通过肽连接子连接至VL的VH，肽连接子非常短从而允许VH与VL之间能够在同一多肽链配
对，籍此使不同VH-VL多肽链的互补结构域之间配对，以产生具有两个功能性抗原结合位点的二聚体分子。抗体片段是本领域公知的，更加详细的描述参见例如美国专利申请公开号
2009/0093024A1。
[0047] 分离的IL-17结合剂还可以是细胞内抗体或其片段。细胞内抗体是一种在细胞内表达和发挥功能的抗体。细胞内抗体一般缺少二硫键，其能够通过其特异性结合活性来调
节靶基因的表达或活性。细胞内抗体包括单结构域片段，例如分离的VH和VL结构域以及
scFvs。细胞内抗体可以包括连接至细胞内抗体N端或C端的亚细胞转运信号，以使其在存在靶蛋白的亚细胞组件中高浓度的表达。通过与靶基因的相互作用，细胞内抗体通过，例如加速靶蛋白降解和在非生理性亚细胞组件中隔离靶蛋白的机制，来调节靶蛋白的功能和/或
实现表型/功能敲除。细胞内抗体介导的基因失活的其他机制可以依赖于细胞内抗体导向
的表位，如结合至靶蛋白的催化位点，或导向至参与蛋白-蛋白、蛋白-DNA、或蛋白-RNA相互作用的表位。
节靶基因的表达或活性。细胞内抗体包括单结构域片段，例如分离的VH和VL结构域以及
scFvs。细胞内抗体可以包括连接至细胞内抗体N端或C端的亚细胞转运信号，以使其在存在靶蛋白的亚细胞组件中高浓度的表达。通过与靶基因的相互作用，细胞内抗体通过，例如加速靶蛋白降解和在非生理性亚细胞组件中隔离靶蛋白的机制，来调节靶蛋白的功能和/或
实现表型/功能敲除。细胞内抗体介导的基因失活的其他机制可以依赖于细胞内抗体导向
的表位，如结合至靶蛋白的催化位点，或导向至参与蛋白-蛋白、蛋白-DNA、或蛋白-RNA相互作用的表位。
[0048] 分离的IL-17结合剂可以是，或可以来自人抗体、非人抗体、或嵌合抗体。“嵌合”指包含人和非人区域的抗体或其片段。非人抗体包括分离自任意非人动物，例如啮齿类动物（如，小鼠或大鼠）的抗体。IL-17结合剂的免疫球蛋白重链多肽可以来自人抗体、非人抗体、或嵌合抗体，其不依赖于IL-17结合剂的免疫球蛋白轻链多肽是否来自人抗体、非人抗体、或嵌合抗体。换言之，例如，免疫球蛋白重链多肽可以来自人抗体，免疫球蛋白轻链多肽可以来自非人抗体。或反之，免疫球蛋白重链多肽可以来自非人抗体，免疫球蛋白轻链多肽可以来自人抗体。或者，免疫球蛋白重链多肽可以来自啮齿类动物抗体或其片段，免疫球蛋白轻链多肽可以来自人抗体或其片段。这一方案可能是有用的，例如用于将抗体人源化。在另一个实施方式中，免疫球蛋白重链多肽和免疫球蛋白轻链多肽均来自人抗体或非人抗体。
或者，免疫球蛋白重链多肽和免疫球蛋白轻链多肽均是嵌合抗体。
或者，免疫球蛋白重链多肽和免疫球蛋白轻链多肽均是嵌合抗体。
[0049] 可以通过任意方法获得人抗体、非人抗体、或嵌合抗体，包括通过体外来源（例如，产生重组抗体的杂交瘤或细胞系）和体内来源（例如，啮齿类动物）。产生抗体的方法是本领域所公知的，其描述参见例如 and Milstein,Eur.J.Immunol.,5:511-519(1976)；Harlow and Lane(eds.),Antibodies:A Laboratory Manual,CSH Press(1988)；和
C.A.Janeway等(eds.),Immunobiology,5th Ed.,Garland Publishing,New York,NY
(2001))。在某些实施方式中，可以使用转基因动物（例如，小鼠）生产人抗体或嵌合抗体，其一个或多个内源性的免疫球蛋白基因被一个或多个人免疫球蛋白基因所取代。内源性抗体
基因被人抗体基因有效取代的转基因小鼠的例子，包括但不限于，HUMAB-MOUSETM、Kirin TC MOUSETM、以及KM-MOUSET（M 参见，例如Lonberg,Nat.Biotechnol.,23(9):1117-25(2005)，和Lonberg,Handb.Exp.Pharmacol.,181:69-97(2008)）。
C.A.Janeway等(eds.),Immunobiology,5th Ed.,Garland Publishing,New York,NY
(2001))。在某些实施方式中，可以使用转基因动物（例如，小鼠）生产人抗体或嵌合抗体，其一个或多个内源性的免疫球蛋白基因被一个或多个人免疫球蛋白基因所取代。内源性抗体
基因被人抗体基因有效取代的转基因小鼠的例子，包括但不限于，HUMAB-MOUSETM、Kirin TC MOUSETM、以及KM-MOUSET（M 参见，例如Lonberg,Nat.Biotechnol.,23(9):1117-25(2005)，和Lonberg,Handb.Exp.Pharmacol.,181:69-97(2008)）。
[0050] 在本发明的另一个实施方式中，分离的IL-17结合剂可以部分是“替代支架(alternative scaffold)”或其片段。“替代支架”指非抗体多肽或多肽结构域，其对目标抗原表现出与抗体类似的亲和性和特异性。示例性的替代支架包括如来自纤连蛋白（例如，
Adnectins）、脂质运载蛋白（例如，Anticalin）、Kunitz结构域、硫氧还蛋白（例如，肽适体）、蛋白A（例如，AFFIBODYTM分子）、锚蛋白重复（例如，DARPins）、γ-β-晶状体蛋白或泛素（例如，AFFLINTM分子）、CTLD3（例如，四连接素）以及多价复合物（例如，ATRIMERTM分子或SIMPTM分子）的β-夹层结构域。替代支架的描述参见，例如Binz等,Nat.Biotechnol.,23:1257-
1268(2005);Skerra,Curr.Opin.Biotech.,18:295-304(2007)；和美国专利申请公开号
2009/0181855A1。
Adnectins）、脂质运载蛋白（例如，Anticalin）、Kunitz结构域、硫氧还蛋白（例如，肽适体）、蛋白A（例如，AFFIBODYTM分子）、锚蛋白重复（例如，DARPins）、γ-β-晶状体蛋白或泛素（例如，AFFLINTM分子）、CTLD3（例如，四连接素）以及多价复合物（例如，ATRIMERTM分子或SIMPTM分子）的β-夹层结构域。替代支架的描述参见，例如Binz等,Nat.Biotechnol.,23:1257-
1268(2005);Skerra,Curr.Opin.Biotech.,18:295-304(2007)；和美国专利申请公开号
2009/0181855A1。
[0051] 在一个实施方式中，替代支架可以是AVIMERTM分子。AVIMERTM分子是一类人类来源的与抗体和抗体片段无关的治疗蛋白，其由若干模块和可重复利用的结构域组成，所述结构域被称为A-结构域（也称为A类模块、互补类型重复、或LDL-受体A类结构域）。通过体外外TM
显子改组(exon shuffling)和噬菌体展示可从人细胞外受体结构域中开发得到AVIMER 分
子（Silverman等,Nat.Biotechnol.,23:1493-94(2005)，和Silverman等,
Nat.Biotechnol.,24:220(2006)）。AVIMERTM分子可以包含多个独立的结合结构域，其相对于单一表位的结合蛋白可以表现出改善的亲和性（低于纳摩的某些情况下）和特异性（参
见，例如美国专利申请公开号2005/0221384A1；2005/0164301A1；2005/0053973A1；2005/
0089932A1；2005/0048512A1；和2004/0175756A1）。已知的217个人A-结构域均包含约35个氨基酸（约4kDa）。主要在钙结合和二硫键形成的介导下，天然A-结构域迅速和有效地折叠形成均一、稳定的结构。仅有12个氨基酸的保守支架基序是该共有结构所必需的。AVIMERTM分子包含多个A-结构域，通过长度平均为五个氨基酸的连接子将其彼此间隔开。最终结果
是单蛋白链含有的多个结构域均分别具有独立的功能。AVIMERTM分子的各结构域分别独立
地与抗原结合，并且各结构域的作用是可累加的。
显子改组(exon shuffling)和噬菌体展示可从人细胞外受体结构域中开发得到AVIMER 分
子（Silverman等,Nat.Biotechnol.,23:1493-94(2005)，和Silverman等,
Nat.Biotechnol.,24:220(2006)）。AVIMERTM分子可以包含多个独立的结合结构域，其相对于单一表位的结合蛋白可以表现出改善的亲和性（低于纳摩的某些情况下）和特异性（参
见，例如美国专利申请公开号2005/0221384A1；2005/0164301A1；2005/0053973A1；2005/
0089932A1；2005/0048512A1；和2004/0175756A1）。已知的217个人A-结构域均包含约35个氨基酸（约4kDa）。主要在钙结合和二硫键形成的介导下，天然A-结构域迅速和有效地折叠形成均一、稳定的结构。仅有12个氨基酸的保守支架基序是该共有结构所必需的。AVIMERTM分子包含多个A-结构域，通过长度平均为五个氨基酸的连接子将其彼此间隔开。最终结果
