一种棕色蘑菇三级菌种扩繁体系的建立方法

摘要

本发明公开了一种棕色蘑菇三级菌种扩繁体系的建立方法，包括母种、液体菌种、栽培种的三级菌种扩繁。其中的母种培养基配方(g/L)：草炭土600g，葡萄糖20g，麦粒100g，硫酸镁1.5g，磷酸二氢钾1g，蛋白胨2g，水1000mL；液体菌种配方（g/L）：马铃薯200，葡萄糖20，蛋白胨2，磷酸二氢钾2，硫酸镁1，VB10.01，pH自然；栽培种的制作：麦粒土培养基(%)：麦粒92，石膏5，草炭土3。采用本发明的扩繁体系较之传统的固态三级菌种，扩繁周期缩短了38天。本发明研究出的棕色蘑菇三级菌种的最佳扩繁方案，对棕色蘑菇的大规模工厂化生产具有一定的指导意义。

权利要求

1.一种棕色蘑菇三级菌种扩繁体系的建立方法，其特征在于它包括母种、液体菌种、栽培种的三级菌种扩繁组合在一起，建立的一种扩繁体系，其方法如下：（1）母种的制备：

1）母种培养基配方，即草炭土培养基(g/L)：草炭土600，葡萄糖20，麦粒100，硫酸镁

1.5，磷酸二氢钾1，蛋白胨2，水1000mL；

2）配制培养基：取适量草炭土、麦粒，加入1000ml的清水中煮沸20～30min，滤液；

向滤液中加入硫酸镁、磷酸二氢钾、蛋白胨、葡萄糖、琼脂，待药品溶化后，补足水分，分装试管；

3）灭菌：121℃，灭菌20min，灭菌结束后，取出摆斜面；

4）接种、培养：严格按照无菌操作将棕色蘑菇菌丝接种于斜面中部；25℃恒温培养至满管；

5）挑杂、保存：将染菌、生长状态不佳的斜面去除后，将剩余斜面置于4℃冰箱保存，备用；

（2）液体菌种的制备：

1）液体菌种配方，即种子培养基（g/L）：马铃薯200，葡萄糖 20，蛋白胨 2，磷酸二氢钾

2，硫酸镁 1，VB1 0.01，pH自然；麸皮发酵培养基为（g/L）：麸皮 120，葡萄糖 15，蛋白胨

2，pH自然；

2）配制种子液培养基：称取马铃薯处理后，加水煮沸30分钟，过滤，再加入葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁、VB1，充分溶解后趁热过滤，分装，50mL/250mL三角瓶；

3）灭菌，121℃，灭菌20min；

2

4）制备种子液：灭菌结束后，取出放凉，严格按照无菌操作接种，取5块0.5 cm 新鲜斜面菌种接种于种子培养基中，25℃，150rpm摇床培养7天；

5）配制发酵培养基：取麸皮，加入清水煮沸20-30min，滤液，向麸皮煮液中加入葡萄糖、蛋白胨、硫酸镁、磷酸二氢钾，待药品溶解后，加入清水补足水分，分装，100mL/250mL三角瓶；

