一种β-葡萄糖苷酶及其表达基因与应用

摘要

本发明涉及一种β-葡萄糖苷酶及其表达基因与应用。一种β-葡萄糖苷酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；该β-葡萄糖苷酶的表达基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。利用本发明所述的β-葡萄糖苷酶生产寡糖，与现有β-葡萄糖苷酶相比，反应速度明显加快，β-葡萄糖苷酶的最佳酶活温度更接近常温，在实际工业化生产中，有利于降低生产耗能，并且本发明所述的β-葡萄糖苷酶在重组菌株中表达量高，纯化过程简单，易于大规模工业化生产。

权利要求

1.一种β-葡萄糖苷酶，其特征在于，所述氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种β-葡萄糖苷酶的表达基因，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3. 一种重组表达载体，是将如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列插入表达载体获得。

4. 如权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述表达载体为pET-32A表达载体。

5. 一种重组细胞，是将权利要求3或4所述的重组表达载体转化入细胞中获得。

6. 如权利要求5所述的重组细胞，其特征在于，所述细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。

7. 一种利用β-葡萄糖苷酶生产寡糖的方法，其特征在于，所述步骤如下：将核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的基因片段导入到pET-32A质粒载体中，然后转入大肠杆菌BL21(DE3)中，通过亲和层析色谱分离纯化制得β-葡萄糖苷酶，然后将β-葡萄糖苷酶加入以葡萄糖为底物的反应液中，在温度为30度，pH为6.0的条件下反应，获得寡糖。

说明书

一种β-葡萄糖苷酶及其表达基因与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种β-葡萄糖苷酶及其表达基因与应用，特别是一种β-葡萄糖苷酶及其表达基因与利用该酶生产寡糖的方法，属于生物技术和生物化工技术领域。

背景技术

[0002] 寡糖是一种由2-10个单糖组成的低聚糖，其有着非常广泛的应用价值。如目前广泛应用于食品、保健品、饮料、医药、饲料添加剂等领域。美国、日本、欧洲等地均有规模化生产，我国低聚糖的开发和应用起于90年代中期，近几年发展迅猛。常见的寡糖包括麦芽低聚糖葡萄糖(α—1，4糖苷键结合)，龙胆二糖葡萄糖（β—1，6糖苷键结合），低聚糖木糖（β—1，4糖苷键结合）等。目前制造龙胆二糖的技术方法主要包括以下两种：1、从天然原料中提取，但这种方法提取产量低，价格昂贵，无法满足工业化生产。2、酶法生产龙胆二糖，不过目前酶法生产龙胆二糖存在着酶活性效率低下，酶生产费用高昂等不便因素。

[0003] 目前酶法生产寡糖，是将单糖作为底物，利用糖苷酶生产寡糖。如中国专利文献CN101492661A（申请号200910029055.4）公开了一种β-葡萄糖苷酶基因的克隆、表达及用于龙胆低聚糖的制备，该发明由黑曲霉WX-07总RNA逆转录合成β-葡萄糖苷酶基因(BGL)SEQID NO:1，BGL的CDNA以质粒PPIC9K为表达载体，以毕赤酵母(P.PASTORIS)为表达宿主,实现BGL基因在胞外的可溶性表达；BGL的CDNA全长2523个核苷酸，编码841个氨基酸，构建的BGL/PPIC9K转化P.PASTORIS KM71可表达BGL酶。BGL酶具有转糖苷活性，能将葡萄糖转糖苷生成龙胆低聚糖。但是该文献公开的酶生产寡糖所用时间过长，产物得率过低，无法满足生产要求。

发明内容

[0004] 本发明针对现有技术的不足，提供一种β-葡萄糖苷酶及其表达基因的高效生产与利用该酶生产寡糖的方法。

[0005] 发明概述

[0006] 本发明通过对里氏木霉菌株中产生的β-葡萄糖苷酶进行相关改造，发现其改造后的β-葡萄糖苷酶的作用产物的产量提高了3.3倍。而且与报道的同类技术相比，产生相同产量寡糖所需的时间缩短了4.8倍，最终产物得率提高了25%。

[0007] 发明详述

[0008] 本发明技术方案如下：

[0009] 一种β-葡萄糖苷酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0010] 一种β-葡萄糖苷酶的表达基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0011] 一种重组表达载体，是将如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列插入表达载体获得。

[0012] 根据本发明优选的，所述表达载体为pET-32A表达载体。

[0013] 一种重组细胞，是将上述重组表达载体转化入细胞中获得。

[0014] 根据本发明优选的，所述细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。

[0015] 一种利用β-葡萄糖苷酶生产寡糖的方法，步骤如下：

[0016] 将核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的基因片段导入到pET-32A质粒载体中，然后转入大肠杆菌BL21(DE3)中，通过亲和层析色谱分离纯化制得β-葡萄糖苷酶，然后将β-葡萄糖苷酶加入以葡萄糖为底物的反应液中，在温度为30度，pH为6.0的条件下反应，获得寡糖。