是单蛋白链含有的多个结构域均分别具有独立的功能。AVIMERTM分子的各结构域分别独立
地与抗原结合，并且各结构域的作用是可累加的。
[0052] 本发明的分离的IL-17结合剂可以插入其他分子（例如，多肽），以产生与目标抗原结合的新分子。在这一点上，本发明包括一种生产与IL-17结合的多肽的方法，该方法包括将IL-17结合剂插入至不同多肽。可以采用本领域公知的常规分子生物学技术生产此类新抗原-结合分子。例如，将IL-17结合剂，或编码IL-17结合剂的核酸序列插入不同分子（例如，多肽或多核苷酸）以产生与IL-17结合的重组分子。在一个实施方式中，采用蛋白化学或重组DNA技术，可以将本文所描述的免疫球蛋白重链多肽和/或免疫球蛋白轻链多肽的CDR
（例如，CDR1、CDR2、或CDR3）或可变区移植入（即，嫁接到）另一个分子，如抗体或非抗体多肽。在这一点上，本发明提供了一种分离的IL-17结合剂，其包含本文所述的免疫球蛋白重链和/或轻链的至少一个CDR。分离的IL-17结合剂可以包括如本文所描述的免疫球蛋白重
链和/或轻链多肽可变区的一个、两个、或三个CDR。在这一点上，本文所述的免疫球蛋白重链多肽的CDR1位于SEQ ID NO:2-22和SEQ ID NO:31-79内的氨基酸残基25至35之间（包含
在内）。本文所述的免疫球蛋白重链多肽的CDR2位于SEQ ID NO:2-22和SEQ ID NO:31-79内的氨基酸残基50-67之间（包含在内）。本文所述的免疫球蛋白重链多肽的CDR3位于SEQ ID NO:2-22和SEQ ID NO:31-79内的氨基酸残基99至102之间（包含在内）。本文所述的各免疫球蛋白轻链多肽CDR的位置列于表1。
（例如，CDR1、CDR2、或CDR3）或可变区移植入（即，嫁接到）另一个分子，如抗体或非抗体多肽。在这一点上，本发明提供了一种分离的IL-17结合剂，其包含本文所述的免疫球蛋白重链和/或轻链的至少一个CDR。分离的IL-17结合剂可以包括如本文所描述的免疫球蛋白重
链和/或轻链多肽可变区的一个、两个、或三个CDR。在这一点上，本文所述的免疫球蛋白重链多肽的CDR1位于SEQ ID NO:2-22和SEQ ID NO:31-79内的氨基酸残基25至35之间（包含
在内）。本文所述的免疫球蛋白重链多肽的CDR2位于SEQ ID NO:2-22和SEQ ID NO:31-79内的氨基酸残基50-67之间（包含在内）。本文所述的免疫球蛋白重链多肽的CDR3位于SEQ ID NO:2-22和SEQ ID NO:31-79内的氨基酸残基99至102之间（包含在内）。本文所述的各免疫球蛋白轻链多肽CDR的位置列于表1。
[0053] 表1
[0054]
[0055] 在另一个实施方式中，可以将本文所述的免疫球蛋白重链多肽和/或免疫球蛋白轻链多肽的整个可变区移植至另一个抗体LC和/或HC可变区的位置。
[0056] 前述的方法和分子可能是有用的，例如用于产生抗体，该抗体包含不同同种型的Fc区域或与蛋白或非蛋白部分（例如，荧光标签或化疗剂）偶联的Fc区域。本发明还提供了一种（1）抗体、替代支架、或其片段，以及（2）包含IL-17结合剂的蛋白或非蛋白部分的偶联物。例如，IL-17结合剂可以作为抗体的一部分偶联至肽、荧光分子、或化疗剂。
[0057] 本发明进一步提供了一种载体，其包括编码分离的IL-17结合剂（例如，本文所述的免疫球蛋白重链多肽和/或免疫球蛋白轻链多肽）的核酸序列。“核酸”意指包括DNA或RNA的聚合物，即多核苷酸，其可以是单链的或双链的并且其可以含有非天然或改变的核苷酸。
核酸一般通过磷酸键连接以形成核酸或多核苷酸，虽然还有很多其他键连接是本领域所公
知的（例如，磷硫酰、硼磷酰等）。
核酸一般通过磷酸键连接以形成核酸或多核苷酸，虽然还有很多其他键连接是本领域所公
知的（例如，磷硫酰、硼磷酰等）。
[0058] 载体可以是例如质粒、游离基因、粘粒、病毒载体（例如，逆转录病毒或腺病毒的载体）、或噬菌体。适宜的载体和载体制备方法均是本领域所公知的（参见，例如Sambrook等,Molecular Cloning,a Laboratory Manual,3rd edition,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001)，和Ausubel等,Current Protocols in Molecular
Biology,Greene Publishing Associates and John Wiley&Sons,New York,N.Y.
(1994)）。
Biology,Greene Publishing Associates and John Wiley&Sons,New York,N.Y.
(1994)）。
[0059] 除编码IL-17结合剂的核酸以外，载体优选包括表达控制序列，如启动子、增强子、多腺苷酸化信号、转录终止子、内部核糖体进入位点（IRES）等等，其为编码序列在宿主细胞内的表达而提供。示例性的表达控制序列是本领域所公知的，其描述于例如Goeddel,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology,Vol.185,Academic Press,San Diego,Calif.(1990)。
[0060] 来自多种不同来源的大量启动子，包括组成型、诱导型、和可抑制启动子均是本领域所公知的。启动子的代表性来源包括，例如病毒、哺乳动物、昆虫、植物、酵母、和细菌，并且来自这些来源的适宜启动子易于获得，或者根据可以获得的公开序列通过合成制备，例如保存在如ATCC以及其他商业或个人来源。启动子可以是单向的（即，在一个方向起始转
录）或双向的（即，在3’或5’方向起始转录）。启动子的非限制性例子包括例如T7细菌表达系统、pBAD（araA）细菌表达系统、巨细胞病毒（CMV）启动子、SV40启动子、RSV启动子。诱导型启动子包括例如Tet系统（美国专利5,464,758和5,814,618）、蜕皮激素可诱导系统（No等,
Proc.Natl.Acad.Sci.,93:3346-3351(1996)）、T-REXTM系统（Invitrogen,Carlsbad,CA）、LACSWITCHTM系统（Stratagene,San Diego,CA）、和Cre-ERT他莫昔芬可诱导重组酶系统
（Indra等,Nuc.Acid.Res.,27:4324-4327(1999)；Nuc.Acid.Res.,28:e99(2000)；美国专利
7,112,715；和Kramer&Fussenegger,Methods Mol.Biol.,308:123-144(2005)）。
录）或双向的（即，在3’或5’方向起始转录）。启动子的非限制性例子包括例如T7细菌表达系统、pBAD（araA）细菌表达系统、巨细胞病毒（CMV）启动子、SV40启动子、RSV启动子。诱导型启动子包括例如Tet系统（美国专利5,464,758和5,814,618）、蜕皮激素可诱导系统（No等,
Proc.Natl.Acad.Sci.,93:3346-3351(1996)）、T-REXTM系统（Invitrogen,Carlsbad,CA）、LACSWITCHTM系统（Stratagene,San Diego,CA）、和Cre-ERT他莫昔芬可诱导重组酶系统
（Indra等,Nuc.Acid.Res.,27:4324-4327(1999)；Nuc.Acid.Res.,28:e99(2000)；美国专利
7,112,715；和Kramer&Fussenegger,Methods Mol.Biol.,308:123-144(2005)）。
[0061] 如本文所使用的，术语“增强子”指增强，例如与之可操作连接的核酸序列转录的DNA序列。增强子可以位于核酸序列编码区的数千碱基以外，并且可以调节调控因子的结合、DNA甲基化的类型、或DNA结构的改变。来自多种不同来源的大量增强子是本领域所公知的，其可以来自或在克隆的多核苷酸内（来自，例如保存在如ATCC以及其他商业或个人来
源）。很多包含启动子（如常用的CMV启动子）的多核苷酸也包含增强子序列。增强子可以位于编码序列的上游、内部、或下游。术语“Ig增强子”指来自经测定位于免疫球蛋白（Ig）基因座的增强子区域内的增强子元件（如增强子包括例如重链（mu）5’增强子、轻链（κ）5’增强子、κ和mu内增强子、和3’增强子）（参见通常Paul W.E.(ed),Fundamental Immunology,3rd Edition,Raven Press,New York(1993)，第353-363页；和美国专利5,885,827）。