6）灭菌：121℃，灭菌20min；

7）接种、培养：将制备好的种子液以接种量 8%移入装发酵培养基的250mL三角瓶中，

25℃，150rpm培养7天，即得棕色蘑菇液体菌种；

8）挑杂：每日通过外观观察发酵液是否浑浊，有酸味，则说明被细菌污染，除去；

（3）栽培种的制作：

1）麦粒土培养基(%)：麦粒92，石膏5，草炭土3；

2）煮麦：选择无虫蛀的小麦，倒入沸水中煮20～25分钟，并不断搅拌，煮至麦粒无白心时，立即停火将麦粒捞出，晾至表面无水迹；

3）配料：将石膏、草炭土按比例加入，并将其翻拌均匀，即可装瓶；　　

4）装瓶灭菌：121℃，灭菌2～2.5小时；

5）接种：将所制备的液体菌种，以15%的接种量均匀喷入栽培种中，严格按照无菌操作要求操作；

6）培养：将接种后的栽培种置于25℃恒温培养室中遮光培养，至满瓶；

7）挑杂：将染菌、生长状态不佳的栽培种去除后，将剩余菌种保存备用。

说明书

一种棕色蘑菇三级菌种扩繁体系的建立方法

技术领域

[0001] 本发明提供了涉及褐蘑菇的栽培方法，更具体的说是一种棕色蘑菇三级菌种扩繁的方法。

背景技术

[0002] 棕色蘑菇（Agaricus brunnescens Peck），是蘑菇中的珍稀类品种，属于担子菌纲(Basidiomycotina)、伞菌目(Agaritales)、蘑菇科(Agaricaceae)、蘑菇属 (garicus)。棕色蘑菇俗称棕蘑，是波希美亚种。该菌株产量高、菇质优良、口感鲜嫩，其菇盖为自然棕褐色，菌柄白色，肉质致密紧实。现在所有的白色双孢蘑菇品种均为棕色蘑菇的白色变种，也就是说棕色蘑菇是白色双孢蘑菇的野生祖先。棕色蘑菇,别名白蘑菇、洋菇,属于担子菌纲、伞菌目、蘑菇科、蘑菇属。棕色蘑菇营养丰富、味道鲜美,据报导鲜蘑菇含蛋白质3%—4%,脂肪0.2%—0.3%,碳水化合物2.4%—3.8%,可消化率达70%—90%,享有“植物肉”之称。蘑菇的氨基质酸组成较全面,尤其富含人体必需的赖氨酸等。棕色蘑菇还含有丰富的铁、钾、钙等矿质元素。还含有硫氨素、核黄素、烟酸、抗坏血酸等多种维生素及酶类。由于含有较高的不饱和脂肪酸,故多食用蘑菇对降低血脂有明显作用,用蘑菇罐头加工预煮液制成的药物对医治迁延性肝炎、慢性肝炎、肝肿大、早期肝硬化等均有显著疗效。随着人们追求天然、返璞归直潮流的到来，棕色蘑菇在市场上受到广大消费者的追捧，是一个很好的商业品种。

[0003] 目前，棕色蘑菇菌种培养主要采用固体培养方法，制作周期长，加上其制作时间正值高温季节，导致生产成本上升。而液体培养是采用液体基质质发酵来进行发酵培养菌种的生产，其原理是：在发酵罐或三角瓶中，采用液体培养基质，通入无菌空气加以搅拌或振荡，增加培养基质中的溶氧含量，提供菌丝体呼吸代谢所需要的氧气，并控制适宜的外界条件，使得菌体在液体深处繁殖发育，获得大量的菌丝体或代谢产物。

[0004] 由于棕色蘑菇具有较好的市场前景，但目前对其栽培方法的研究较少，尤其是较之双孢蘑菇三级菌种繁育时间较长，本发明旨在通过对棕色蘑菇液体菌种的制备和栽培种的制作，研究出棕色蘑菇三级菌种的最佳扩繁方案，将对棕色蘑菇的大规模工厂化生产具有一定的指导意义。

发明内容

[0005] 本发明公开的技术内容如下：

[0006] 一种棕色蘑菇三级菌种扩繁体系的建立方法，其特征在于它包括母种、液体菌种、栽培种的三级菌种扩繁组合在一起，建立的一种扩繁体系，其方法如下：

[0007] （1）母种的制备：

[0008] 1）母种培养基配方，即草炭土培养基(g/L)：草炭土600g，葡萄糖20g，麦粒100g，硫酸镁1.5g，磷酸二氢钾1g，蛋白胨2g，水1000mL；

[0009] 2）配制培养基：取适量草炭土、麦粒，加入1000ml的清水中煮沸20～30min，滤液；向滤液中加入硫酸镁、磷酸二氢钾、蛋白胨、葡萄糖、琼脂，待药品溶化后，补足水分，分装试管；

[0010] 3）灭菌：121℃，灭菌20min，灭菌结束后，取出摆斜面；

[0011] 4）接种、培养：严格按照无菌操作将棕色蘑菇菌丝接种于斜面中部；25℃恒温培养至满管；

[0012] 5）挑杂、保存：将染菌、生长状态不佳的斜面去除后，将剩余斜面置于4℃冰箱保存，备用；

[0013] （2）液体菌种的制备：

[0014] 1）液体菌种配方，即种子培养基（g/L）：马铃薯200，葡萄糖 20，蛋白胨 2，磷酸二氢钾 2，硫酸镁 1，VB1 0.01，pH自然；麸皮发酵培养基为（g/L）：麸皮 120，葡萄糖 15，蛋白胨 2，pH自然；

[0015] 2）配制种子液培养基：称取马铃薯处理后，加水煮沸30分钟，过滤，再加入葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁 1，VB1，充分溶解后趁热过滤，分装，50mL/250mL三角瓶；