[0017] 有益效果

[0018] 1、利用本发明所述的β-葡萄糖苷酶生产寡糖，与现有β-葡萄糖苷酶相比，反应速度明显加快。

[0019] 2、本发明所述的β-葡萄糖苷酶的最佳酶活温度更接近常温，在实际工业化生产中，有利于降低生产耗能。

[0020] 3、本发明所述的β-葡萄糖苷酶在重组菌株中表达量高，纯化过程简单，易于大规模工业化生产。

附图说明

[0021] 图1亲和层析纯化蛋白结果SDS-PAGE图谱；

[0022] 其中：M、marker，1、大肠杆菌细胞破碎液，2、镍亲和层析柱洗脱峰，3、阴离子交换层析洗脱峰，4、阴离子交换层析洗脱峰。

[0023] 图2薄层层析分析寡糖产物成分；

具体实施方式

[0024] 下面通过实施例对本发明的技术方案做进一步的阐述，应该说明的是，本说明的保护范围不仅限于此。

[0025] 里氏木霉（trichoderma reesei）QM6a购自美国标准生物品保藏中心，菌种保藏号ATCC No.13631；

[0026] Pet-32A质粒载体购自Novagen公司。

[0027] 实施例1：

[0028] (1)里氏木霉QM6a总RNA的提取：

[0029] 里氏木霉QM6a菌株在加有2wt%微晶纤维素的MM培养基中培养2天，用滤纸过滤收集菌丝。将收集的菌丝放入预冷的研钵中研磨，其中研磨时加入一定的液氮。将研磨成的菌丝粉末移至1.5ml离心管中，并加入1ml RNAiso（购自生工生物工程有限公司B6402-1）于振荡器中震荡均匀，室温放5min。然后12000rpm离心10min。然后将上清吸到干净的1.5ml离心管中。然后加入160μl氯仿，震荡15s混匀，室温放置5min，12000rpm，4度离心
5min。然后吸上清至新的1.5ml离心管。然后再加入800μl异丙醇，上下颠倒5次。室温放置10min，12000rpm，4度离心10min。弃上清。加入1ml预冷的75%乙醇清洗RNA，震荡后7500rpm离心5min。加入50μl DEPC处理过的水，溶解RNA。

[0030] MM培养基组分如下：硫酸铵3g，磷酸二氢钾4.5g，硫酸镁0.18g，二水氯化钙0.24g尿素1.5g，1000×微量元素（七水硫酸铁5g/L，一水硫酸锰1.6g/L，七水硫酸锌
1.4g/L，氯化钴2g/L）30μl，用水补足到300ml。

[0031] (2)β-葡萄糖苷酶编码基因的克隆：

[0032] 以里氏木霉QM6a总RNA为模板，利用逆转录合成cDNA（购自takara反转录试剂盒BK1201）：

[0033] ①基因组DNA的去除反应

[0034] 按以下比例配制反应液：

[0035] 5×gDNA Eraser Buffer 2μl

[0036] gDNA Eraser 1μl

[0037] Total RNA 0.5μg

[0038] RNAase Free ddH2O up to10μl

[0039] 将上述反应液在42度条件下反应2min。

[0040] ②反转录反应：

[0041] 按以下比例配制反应液：

[0042] 5×PrimeScript Buffer2 4μl

[0043] PrimeScript RT Enzyme Mix I 1μl

[0044] RT Primer Mix 1μl

[0045] 步骤①配制的反应液 10μl

[0046] RNase Free ddH2O up to20μl

[0047] 将上述反应液在37度反应15min，接着在85度反应5s。

[0048] 以F，R为上下游引物扩增出bgl基因：

[0049] 引物F：CCGGAATTCATGCCCGAGTCGCTAGCTCTGCCC；

[0050] 引物R:CCCAAGCTTTGCCGCCACTTTAACCCTCTGC；

[0051] PCR反应在50μl体系中进行：2×PCR Buffer25μl，2mM dNTPs10μl，引物F1.5μl，引物R1.5μl，模板DNA1μl，KOD FX聚合酶1μl，加双蒸水补足到50μl。

[0052] PCR反应体系：在94度变性2min后开始循环，然后98度变性10s,60度退火30s，68度延伸90s，共35个循环后，再于68度延伸10min，扩增得到PCR片段，割胶回收，回收片段连接在PET32A质粒载体上，连接位置在质粒载体的多克隆位点EcoR1和HindIII之间。
连接产物转化大肠杆菌DH5α，转化产物涂布于含100mg/L氨苄青霉素的LB平板，经37度培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基，10个小时后提取质粒。