源）。很多包含启动子（如常用的CMV启动子）的多核苷酸也包含增强子序列。增强子可以位于编码序列的上游、内部、或下游。术语“Ig增强子”指来自经测定位于免疫球蛋白（Ig）基因座的增强子区域内的增强子元件（如增强子包括例如重链（mu）5’增强子、轻链（κ）5’增强子、κ和mu内增强子、和3’增强子）（参见通常Paul W.E.(ed),Fundamental Immunology,3rd Edition,Raven Press,New York(1993)，第353-363页；和美国专利5,885,827）。
[0062] 载体还可以包含“选择性标记物基因”。如本文所使用的，术语“选择性标记物基因”指这样的核酸序列，即在存在相应选择剂时允许表达核酸序列的细胞被特异性选择或抑制。适宜的选择性标记物基因是本领域所公知的，其描述于例如国际专利申请公开号
WO92/08796和WO94/28143；Wigler等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:3567(1980)；O'Hare
等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78:1527(1981)；Mulligan&Berg,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,
78:2072(1981)；Colberre-Garapin等,J.Mol.Biol.,150:1(1981)；Santerre等,Gene,30:
147(1984)；Kent等,Science,237:901–903(1987)；Wigler等,Cell,11:223(1977)；
Szybalska&Szybalski,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,48:2026(1962)；Lowy等,Cell,22:817
(1980)；以及美国专利5,122,464和5,770,359。
WO92/08796和WO94/28143；Wigler等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:3567(1980)；O'Hare
等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78:1527(1981)；Mulligan&Berg,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,
78:2072(1981)；Colberre-Garapin等,J.Mol.Biol.,150:1(1981)；Santerre等,Gene,30:
147(1984)；Kent等,Science,237:901–903(1987)；Wigler等,Cell,11:223(1977)；
Szybalska&Szybalski,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,48:2026(1962)；Lowy等,Cell,22:817
(1980)；以及美国专利5,122,464和5,770,359。
[0063] 在某些实施方式中，载体是“游离基因表达载体”或“游离基因”，在存在适宜的选择性压力的条件下，其能够在宿主细胞中复制，以及作为DNA的染色体外片段存在于宿主细胞中（参见，例如Conese等,Gene Therapy11:1735-1742(2004)）。典型的商品化的游离基因表达载体包括但不限于使用爱泼斯坦巴尔核酸抗原1（EBNA1）和爱泼斯坦巴尔病毒（EBV）复制原点（oriP）的游离基因质粒。Invitrogen（卡尔斯巴德，加利福尼亚州）的载体pREP4、pCEP4、pREP7、和pcDNA3.1以及Stratagene（La Jolla,CA）的pBK-CMV是替代EBNA1和oriP使用(替代EBNA1和oriP)T抗原和SV40复制原点的游离基因载体的非限制性例子。
[0064] 其他适宜的载体包括整合表达载体，其可以随机整合至宿主细胞的DNA、或可能包括能够使表达载体与宿主细胞的染色体特异性重组的重组位点。此类整合表达载体可以利
用宿主细胞染色体的内源性表达控制序列实现所需蛋白的表达。以位点特异性方式整合的
载体的例子包括，例如Invitrogen（卡尔斯巴德，加利福尼亚州）（例如，pcDNATM5/FRT）的flp-in系统的组件或cre-lox系统，其可见于Stratagene（拉荷亚，加利福尼亚州）的
pExchange-6核心载体。可以随机整合至宿主细胞染色体的载体的例子包括，例如
Invitrogen（卡尔斯巴德，加利福尼亚州）的pcDNA3.1（当缺乏T-抗原时将其引入）和
Promega（麦迪逊，威斯康星州）的pCI或pFN10A（ACT）FLEXITM。
用宿主细胞染色体的内源性表达控制序列实现所需蛋白的表达。以位点特异性方式整合的
载体的例子包括，例如Invitrogen（卡尔斯巴德，加利福尼亚州）（例如，pcDNATM5/FRT）的flp-in系统的组件或cre-lox系统，其可见于Stratagene（拉荷亚，加利福尼亚州）的
pExchange-6核心载体。可以随机整合至宿主细胞染色体的载体的例子包括，例如
Invitrogen（卡尔斯巴德，加利福尼亚州）的pcDNA3.1（当缺乏T-抗原时将其引入）和
Promega（麦迪逊，威斯康星州）的pCI或pFN10A（ACT）FLEXITM。
[0065] 还可以使用病毒载体。代表性的商品化的病毒表达载体包括，但不限于，Crucell公司（莱顿，荷兰）的基于腺病毒的Per.C6系统、Invitrogen（卡尔斯巴德，加利福尼亚州）的基于慢病毒的pLP1、以及Stratagene（La Jolla,CA）的逆转录病毒载体pFB-ERV加pCFB-
EGSH。
EGSH。
[0066] 可以将IL-17结合剂的编码免疫球蛋白重链多肽的核酸序列和编码免疫球蛋白轻链多肽的核酸序列通过同一载体提供给细胞（即，顺式）。可以使用双向启动子控制两个核酸序列的表达。在另一个实施方式中，可以使用单向启动子控制两个核酸序列的表达。可以将编码免疫球蛋白重链多肽的核酸序列和编码免疫球蛋白轻链多肽的核酸序列分别通过
分离的载体提供给细胞群（即，反式）。包含编码免疫球蛋白重链多肽的核酸序列的载体，可以与包含编码免疫球蛋白轻链多肽的核酸序列的载体具有相同的或不同的表达控制序列。
可以同时或顺序地将分离的载体提供给细胞。
分离的载体提供给细胞群（即，反式）。包含编码免疫球蛋白重链多肽的核酸序列的载体，可以与包含编码免疫球蛋白轻链多肽的核酸序列的载体具有相同的或不同的表达控制序列。
可以同时或顺序地将分离的载体提供给细胞。
[0067] 可以将包含编码IL-17结合剂的核酸的载体引入能够表达所编码多肽的宿主细胞，包括任意适宜的原核或真核细胞。优选的宿主细胞能够容易、稳定地生长，其具有相当迅速地生长速率，具有特征已鉴定的表达系统，并且其能够被方便和有效的转化或转染。
[0068] 适宜的原核细胞的例子包括但不限于来自杆菌属（如枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌）、埃希氏杆菌属（如E.coli）、假单胞菌属、链霉菌属、沙门氏菌属、和欧文氏菌属的细胞。
特别有用的原核细胞包括不同种属的大肠杆菌（例如，K12、HB101（ATCC No.33694）、DH5α、DH10、MC1061（ATCC No.53338）、和CC102）。
特别有用的原核细胞包括不同种属的大肠杆菌（例如，K12、HB101（ATCC No.33694）、DH5α、DH10、MC1061（ATCC No.53338）、和CC102）。
[0069] 优选地，将载体引入真核细胞。适宜的真核细胞是本领域所公知的，其包括例如酵母细胞、昆虫细胞、和哺乳动物细胞。适宜酵母细胞的例子包括来自汉逊酵母属、克鲁维酵母菌属、毕赤酵母属、鼻孢子虫属、酵母菌属、和裂殖酵母属的那些。优选的酵母细胞包括例如酿酒酵母和毕赤酵母。
[0070] 适宜的昆虫细胞描述于例如Kitts等,Biotechniques,14:810-817(1993)；Lucklow,Curr.Opin.Biotechnol.,4:564-572(1993)；和Lucklow等,J.Virol.,67:4566-
4579(1993)。优选的昆虫细胞包括Sf-9和HI5（Invitrogen,卡尔斯巴德，加利福尼亚州）。
4579(1993)。优选的昆虫细胞包括Sf-9和HI5（Invitrogen,卡尔斯巴德，加利福尼亚州）。
[0071] 优选地，在本发明中利用哺乳动物细胞。多种适宜的哺乳动物宿主细胞是本领域所公知的，并且多种可以从美国模式培养物保藏中心（ATCC，马纳萨斯，弗吉尼亚州）获得。
适宜的哺乳动物细胞的例子包括，但不限于，中国仓鼠卵巢细胞（CHO）（ATCC No.CCL61）、CHO DHFR-细胞（Urlaub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97:4216-4220(1980)）、人胚胎肾