[0016] 3）灭菌，121℃，灭菌20min；

[0017] 4）制备种子液：灭菌结束后，取出放凉，严格按照无菌操作接种，取5块0.5 cm2新鲜斜面菌种接种于种子培养基中，25℃，150rpm摇床培养7天；

[0018] 5）配制发酵培养基：取麸皮，加入清水煮沸20-30min，滤液，向麸皮煮液中加入葡萄糖、蛋白胨、硫酸镁、磷酸二氢钾，待药品溶解后，加入清水补足水分，分装，100mL/250mL三角瓶；

[0019] 6）灭菌：121℃，灭菌20min；

[0020] 7）接种、培养：将制备好的种子液以接种量 8%移入装发酵培养基的250mL三角瓶中，25℃，150rpm培养7天，即得棕色蘑菇液体菌种；

[0021] 8）挑杂：每日通过外观观察发酵液是否浑浊，有酸味，则说明被细菌污染，除去；

[0022] （3）栽培种的制作：

[0023] 1）麦粒土培养基(%)：麦粒92，石膏5，草炭土3；

[0024] 2）煮麦：选择无虫蛀的小麦，倒入沸水中煮20～25分钟，并不断搅拌，煮至麦粒无白心时，立即停火将麦粒捞出，晾至表面无水迹；

[0025] 3）配料：将石膏、草炭土按比例加入，并将其翻拌均匀，即可装瓶；　　[0026] 4）装瓶灭菌：121℃，灭菌2～2.5小时；

[0027] 5）接种：将所制备的液体菌种，以15%的接种量均匀喷入栽培种中，严格按照无菌操作要求操作；

[0028] 6）培养：将接种后的栽培种置于25℃恒温培养室中遮光培养，至满瓶；

[0029] 7）挑杂：将染菌、生长状态不佳的栽培种去除后，将剩余菌种保存备用。

[0030] 为了确定最佳的培养基质，本发明进行了大量的实验性研究工作，最后率先在棕色蘑菇菌种扩繁中，创建了母种（斜面菌种）→原种（液体菌种）→栽培种（麦粒种）的三级菌种扩繁技术体系。采用该扩繁体系较之传统的固态三级菌种，扩繁周期缩短了38天。

[0031] 本发明公开的菌种扩繁体系建立方法，是一种创新体系的建立。因为传统是将母种、原种、三级种分开进行的，本发明是将三者组合在一起，创新点在将传统的麦粒原种改为液体原种，这个体系的建立大大缩短了菌种的生长周期，且菌种质量优。

[0032] 本发明选用的棕色蘑菇MC441菌株主要优特点是：

[0033] 1.该菌株菇盖表面为自然棕褐色，菇柄、菌肉白色；菇质优，子实体圆整，菇盖厚、结实，不凹顶；味道鲜美，口感鲜嫩，保鲜期长。菌丝生长速度快。产量高，在相同条件下，比白色蘑菇品种提早2-3天出菇，菇潮整齐，产量达9-10公斤/平方。3.出菇温度范围广，尤其是低温结实能力比常规白色蘑菇强，在5℃-8℃下，产量比对照2796高70％。栽培技术简易、栽培原料来源广。其培养料配方以稻、麦草为主要原料，培养料及堆制发酵方法与常规蘑菇相同。

[0034] 本发明公开的棕色蘑菇三级菌种扩繁方法与现有技术相比所具有的积极效果在于：

[0035] （1）菌种更纯，液体菌种生产经过筛选、提纯，属纯菌种。

[0036] （2）周期更短，采用液体菌种从制种到菌丝长满栽培袋只需30天。

[0037] （3）污染更少，采用液体菌种接种后24小时萌发，菌种萌发速度超过杂菌生长速度。

[0038] （4）出菇整齐上市早，采用液体菌种种植的棕色蘑菇，出菇整齐，能够提前2个月上市。

具体实施方式

[0039] 下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定。其中棕色蘑菇MC441引自福建省蘑菇菌种对外有售。

[0040] 实施例1

[0041] 棕色蘑菇三级菌种扩繁体系的建立

[0042] 1.1 母种的制备：

[0043] （1）母种培养基配方，即草炭土培养基(g/L)：草炭土600g，葡萄糖20g，麦粒100g，硫酸镁1.5g，磷酸二氢钾1g，蛋白胨2g，水1000mL。

[0044] （2）配制培养基。取适量草炭土、麦粒，加入一定量的清水中煮沸20～30min，用4层纱布过滤，得滤液。向滤液中加入硫酸镁、磷酸二氢钾、蛋白胨、葡萄糖、琼脂，待药品溶化后，补足水分，分装试管。