[0053] （3）β-葡萄糖苷酶基因的改造

[0054] 将上述重组质粒中的β-葡萄糖苷酶基因进行定点突变，突变位点为I177S，I174S。首先突变位点I177S。以F1，R1为反向引物进行定点突变（试剂盒来源于东洋纺公司KOD-PLUS-Mutagenesis Kit167300），序列如下：

[0055] F1：AGCTATGGATATGCCACCGGCAGCAACGC；

[0056] R1：GGCCTGAATCCAGGGTTCGTTGATGGTG；

[0057] ①反向PCR

[0058] 按以下比例配制PCR反应液：

[0059] 10×Buffer 5μl

[0060] 2mM dNTPs 5μl

[0061] F1 1.5μl

[0062] R1 1.5μl

[0063] 重组质粒（PET32A-BGL） 1μl

[0064] KOD-PLUS-Mutagenesis Kit 1μl

[0065] ddH2O up to50μl

[0066] PCR反应体系：在94度变性2min后开始循环，然后98度变性10s，65度退火30s，68度延伸7min，共5个循环。

[0067] ②DPN I对模板质粒的消化

[0068] 在上述反应后的反应液中加入1μlDPN I，在37℃条件下反应1个小时；

[0069] ③PCR产物的自身环化

[0070] 按以下比例配制反应液

[0071] Ligation high 5μl

[0072] ddH2O 7μl

[0073] ②中的反应液 2μl

[0074] T4Kinase 1μl

[0075] 将上述反应液在16度条件下反应1小时

[0076] 反应后转化大肠杆菌DH5α，转化产物涂布于含100mg/L氨苄青霉素的LB平板，经37度培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基，10个小时后提取质粒。将此质粒进行序列测定。挑选出突变正确的质粒。

[0077] 以上述突变位点I177S突变正确的质粒为模板，突变I174S位点，设计反向PCR引物F2和R2，按上述同样的方法挑选出突变正确的质粒。

[0078] F2:AGTCAGGCCAGCTATGGATATGCCACCG

[0079] R2：CCAGGGTTCGTTGATGGTGATCCAGTTCT

[0080] 制得的β-葡萄糖苷酶表达基因经华大基因生物工程公司测序验证，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0081] 接着将重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中。将得到的含有重组质粒的大肠杆菌扩大培养，培养至OD600为0.6时加入千分之一含量为100mM的IPTG，16度条件下诱导16个小时。然后在7000rpm条件下离心，收集菌体，用pH为6.0，50mM PBS缓冲液洗涤菌体两遍。通过超声破碎后，用镍离子亲和层析和阴离子交换色谱的方式纯化出目的蛋白，然后分别将破碎后的液体、镍离子亲和层析后的洗脱峰溶液及阴离子交换色谱纯化后的洗脱峰溶液经SDS-PAGE电泳后，结果如图1所示，将其与反应液按每1ml反应液添加0.35mg的酶量进行反应。反应条件为30℃，pH为6.0，反应液成分为10ml体系中加入40%葡萄糖，500μl叠氮化钠，1mL的pH6.0的50mM磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲溶液。反应10小时后，样品沸水浴10min灭酶活。然后通过HPLC和薄层层析(图2)鉴定产物浓度和种类。其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0082] 实施例2：

[0083] 将纯化出来的β-葡萄糖苷酶和野生型β-葡萄糖苷酶分别取100μl加入到含5mM的p-nitrophenyl glucoside的50mM的磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲溶液中(加入
10%甘油)，pH为7.4，温度为30℃，反应30分钟。用10%碳酸氢钠150μl终止反应。取适量的体积在420nm光波长处测定OD值，得出其水解酶活。使用Bradford试剂盒（上海生工生物工程SK3041-1）测定其蛋白质浓度。酶活定义如下：每分钟转化产生1mM pNP为一个酶活单位(U)。结果如表1所示。

[0084] 表1

[0085]

[0086] 实施例3：

[0087] 将实例2中的条件进行优化,使转糖基活性达到较高水平.分别设定不同的温度,pH值优化本发明β-葡萄糖苷酶的转糖基作用.通过实验得出在条件为pH5.0，温度为30度时，转糖基活性最高,并在72小时左右达到最高值.在此条件下分别以60%，70%，80%葡萄糖浓度为底物，得到72小时的最高点，如表2所示。

[0088] 表2

[0089]葡萄糖浓度(mg/100mL) 60 70 80
寡糖得率（mg/mL） 45.237 56.615 64.743

[0090] 实施例4：

[0091] 将纯化后目的蛋白与反应液按每1ml反应液添加0.35mg的酶量进行反应。反应条件为30℃，pH为6.0，反应液成分为10ml体系中加入40%葡萄糖，500μl叠氮化钠，1mL的pH6.0的50mM磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲溶液。反应阶段定时取样，样品沸水浴10min灭酶活。结果如表3。

[0092] 表3

[0093]