（HEK）293或293T细胞（ATCC No.CRL1573）、以及3T3细胞（ATCC No.CCL92）。其他适宜的哺乳动物细胞系为猴COS-1（ATCC No.CRL1650）和COS-7细胞系（ATCC No.CRL1651）、以及CV-1细胞系（ATCC No.CCL70）。进一步的示例性哺乳动物宿主细胞包括灵长类细胞系和啮齿类细胞系，包括转化细胞系。正常的二倍体细胞，来自原代组织体外培养的细胞系，以及原代外植体也是适宜的。其他适宜的哺乳动物细胞系包括但不限于小鼠神经母细胞瘤N2A细胞、
HeLa、小鼠L-929细胞、和BHK或HaK仓鼠细胞系，其全部可以从ATCC获得。选择适宜的哺乳动物宿主细胞以及转化、培养、扩增、筛选、和纯化细胞的方法均是本领域所公知的。
适宜的哺乳动物细胞的例子包括，但不限于，中国仓鼠卵巢细胞（CHO）（ATCC No.CCL61）、CHO DHFR-细胞（Urlaub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97:4216-4220(1980)）、人胚胎肾
（HEK）293或293T细胞（ATCC No.CRL1573）、以及3T3细胞（ATCC No.CCL92）。其他适宜的哺乳动物细胞系为猴COS-1（ATCC No.CRL1650）和COS-7细胞系（ATCC No.CRL1651）、以及CV-1细胞系（ATCC No.CCL70）。进一步的示例性哺乳动物宿主细胞包括灵长类细胞系和啮齿类细胞系，包括转化细胞系。正常的二倍体细胞，来自原代组织体外培养的细胞系，以及原代外植体也是适宜的。其他适宜的哺乳动物细胞系包括但不限于小鼠神经母细胞瘤N2A细胞、
HeLa、小鼠L-929细胞、和BHK或HaK仓鼠细胞系，其全部可以从ATCC获得。选择适宜的哺乳动物宿主细胞以及转化、培养、扩增、筛选、和纯化细胞的方法均是本领域所公知的。
[0072] 可以通过“转染”、“转化”、或“转导”将编码IL-17结合剂的核酸序列引入细胞。如本文所使用的，“转染”、“转化”、或“转导”指通过物理或化学方法将一个或多个外源性的多核苷酸引入宿主细胞。多种转染技术均是本领域所公知的，其包括例如磷酸钙DNA共沉淀（参见例如Murray E.J.(ed.),Methods in Molecular Biology,Vol.7,Gene Transfer
and Expression Protocols,Humana Press(1991)）；DEAE-葡聚糖；电穿孔；阳离子脂质体介导的转染；钨粒子微粒轰击（Johnston,Nature,346:776-777(1990)）；和磷酸锶DNA共沉淀（Brash等,Mol.Cell Biol.,7:2031-2034(1987)）。在传染性粒子在适宜的包装细胞中生长后，可以将噬菌体或病毒载体引入宿主细胞，很多包装细胞是可以购买获得的。
and Expression Protocols,Humana Press(1991)）；DEAE-葡聚糖；电穿孔；阳离子脂质体介导的转染；钨粒子微粒轰击（Johnston,Nature,346:776-777(1990)）；和磷酸锶DNA共沉淀（Brash等,Mol.Cell Biol.,7:2031-2034(1987)）。在传染性粒子在适宜的包装细胞中生长后，可以将噬菌体或病毒载体引入宿主细胞，很多包装细胞是可以购买获得的。
[0073] 本发明提供了一种包含分离的IL-17结合剂或编码本文所述的IL-17结合剂的载体的组合物。优选地，该组合物是药学上可接受的（例如，生理学上可接受的）组合物，其包含载体，优选药学（例如，生理学上可接受的）载体，和IL-17结合剂。在本发明中可以使用任意适宜的载体，并且此类载体是本领域所公知的。部分地，通过给予组合物的特定部位和给予组合物使用的特定方法选择载体。组合物任选地可以是无菌的。组合物可以冷冻或冻干
保持并在使用前使用适宜的无菌载体重组。可以使用常规技术生产组合物，其描述于例如
Remington:The Science and Practice of Pharmacy,21st Edition,Lippincott
Williams&Wilkins,Philadelphia,PA(2001)。
保持并在使用前使用适宜的无菌载体重组。可以使用常规技术生产组合物，其描述于例如
Remington:The Science and Practice of Pharmacy,21st Edition,Lippincott
Williams&Wilkins,Philadelphia,PA(2001)。
[0074] 本发明进一步提供了一种在哺乳动物中治疗IL-17介导的疾病的方法。该方法包括给予患有IL-17介导的疾病的哺乳动物前述组合物，藉此在哺乳动物中治疗IL-17介导的
疾病。如本文所使用的，术语“IL-17介导的疾病”指在哺乳动物（优选人）中存在IL-17导致或促进疾病的病理作用，降低IL-17的水平或活性具有治疗益处的任意疾病或病症。IL-17
介导疾病的例子包括，但不限于，气道炎症、哮喘、类风湿性关节炎（RA）、骨关节炎、骨质疏松、骨质侵蚀、腹膜内脓肿和粘连、炎性肠病（IBD）、慢性阻塞性肺病（COPD）、艾迪生氏病、丙种球蛋白缺乏症、过敏性哮喘、斑秃、乳糜泻、查加斯病、特发性肺纤维化、克隆氏病、溃疡性结肠炎、同种异体移植排斥（例如，肾）、牛皮癣关节炎、葡萄膜炎、白塞氏病、某些类型的癌症、血管生成、动脉粥样硬化、多发性硬化症（MS）、系统性红斑狼疮、败血症、脓毒性或内毒素性休克、对过敏原暴露的应答、幽门螺杆菌相关性胃炎、支气管哮喘、强直性脊柱炎、狼疮肾炎、牛皮癣、缺血、系统性硬化症、中风、及其他炎性疾病。
疾病。如本文所使用的，术语“IL-17介导的疾病”指在哺乳动物（优选人）中存在IL-17导致或促进疾病的病理作用，降低IL-17的水平或活性具有治疗益处的任意疾病或病症。IL-17
介导疾病的例子包括，但不限于，气道炎症、哮喘、类风湿性关节炎（RA）、骨关节炎、骨质疏松、骨质侵蚀、腹膜内脓肿和粘连、炎性肠病（IBD）、慢性阻塞性肺病（COPD）、艾迪生氏病、丙种球蛋白缺乏症、过敏性哮喘、斑秃、乳糜泻、查加斯病、特发性肺纤维化、克隆氏病、溃疡性结肠炎、同种异体移植排斥（例如，肾）、牛皮癣关节炎、葡萄膜炎、白塞氏病、某些类型的癌症、血管生成、动脉粥样硬化、多发性硬化症（MS）、系统性红斑狼疮、败血症、脓毒性或内毒素性休克、对过敏原暴露的应答、幽门螺杆菌相关性胃炎、支气管哮喘、强直性脊柱炎、狼疮肾炎、牛皮癣、缺血、系统性硬化症、中风、及其他炎性疾病。
[0075] 如本文所使用的，术语“疗法”、“治疗”等指获得所需的药理学和/或生理性效应。优选地，效应是治疗性的，即部分影响或完全治愈疾病和/或因疾病导致的不良症状。为了这个目的，本发明的方法包括给予“治疗有效量”的IL-17结合剂。“治疗有效量”指在必要的剂量和时间段内达到所需治疗结果所需的有效量。治疗有效量可以根据下述因素而改变如
个体的疾病状态、年龄、性别、和体重，以及IL-17结合剂在个体中激发所需应答的能力。例如，本发明IL-17结合剂的治疗有效量是在人体内降低IL-17生物活性的量（例如，通过阻断与IL17R的结合）。
个体的疾病状态、年龄、性别、和体重，以及IL-17结合剂在个体中激发所需应答的能力。例如，本发明IL-17结合剂的治疗有效量是在人体内降低IL-17生物活性的量（例如，通过阻断与IL17R的结合）。
[0076] 或者，药理学和/或生理学效应可能是预防性的，即该效应完全或部分阻止疾病或其症状。在这一方面，本发明的方法包括对易患IL-17介导的疾病的哺乳动物给予“预防有效量”的IL-17结合剂。“预防有效量”指在必要的剂量和时间段内达到所需预防结果（例如，阻止疾病发病）所需的有效量。
[0077] 典型的剂量可以是，例如，在0.001至1000μg范围内；但是，低于或高于该示例性范围的剂量仍在本发明的范围内。每日胃肠外给药的剂量可以是总体重的约0.1μg/kg至约100mg/kg（例如，约5μg/kg、约10μg/kg、约100μg/kg、约500μg/kg、约1mg/kg、约50mg/kg，或前述值中任意两个所定义的范围），优选总体重的约0.3μg/kg至约10mg/kg（例如，约5μg/kg、约1μg/kg、约50μg/kg、约150μg/kg、约300μg/kg、约750μg/kg、约1.5mg/kg、约5mg/kg，或前述值中任意两个所定义的范围），更优选总体重的约1μg/kg至1mg/kg（例如，约3μg/kg、约
15μg/kg、约75μg/kg、约300μg/kg、约900μg/kg，或前述值中任意两个所定义的范围），以及甚至更优选体重的约0.5至10mg/kg每日（例如，约2mg/kg、约4mg/kg、约7mg/kg、约9mg/kg，或前述值中任意两个所定义的范围）。可以通过定期对接受治疗的患者进行评价以监测治