[0045] （3）灭菌。121℃，灭菌20min。灭菌结束后，取出摆斜面。

[0046] （4）接种、培养。严格按照无菌操作将棕色蘑菇菌丝接种于斜面中部。25℃恒温培养至满管。

[0047] （5）挑杂、保存。将染菌、生长状态不佳的斜面去除后，将剩余斜面置于4℃冰箱保存，备用。

[0048] 1.2 液体菌种的制备：

[0049] （1）液体菌种配方，即种子培养基（g/L）：马铃薯200，葡萄糖 20，蛋白胨 2，磷酸二氢钾 2，硫酸镁 1，VB1 0.01，pH自然。麸皮发酵培养基为（g/L）：麸皮 120，葡萄糖 15，蛋白胨 2，pH自然。

[0050] （2）配制种子液培养基。称取适量马铃薯，洗净去皮、沙眼，切碎，加适量水煮沸半个小时，纱布过滤，再加入葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁 1，VB1，充分溶解后趁热纱布过滤，分装，50mL/250mL三角瓶。

[0051] （3）灭菌。121℃，灭菌20min。

[0052] （4）制备种子液。灭菌结束后，取出放凉。严格按照无菌操作接种，取5块0.5 cm2新鲜斜面菌种接种于种子培养基中，25℃，150rpm摇床培养7天。

[0053] （5）配制发酵培养基。取适量麸皮，加入一定量清水煮沸20-30min，用4层纱布过滤，得滤液。向麸皮煮液中加入葡萄糖、蛋白胨、硫酸镁、磷酸二氢钾，待药品溶解后，加入一定量清水补足水分，分装，100mL/250mL三角瓶。

[0054] （6）灭菌。121℃，灭菌20min。

[0055] （7）接种、培养。将制备好的种子液以接种量 8%移入装发酵培养基的250mL三角瓶中，25℃，150rpm培养7天，即得棕色蘑菇液体菌种。

[0056] （8）挑杂。每日通过外观观察发酵液是否浑浊，有酸味，则说明被细菌污染，除去。发酵结束后，①外观观察，发酵液澄清，底部有数量较多的直径2-3mm菌丝球，或是发酵液粘稠内有较多菌丝，说明有多糖产生，有蘑菇特有的清香味，无酸味。②显微镜观察，取少量发酵液，用番红或结晶紫染色，在油镜下观察是否有杂菌污染。将发酵正常的液体菌种留用。

[0057] 1.3 栽培种的制作：

[0058] （1）麦粒土培养基(%)：麦粒92，石膏5，草炭土3。

[0059] （2）煮麦。选择无虫蛀的小麦，倒入沸水中煮20～25分钟，在煮沸期间捞去麦瘪等漂浮杂物，并不断搅拌，煮至麦粒无白心时，立即停火将麦粒捞出，切忌将麦粒表皮煮破。在水泥地面晾至表面无水迹。

[0060] （3）配料。将石膏、草炭土按比例加入，并将其翻拌均匀，即可装瓶。　　[0061] （4）装瓶灭菌。121℃，灭菌2～2.5小时。

[0062] （5）接种。将所制备的液体菌种，以15%的接种量均匀喷入栽培种中，严格按照无菌操作要求操作。

[0063] （6）培养。将接种后的栽培种置于25℃恒温培养室中遮光培养，至满瓶。

[0064] （7）挑杂。将染菌、生长状态不佳的栽培种去除后，将剩余菌种保存备用。

[0065] 实施例2

[0066] 一种棕色蘑菇三级菌种扩繁体系的建立方法

[0067] （1）母种的制备：

[0068] 1）母种培养基配方，即草炭土培养基(g/L)：草炭土600g，葡萄糖20g，麦粒100g，硫酸镁1.5g，磷酸二氢钾1g，蛋白胨2g，水1000mL；

[0069] 2）配制培养基：取适量草炭土、麦粒，加入1000ml的清水中煮沸30min，滤液；向滤液中加入硫酸镁、磷酸二氢钾、蛋白胨、葡萄糖、琼脂，待药品溶化后，补足水分，分装试管；

[0070] 3）灭菌：121℃，灭菌20min，灭菌结束后，取出摆斜面；

[0071] 4）接种、培养：严格按照无菌操作将棕色蘑菇菌丝接种于斜面中部；25℃恒温培养至满管；

[0072] 5）挑杂、保存：将染菌、生长状态不佳的斜面去除后，将剩余斜面置于4℃冰箱保存，备用；