疗或预防的效力。对于持续若干天或更长时间的重复给药而言，依据不同条件，重复治疗直至疾病症状得到所需的抑制。但是，其他剂量方案可能是有用的，其在本发明的范围内。可以通过将组合物单次推注给药、将组合物多次推注给药、或通过将组合物连续输注给药递
送所需的剂量。
15μg/kg、约75μg/kg、约300μg/kg、约900μg/kg，或前述值中任意两个所定义的范围），以及甚至更优选体重的约0.5至10mg/kg每日（例如，约2mg/kg、约4mg/kg、约7mg/kg、约9mg/kg，或前述值中任意两个所定义的范围）。可以通过定期对接受治疗的患者进行评价以监测治
疗或预防的效力。对于持续若干天或更长时间的重复给药而言，依据不同条件，重复治疗直至疾病症状得到所需的抑制。但是，其他剂量方案可能是有用的，其在本发明的范围内。可以通过将组合物单次推注给药、将组合物多次推注给药、或通过将组合物连续输注给药递
送所需的剂量。
[0078] 可以采用标准给药技术给予哺乳动物本发明的包含IL-17结合剂的组合物，包括口服、静脉、腹腔、皮下、肺部、透皮、肌内、鼻内、口腔、舌下、或通过栓剂给药。该组合物优选适于胃肠外给药。如本文所使用的，术语“胃肠外”包括静脉、肌内、皮下、直肠、阴道、和腹腔给药。更优选地，通过静脉、腹腔、或皮下注射利用外周系统将组合物递送至哺乳动物。
[0079] 一旦给予哺乳动物（例如，人），可以采用本领域公知的任意适宜方法测定本发明IL-17结合剂的生物活性。例如，可以通过测定特定IL-17结合剂的稳定性评估生物活性。在本发明的一个实施方式中，IL-17结合剂（例如，抗体）的体内半衰期在约5至28天之间（例如，约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28，或前述值中任意两个所定义的范围）。优选地，IL-17结合剂的体内半衰期在约21天至28天之间（例如，21、22、23、24、25、26、27、或28天）。还可以通过测定特定IL-17结合剂与IL-17或IL-17表位的结合亲和力，来评价特定IL-17结合剂的生物活性。术语“亲和力”指两个试剂可逆结合的平衡常数，其以解离常数（KD）表示。结合剂与配体的亲和力，如抗体与表位的亲和力，可以是，例如约100纳摩（nM）至约0.1nM、约100nM至约1皮摩（pM）、约1nM至约1pM、或约
1nM至约1飞摩（fM）。在本发明的方法中，IL-17结合剂与IL-17结合的KD小于或等于1纳摩（例如，0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM、0.1nM、0.05nM、0.025nM、
0.01nM、0.001nM，或前述值中任意两个所定义的范围），以及优选地小于或等于200皮摩（例如，190pmol、175pmol、150pmol、125pmol、110pmol、100pmol、90pmol、80pmol、75pmol、
60pmol、50pmol、40pmol、30pmol、25pmol、20pmol、15pmol、10pmol、5pmol、1pmol，或前述值中任意两个所定义的范围）。可以采用本领域公知的任意检测方法测定针对目标抗原或表
位的免疫球蛋白亲和力。此类方法包括例如荧光活化细胞分选（FACS）、可分离小珠（例如，磁珠）、抗原筛选、和/或ELISA（参见，例如Janeway等(eds.),Immunobiology,5th ed.,
Garland Publishing,New York,NY,2001）。
1nM至约1飞摩（fM）。在本发明的方法中，IL-17结合剂与IL-17结合的KD小于或等于1纳摩（例如，0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM、0.1nM、0.05nM、0.025nM、
0.01nM、0.001nM，或前述值中任意两个所定义的范围），以及优选地小于或等于200皮摩（例如，190pmol、175pmol、150pmol、125pmol、110pmol、100pmol、90pmol、80pmol、75pmol、
60pmol、50pmol、40pmol、30pmol、25pmol、20pmol、15pmol、10pmol、5pmol、1pmol，或前述值中任意两个所定义的范围）。可以采用本领域公知的任意检测方法测定针对目标抗原或表
位的免疫球蛋白亲和力。此类方法包括例如荧光活化细胞分选（FACS）、可分离小珠（例如，磁珠）、抗原筛选、和/或ELISA（参见，例如Janeway等(eds.),Immunobiology,5th ed.,
Garland Publishing,New York,NY,2001）。
[0080] 本发明的IL-17结合剂可以单独或与其他药物（例如，作为佐剂）联合给予。例如，IL-17结合剂可以与免疫抑制剂或免疫调节剂或其他抗炎剂联合给予,以治疗或预防本文所公开的IL-17介导的疾病。在这一方面，IL-17结合剂可以与缓解疾病的抗风湿药（DMARD）（例如，金盐、柳氮磺胺吡啶、抗疟药、甲氨蝶呤、D-青霉胺、咪唑硫嘌呤、霉芬酸、环孢素A、他克莫司、西罗莫司、米诺环素、来氟米特、和糖皮质激素）、钙调神经磷酸酶抑制剂（例如，环孢素A或FK506）、淋巴细胞再循环调节剂（例如，FTY720和FTY720类似物）、mTOR抑制剂（例如，雷帕霉素、40-O-（2-羟基乙基）-雷帕霉素、CCI779、ABT578、AP23573、或TAFA-93）、具有免疫抑制性质的子囊霉素（例如，ABT-281，ASM981等）、皮质激素、环磷酰胺、咪唑硫嘌呤、甲氨蝶呤、来氟米特、咪唑立宾、霉酚酸、霉酚酸酯、15-脱氧精胍菌素、或其免疫抑制同源物、类似物或衍生物、免疫抑制单克隆抗体（例如针对白细胞受体的单克隆抗体如MHC、CD2、
CD3、CD4,、CD7、CD8、CD25、CD28、CD40、CD45、CD58、CD80、CD86、或其配体）、其他免疫调节化合物、粘附分子抑制剂（例如，LFA-1拮抗剂、ICAM-1或-3拮抗剂、VCAM-4拮抗剂、或VLA-4拮抗剂）、化疗剂（例如，紫杉醇、吉西他滨、顺铂、阿霉素、或5-氟尿嘧啶）、抗-TNF剂（例如，针对TNF的单克隆抗体如英夫利西单抗、阿达木单抗、CDP870、或针对TNF-RI或TNF-RII的受体构建体如ENBRELT（M 依那西普）或PEG-TNF-RI）、促炎性细胞因子阻断剂、IL-1阻断剂（例如，KINERETT（M 阿那白滞素）或IL-1捕获剂、AAL160、ACZ885、和IL-6阻断剂）、趋化因子阻断剂（例如，蛋白酶活化剂抑制剂）、抗-IL-15抗体、抗-IL-6抗体、抗-CD20抗体、NSAID、和/或抗感染剂联用。
CD3、CD4,、CD7、CD8、CD25、CD28、CD40、CD45、CD58、CD80、CD86、或其配体）、其他免疫调节化合物、粘附分子抑制剂（例如，LFA-1拮抗剂、ICAM-1或-3拮抗剂、VCAM-4拮抗剂、或VLA-4拮抗剂）、化疗剂（例如，紫杉醇、吉西他滨、顺铂、阿霉素、或5-氟尿嘧啶）、抗-TNF剂（例如，针对TNF的单克隆抗体如英夫利西单抗、阿达木单抗、CDP870、或针对TNF-RI或TNF-RII的受体构建体如ENBRELT（M 依那西普）或PEG-TNF-RI）、促炎性细胞因子阻断剂、IL-1阻断剂（例如，KINERETT（M 阿那白滞素）或IL-1捕获剂、AAL160、ACZ885、和IL-6阻断剂）、趋化因子阻断剂（例如，蛋白酶活化剂抑制剂）、抗-IL-15抗体、抗-IL-6抗体、抗-CD20抗体、NSAID、和/或抗感染剂联用。
[0081] 除治疗用途以外，本文描述的IL-17结合剂可以用于诊断或研究应用。在这一方面，可以将IL-17结合剂用于诊断IL-17介导的疾病或病症的方法中。例如，本发明提供了一种在哺乳动物中诊断IL-17介导的疾病的方法，包括给予疑似患有IL-17介导的疾病的哺乳
动物IL-17结合剂，以此检测IL-17结合剂与IL-17的结合情况，以指示患有IL-17介导疾病
的哺乳动物。在一个类似的方法中，可以在检测中使用IL-17结合剂，以监测待检测IL-17相关疾病或病症的对象中IL-17的水平。研究应用包括，例如利用IL-17结合剂和标记来检测
样品中IL-17的方法，例如在人体液或在细胞或组织提取物中。IL-17结合剂可以经过修饰
或未经修饰使用，如使用可检测部分进行共价或非共价标记。例如，可检测部分可以是放射
3 14 32 35 125
性同位素（例如，H、C、P、S、或 I）、荧光或化学发光化合物（例如，异硫氰酸荧光素、罗丹明、或荧光素）、或酶（例如，碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、或辣根过氧化物酶）。将抗原结合剂（例如，抗体）与可检测部分分别偶联的任意方法是本领域公知的，可以将其引入本发明（参见，例如Hunter等,Nature,144:945(1962)；David等,Biochemistry,13:1014(1974)；
Pain等,J.Immunol.Meth.,40:219(1981)；和Nygren,J.Histochem.and Cytochem.,30:407
(1982)）。
动物IL-17结合剂，以此检测IL-17结合剂与IL-17的结合情况，以指示患有IL-17介导疾病
的哺乳动物。在一个类似的方法中，可以在检测中使用IL-17结合剂，以监测待检测IL-17相关疾病或病症的对象中IL-17的水平。研究应用包括，例如利用IL-17结合剂和标记来检测
样品中IL-17的方法，例如在人体液或在细胞或组织提取物中。IL-17结合剂可以经过修饰
或未经修饰使用，如使用可检测部分进行共价或非共价标记。例如，可检测部分可以是放射
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性同位素（例如，H、C、P、S、或 I）、荧光或化学发光化合物（例如，异硫氰酸荧光素、罗丹明、或荧光素）、或酶（例如，碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、或辣根过氧化物酶）。将抗原结合剂（例如，抗体）与可检测部分分别偶联的任意方法是本领域公知的，可以将其引入本发明（参见，例如Hunter等,Nature,144:945(1962)；David等,Biochemistry,13:1014(1974)；
Pain等,J.Immunol.Meth.,40:219(1981)；和Nygren,J.Histochem.and Cytochem.,30:407
(1982)）。
[0082] 可以使用本发明的IL-17结合剂通过本领域任意适宜的方法测定IL-17的水平。此类方法包括例如ELISA、放射免疫测定法（RIA）、和FACS。可以采用任意适宜的技术建立IL-
17的正常或标准表达值，例如通过在适合形成抗原-抗体复合物的条件下将包含或可能包
含IL-17多肽的样品与IL-17特异性抗体结合。用可检测物质对抗体进行直接或间接标记以
检测结合或非结合的抗体。适宜的可检测物质包括多种酶、辅基、荧光材料、发光材料、和放射性材料（参见，例如Zola,Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques,CRC
Press,Inc.(1987)）。然后将样品中IL-17多肽的表达量与标准值进行比较。
17的正常或标准表达值，例如通过在适合形成抗原-抗体复合物的条件下将包含或可能包
含IL-17多肽的样品与IL-17特异性抗体结合。用可检测物质对抗体进行直接或间接标记以
检测结合或非结合的抗体。适宜的可检测物质包括多种酶、辅基、荧光材料、发光材料、和放射性材料（参见，例如Zola,Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques,CRC
Press,Inc.(1987)）。然后将样品中IL-17多肽的表达量与标准值进行比较。
[0083] IL-17结合剂可以在试剂盒中提供，即，将用于诊断检测的已知量的试剂与说明书打包组合。如果使用酶标记IL-17结合剂，则试剂盒优选包括酶所需的底物和辅因子（例如，提供可检测发光团或荧光团的底物前体）。此外，在试剂盒中还可以包括其他附加剂，如稳定剂、缓冲剂（例如，封闭缓冲液或裂解缓冲液）等。可以改变多种试剂的相对量以使得试剂在溶液中的浓度基本上达到检测的最佳灵敏度。试剂可以以干粉形式（典型的为冻干的）提供，包括赋形剂，将其溶解后将提供具有适宜浓度的试剂溶液。
[0084] 下述实施例对本发明进行了进一步说明，但是不应将其解释为以任意方式对发明保护范围的限制。
[0085] 实施例1
[0086] 本实施例证明了本发明的IL-17结合剂能够在体内阻断人IL-17的活性。
[0087] 人IL17（hIL-17）能够结合并刺激小鼠IL-17受体，导致随后释放KC（CXCL1）趋化因子。进行时间和剂量范围实验以确定在体内最大限度诱导小鼠KC的hIL-17的最佳剂量。将人IL-17皮下注射给予小鼠，剂量为1、3、和10μg/小鼠。在给予hIL-17后的不同时间点（图
1），处死小鼠并使用商品化的试剂盒依据生产厂商的说明书（KC Quantikine,R&DSystems,明尼阿波利斯，明尼苏达州）通过ELISA测定KC的水平。这些实验结果表明，在给予人细胞因子两小时后，皮下给予10μg/小鼠剂量的人IL-17在小鼠血清中产生的KC水平最高（图1）。
1），处死小鼠并使用商品化的试剂盒依据生产厂商的说明书（KC Quantikine,R&DSystems,明尼阿波利斯，明尼苏达州）通过ELISA测定KC的水平。这些实验结果表明，在给予人细胞因子两小时后，皮下给予10μg/小鼠剂量的人IL-17在小鼠血清中产生的KC水平最高（图1）。
[0088] 在皮下注射hIL-17两小时前，静脉给予小鼠全长IgG1抗体，其包括含有SEQ ID NO:4的重链多肽和含有SEQ ID NO:24的轻链多肽，剂量为1、10、和100μg/小鼠。在人IL-17给予两小时后，处死小鼠并使用商品化的试剂盒通过ELISA测定KC的水平。将同种型匹配的（IgG1）抗体作为阴性对照（NC）。如图2所示，包含SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:24的抗体剂量依赖性地阻断hIL-17刺激小鼠IL-17受体的能力。在100μg/小鼠剂量时，与无效的媒介物对照和NC抗体相比，该抗体使平均KC水平降低约75至80%。
[0089] 本实施例的结果证明了包括SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:24的IL-17特异性抗体能够在体内抑制IL-17的活性。
[0090] 实施例2
[0091] 本实施例证明了本文所述的免疫球蛋白重链（HC）和轻链（LC）多肽能够形成在体外与IL-17结合的抗体。
[0092] 通过下述组合制备编码本文所述的不同免疫球蛋白重链（HC）和轻链（LC）多肽的DNA样品：20μl maxi-prepped DNA（包括0.2μg HC和0.2μg LC质粒）、9.8μl OPTIMEMTM（Invitrogen,卡尔斯马德，加利福尼亚州）、1.2μl GENEJUICETM转染试剂（Novagen,吉布斯敦，新泽西州）、和13.8μl OPTIMEMT（M 预热）。将DNA制备物彻底混匀和孵育（室温）后，将35μl试剂/DNA混合物加入5x104个HEK293-c18细胞中。在转染前18小时，将细胞接种至每孔含150μl Freestyle培养基的96孔板中，在37°C、8%CO2的湿润环境下孵育。转染后，将细胞送回至37°C、8%CO2条件下。已检测的重链和轻链序列的组合见表2。
[0093] 表2
[0094]
[0095]
[0096] 转染后5-7天收集96-孔板的上清液。在置于BIACORETMA100和/或BIACORETM4000（GE Healthcare,白金汉郡，英国）上以前，在1500rpm条件下将板离心5分钟以除去气泡。将阳性、阴性、和培养基对照加入空孔中。在两个给定的流动池的两点上，将抗-人Fc特异性IgG以两种不同的密度，通过胺偶联至传感器芯片CM5的表面，以进行2次分析。目标IgG在这两个密度下被捕获。两个浓度的抗原（人IL-17）流过不同密度的不同抗体(each antibody at each density)（包括“零浓度”样品）并且监测结合相互作用。在pH1.7条件下使用10mM甘氨酸使表面再生以除去与捕获抗体结合的材料。使用带质量运输的1:1相互作用
Langelier模式对数据集进行分析。已检测的重链和轻链多肽形成与人IL-17结合的抗体
（见图3）。
Langelier模式对数据集进行分析。已检测的重链和轻链多肽形成与人IL-17结合的抗体
（见图3）。
[0097] 本实施例的结果证明了包含本文所述的免疫球蛋白重链和轻链多肽的IL-17结合剂能够在体外与人IL-17结合。
[0098] 实施例3
[0099] 本实施例证明了本文所述的免疫球蛋白重链（HC）和轻链（LC）多肽能够形成在体外与人IL-17结合的抗体。
[0100] 通过均相时间分辨荧光（HTRF）检测确定了抗-IL17a抗体的结合亲和性的排序如下（：a）包括重链多肽和轻链多肽的抗体，所述重链多肽含有SEQ ID NO:55，所述轻链多肽含有SEQ ID NO:24（“APE508”），（b）包括重链多肽和轻链多肽的抗体，所述重链多肽含有SEQ ID NO:78，所述轻链多肽含有SEQ ID NO:24（“APE755”），（c）第一对照抗-IL17a抗体（参见国际专利申请公开号WO2006/013107），和（d）第二对照抗-IL17a抗体（参见美国专利号7,838,738）。在检测中，使用 穴状化合物标记试剂盒依据生产厂商提供的方法
（Cisbio US,贝德福德，马萨诸塞州）使用N-羟基琥珀酰亚胺活化的穴状化合物（Eu3+-TBP-NHS穴状化合物）对连接至wasabi荧光蛋白（WFP）（参见，例如Ai等,BMC Biol.,6:13(2008)）的IL-17抗原（APE349–SEQ ID NO:82）进行标记。将生物素化的第二对照抗体连接至链霉亲和素-XL665（Cisbio US,贝德福德，马萨诸塞州），随后将其以不同浓度与前述的各抗-
IL17a抗体混合。然后在室温条件下将抗体与标记抗原孵育过夜。在检测结束时，使用
EnVision Multilabel酶标仪（PerkinElmer,沃尔瑟姆，马萨诸塞州）在ProxiPlate-
384Plus（Perkin Elmer,沃尔瑟姆，马萨诸塞州）中读取结果。根据665nm与620nm处之比确定标记抗原与对照抗体的结合情况。将比率对已检测抗体的浓度作图，通过使用GraphPad Prism软件（GraphPad软件公司，拉荷亚，加利福尼亚州）对抑制曲线进行拟合确定各检测抗体的IC50。该检测的结果证明了APE755和APE508抗体与对照抗-IL17a抗体结合至相同的IL-
17表位。
（Cisbio US,贝德福德，马萨诸塞州）使用N-羟基琥珀酰亚胺活化的穴状化合物（Eu3+-TBP-NHS穴状化合物）对连接至wasabi荧光蛋白（WFP）（参见，例如Ai等,BMC Biol.,6:13(2008)）的IL-17抗原（APE349–SEQ ID NO:82）进行标记。将生物素化的第二对照抗体连接至链霉亲和素-XL665（Cisbio US,贝德福德，马萨诸塞州），随后将其以不同浓度与前述的各抗-
IL17a抗体混合。然后在室温条件下将抗体与标记抗原孵育过夜。在检测结束时，使用
EnVision Multilabel酶标仪（PerkinElmer,沃尔瑟姆，马萨诸塞州）在ProxiPlate-
384Plus（Perkin Elmer,沃尔瑟姆，马萨诸塞州）中读取结果。根据665nm与620nm处之比确定标记抗原与对照抗体的结合情况。将比率对已检测抗体的浓度作图，通过使用GraphPad Prism软件（GraphPad软件公司，拉荷亚，加利福尼亚州）对抑制曲线进行拟合确定各检测抗体的IC50。该检测的结果证明了APE755和APE508抗体与对照抗-IL17a抗体结合至相同的IL-
17表位。
[0101] 使用HT1080细胞、NIH3T3细胞、或来自类风湿性关节炎患者的原代滑膜成纤维细胞（RA SFB）进行的细胞因子释放检测，也用于证明本文所述的免疫球蛋白重链（HC）和轻链（LC）多肽可以形成与人IL-17结合的抗体。通过ELISA对NIH3T3和HT-1080细胞释放的IL-6进行定量。以1x104个细胞/孔的密度将细胞接种至96-孔检测板，然后使用（i）纯化的人
Myc-IL-17a（APE280，NIH3T3细胞：52pM，或HT1080细胞：200pM）、（ii）人重组TNFα（R&D Systems公司,明尼阿波利斯，明尼苏达州，0.5ng/mL；仅NIH3T3细胞）、和（iii）上文所述的不同浓度的抗-IL17a抗体处理细胞24小时（均在100μl DMEM/10%FCS中）。处理后，各孔均取
10μl上清液利用ELISA依据生产厂商提供的方法（eBioscience公司，圣地亚哥，加利福尼亚州）对小鼠IL-6进行定量分析。利用阴性对照对IL-6的水平进行归一化处理，在处理过程中不存在抗-IL-17a抗体。将经归一化的IL-6水平对抗体浓度作图，通过使用GraphPad Prism软件对抑制曲线进行拟合确定各抗体的IC50。除使用800pM Myc-IL-17a和0.05ng/mL人重组TNFα以外，依据上文所述，检测经IL-17a刺激从HT-1080细胞中释放的IL-8。使用BioLegend ELISA试剂盒（圣地亚哥，加利福尼亚州）依据生产厂商提供的方法对IL-8进行定量。
Myc-IL-17a（APE280，NIH3T3细胞：52pM，或HT1080细胞：200pM）、（ii）人重组TNFα（R&D Systems公司,明尼阿波利斯，明尼苏达州，0.5ng/mL；仅NIH3T3细胞）、和（iii）上文所述的不同浓度的抗-IL17a抗体处理细胞24小时（均在100μl DMEM/10%FCS中）。处理后，各孔均取
10μl上清液利用ELISA依据生产厂商提供的方法（eBioscience公司，圣地亚哥，加利福尼亚州）对小鼠IL-6进行定量分析。利用阴性对照对IL-6的水平进行归一化处理，在处理过程中不存在抗-IL-17a抗体。将经归一化的IL-6水平对抗体浓度作图，通过使用GraphPad Prism软件对抑制曲线进行拟合确定各抗体的IC50。除使用800pM Myc-IL-17a和0.05ng/mL人重组TNFα以外，依据上文所述，检测经IL-17a刺激从HT-1080细胞中释放的IL-8。使用BioLegend ELISA试剂盒（圣地亚哥，加利福尼亚州）依据生产厂商提供的方法对IL-8进行定量。
[0102] APE755抗体抑制IL-6从人IL-17刺激的细胞系中释放的作用比第一对照抗-IL17a抗体高5-10倍。APE755抗体抑制IL-8从IL-17刺激的细胞系中释放的作用比第一对照抗-
IL17a抗体强2倍。
IL17a抗体强2倍。
[0103] 通过ELISA对RA SFB细胞释放的IL-6和IL-8进行定量。将2-4代的RA SFB细胞（Asterand,MI，分离自一名63岁高加索人种女性类风湿性关节炎患者膝盖的患病区域）以
5x103个细胞/孔的密度接种至96-孔检测板。培养过夜后，使用人IL-17a（Humanzyme,伊利诺伊州,200pM）和不同浓度的下述抗-IL17a抗体之一处理细胞24小时：（a）APE508、（b）APE755、（d）第一对照抗-IL17a抗体（参见国际专利申请公开号WO2006/013107）、（d）第二对照抗-IL17a抗体（参见美国专利号7,838,738）、和（e）神经生长因子（NGF）特异性抗体（“APE409”），将其作为阴性对照（均在100μlDMEM/F-12/10%FCS中）。经处理后，各孔取10μl或20μl上清液依据生产厂商提供的方法分别进行人IL-6（eBioscience,Inc.,圣地亚哥，加利福尼亚州）或人IL-8（BioLegend,圣地亚哥，加利福尼亚州）ELISA。利用阴性对照（即，在处理过程中不存在抗-IL-17a抗体）对IL-6和IL-8的水平进行归一化处理。根据上文所述对经归一化的水平作图。
5x103个细胞/孔的密度接种至96-孔检测板。培养过夜后，使用人IL-17a（Humanzyme,伊利诺伊州,200pM）和不同浓度的下述抗-IL17a抗体之一处理细胞24小时：（a）APE508、（b）APE755、（d）第一对照抗-IL17a抗体（参见国际专利申请公开号WO2006/013107）、（d）第二对照抗-IL17a抗体（参见美国专利号7,838,738）、和（e）神经生长因子（NGF）特异性抗体（“APE409”），将其作为阴性对照（均在100μlDMEM/F-12/10%FCS中）。经处理后，各孔取10μl或20μl上清液依据生产厂商提供的方法分别进行人IL-6（eBioscience,Inc.,圣地亚哥，加利福尼亚州）或人IL-8（BioLegend,圣地亚哥，加利福尼亚州）ELISA。利用阴性对照（即，在处理过程中不存在抗-IL-17a抗体）对IL-6和IL-8的水平进行归一化处理。根据上文所述对经归一化的水平作图。
[0104] APE755抗体抑制IL-6和IL-8从IL-17刺激的原代人RA滑膜成纤维细胞中释放的作用比对照抗-IL-17a抗体高5倍（见图4）。
[0105] 本实施例的结果证明了包含本文所述的免疫球蛋白重链和轻链多肽的IL-17结合剂能够在体外与人IL-17结合。
[0106] 实施例4
[0107] 本实施例证明了本文所述的免疫球蛋白重链（HC）和轻链（LC）多肽能够形成在体外阻断IL-17活性的抗体。
[0108] 通过竞争性ELISA对抗-IL17a抗体对受体-配体结合的抑制情况进行了定量检测。使用每100μl含5nM myc-IL-17a（APE280）的包被缓冲液（eBioscience公司，,圣地亚哥，加利福尼亚州）包被96-孔检测板。将1nM生物素化的IL-17受体A（IL-17RA）（R&D Systems公司，明尼阿波利斯，明尼苏达州）与实施例3中所述的不同浓度的抗-IL17a抗体混合（均在
100μl封闭缓冲液中（eBioscience公司，圣地亚哥，加利福尼亚州）），在IL-17A包被的酶标板中孵育24小时。根据标准ELISA方法使用亲和素-辣根过氧化物酶（HRP）对捕获的生物素化的IL-17RA进行定量。将信号对阴性对照进行归一化处理，阴性对照中不存在封闭结合的抗-IL17a抗体。将经归一化处理的受体-配体结合信号对抗体的浓度作图，通过使用
GraphPad Prism软件对抑制曲线进行拟合确定各抗体的IC50。在阻断IL-17/IL-17RA相互作用方面，抗体APE755的作用比第一对照抗-IL-17a抗体强40倍，与第二抗-IL-17a对照抗体
接近（图5）。
100μl封闭缓冲液中（eBioscience公司，圣地亚哥，加利福尼亚州）），在IL-17A包被的酶标板中孵育24小时。根据标准ELISA方法使用亲和素-辣根过氧化物酶（HRP）对捕获的生物素化的IL-17RA进行定量。将信号对阴性对照进行归一化处理，阴性对照中不存在封闭结合的抗-IL17a抗体。将经归一化处理的受体-配体结合信号对抗体的浓度作图，通过使用
GraphPad Prism软件对抑制曲线进行拟合确定各抗体的IC50。在阻断IL-17/IL-17RA相互作用方面，抗体APE755的作用比第一对照抗-IL-17a抗体强40倍，与第二抗-IL-17a对照抗体
接近（图5）。
[0109] 本实施例的结果证明了包括重链多肽和轻链多肽的IL-17特异性抗体能够在体外抑制IL-17的活性，所述重链多肽含有SEQ ID NO:78，所述轻链多肽含有SEQ ID NO:24。
[0110] 实施例5
[0111] 本实施例证明了本文所述的免疫球蛋白重链（HC）和轻链（LC）多肽能够形成在体外结合人IL-17的抗体。
[0112] 使用BIACORETM和 检测评价多种抗体的结合亲和性，所述抗体包含本文所述的免疫球蛋白重链（HC）和轻链（LC）多肽。
[0113] BIACORE T100TM用于测定抗体-抗原结合的动力学和亲和性。该技术基于表面等离子体共振（SPR），这是一种能够在葡聚糖生物传感器基质中实时检测无标记相互作用的光学现象。因此其适于检测结合（k结合）和解离（k解离）速率常数。所有的试剂盒材料均购自GE Healthcare（白金汉郡，英国）。通过抗-人Fc抗体（GE Healthcare；目录号BR-1008-39）捕获抗-IL17a抗体，使用胺基偶联化学将抗-人Fc抗体共价固化于CM5传感器芯片（GE
Healthcare；目录号BR-1005-30）上。在葡聚糖的表面附着了3000个捕获抗体的响应单元
（RU），随后30-50个RU的500ng/mL抗-IL-17a抗体被捕获。使用1X HBS-EP+缓冲液（含0.01M HEPES、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05%聚山梨醇酯，pH7.6）将抗原重组为不同浓度（初始为
50nM，对各浓度按两倍比例进行倍比稀释）。将210μL各浓度的抗原以30μL/min的流速注射至捕获抗体上，然后使其解离10分钟。在各次循环后，使用60μL3M MgCl2将表面再生，以建立基线值。使用BIACORETMT100评估软件中的“传质比1:1”结合模型对结合和解离动力学常数（ka和kd）进行评价。BIACORETM检测的结合度表示为“++”（强结合）、“+”（结合）、或“+/-”（接近背景）。BIACORETM检测的结果见表3。
Healthcare；目录号BR-1005-30）上。在葡聚糖的表面附着了3000个捕获抗体的响应单元
（RU），随后30-50个RU的500ng/mL抗-IL-17a抗体被捕获。使用1X HBS-EP+缓冲液（含0.01M HEPES、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05%聚山梨醇酯，pH7.6）将抗原重组为不同浓度（初始为
50nM，对各浓度按两倍比例进行倍比稀释）。将210μL各浓度的抗原以30μL/min的流速注射至捕获抗体上，然后使其解离10分钟。在各次循环后，使用60μL3M MgCl2将表面再生，以建立基线值。使用BIACORETMT100评估软件中的“传质比1:1”结合模型对结合和解离动力学常数（ka和kd）进行评价。BIACORETM检测的结合度表示为“++”（强结合）、“+”（结合）、或“+/-”（接近背景）。BIACORETM检测的结果见表3。
[0114] 表3
[0115]
[0116] 对优化至≤100pM的抗体还采用 3000检测（Sapidyne Instruments,博伊西，爱达荷州）进行鉴定。用 技术检测溶液相中的未结合/游离的受体分子。使
用微珠检测溶液相中最大化的表面区域的结合，以避免对固相结合检测方法的传质限制及
该方法固有的迁移效应。在各项实验中，将50μg人IL-17a通过胺基偶联至50mg UltraLink Biosupport小珠（Thermo Scientific,沃尔瑟姆，马萨诸塞州；目录号53110）。在样品缓冲液（1X PBS，pH7.4，0.02%NaN3，0.1%BSA）中将恒定浓度的抗体（足以产生0.8V–1.2V的信号）与已滴定的抗原孵育足够长的时间以接近或达到平衡（各抗体的孵育时间不同，其依赖于
亲和性）。然后抗体-抗原溶液以0.25mL/min的速度流过抗原偶联的小珠。使用Cy5偶联的
AffiniPure驴抗-人IgG（H+L）（Jackson ImmunoResearch；目录号：709-175-149）检测被小珠捕获的游离抗体。使用 Pro软件的单位点均相(homogeneous)结合模型进行非
线性回归分析，以获得抗体的Kd和/或ABC（活性结合浓度）。为了对各抗体进行最准确的检测，在N-曲线分析中将各“Kd控制曲线”（其中抗体浓度低于Kd）与“受体控制曲线”（其中抗体浓度远高于Kd）结合。 检测的结果列于表4。
用微珠检测溶液相中最大化的表面区域的结合，以避免对固相结合检测方法的传质限制及
该方法固有的迁移效应。在各项实验中，将50μg人IL-17a通过胺基偶联至50mg UltraLink Biosupport小珠（Thermo Scientific,沃尔瑟姆，马萨诸塞州；目录号53110）。在样品缓冲液（1X PBS，pH7.4，0.02%NaN3，0.1%BSA）中将恒定浓度的抗体（足以产生0.8V–1.2V的信号）与已滴定的抗原孵育足够长的时间以接近或达到平衡（各抗体的孵育时间不同，其依赖于
亲和性）。然后抗体-抗原溶液以0.25mL/min的速度流过抗原偶联的小珠。使用Cy5偶联的
AffiniPure驴抗-人IgG（H+L）（Jackson ImmunoResearch；目录号：709-175-149）检测被小珠捕获的游离抗体。使用 Pro软件的单位点均相(homogeneous)结合模型进行非
线性回归分析，以获得抗体的Kd和/或ABC（活性结合浓度）。为了对各抗体进行最准确的检测，在N-曲线分析中将各“Kd控制曲线”（其中抗体浓度低于Kd）与“受体控制曲线”（其中抗体浓度远高于Kd）结合。 检测的结果列于表4。
[0117] 表4
[0118]
[0119] 本实施例的结果证明了包含本文所述的免疫球蛋白重链和轻链多肽的IL-17结合剂能够在体外与人IL-17结合。
[0120] 在本文中引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请、和专利，都通过引用并入本文，对每篇参考文献的引用都单独地和具体地指出其为通过引用的方式并入，并且在本文中将其完整地列出。
[0121] 在本发明描述的上下文中（特别是在本发明的权利要求的上下文中），术语“一”和“一个”以及“所述”以及相似指示词的使用应理解为包括单数和复数，除非在本申请中另有说明或者与上下文明显矛盾。术语“包含”“具有”“包括”以及“含有”都应理解为开放性术语（即，意思是“包括，但不限于”），除非另有注明。本申请中对值的范围的描述仅仅旨在作为对每个落在该范围内的单个数值的单独引用的简略写法，除非另有说明，且每个单个数值通过在本文中单独引用并入本说明书。所有在本申请中描述的方法都可以按照任何适当的
顺序进行，除非在本文中另有说明，或除非与上下文明显矛盾。在本申请中任何和所有的实施例，或示例性语言（例如，“例如”）的使用，都仅旨在更好地阐明本发明，而不是在本发明的范围上加以限制，除非权利要求另有要求。说明书中的任何语言都不应被理解为用于表
明任何未要求的元素是实施本发明所必需。
顺序进行，除非在本文中另有说明，或除非与上下文明显矛盾。在本申请中任何和所有的实施例，或示例性语言（例如，“例如”）的使用，都仅旨在更好地阐明本发明，而不是在本发明的范围上加以限制，除非权利要求另有要求。说明书中的任何语言都不应被理解为用于表
明任何未要求的元素是实施本发明所必需。
[0122] 本文描述了本发明的优选实施方式，包括发明人所知道的实施本发明的最佳方式。在对上述说明书阅读的基础上，那些优选实施方式的变体对本领域普通技术人员而言
是很明显的。发明人认为，熟练的技术人员可以根据需要应用这样的变体，且发明人认为，本发明可以以本申请中具体描述以外的方式实施。因此，本发明包括由适用法律所准许的
本发明的权利要求中所述主题的所有修饰和等同。而且，本发明包括以上所述元素的所有
可能的变体的任意组合，除非在本文中另有说明或者与上下文明显矛盾。
是很明显的。发明人认为，熟练的技术人员可以根据需要应用这样的变体，且发明人认为，本发明可以以本申请中具体描述以外的方式实施。因此，本发明包括由适用法律所准许的
本发明的权利要求中所述主题的所有修饰和等同。而且，本发明包括以上所述元素的所有
可能的变体的任意组合，除非在本文中另有说明或者与上下文明显矛盾。