一种制备宝霍苷I纯品的方法

摘要

本发明涉及一种制备宝霍苷I纯品的方法。以实验室自制的淫羊藿苷(纯度大于98％)为原料，经过葡聚糖酶水解，得到含量大于90％的宝霍苷I粗品，用反相高效制备色谱作为纯化手段，得到纯度大于98％的宝霍苷I纯品。本发明工艺步骤简单、纯度高、成本低，并且可大规模生产。

权利要求

1.一种宝霍苷I纯品的制备方法，其特征在于：以淫羊藿苷为原料，葡聚糖酶水解及反相高效制备色谱纯化，即可获得纯度大于98％的宝霍苷I纯品；具体步骤如下：

1)葡聚糖酶水解：

将1-25mg淫羊藿苷用10-100ml柠檬酸缓冲溶液溶解，加入40-150ul、4-10ug/ul的葡聚糖酶水溶液，保持19-80摄氏度并搅拌3-6小时，获得宝霍苷I沉淀；

宝霍苷I沉淀经水洗除去部分酶和大部分葡萄糖，进一步用-4到4摄氏度冷甲醇溶解除去残余酶和不溶沉淀，上清液浓缩干燥即可得到宝霍苷I粗品；

2)反相高效制备液相纯化：

宝霍苷I粗品用甲醇溶解，经0.45um微膜过滤；通过微膜滤出的样品上样分析，采用C18反相填料制备色谱柱分离纯化，采用C18键合硅胶填料，采用体积浓度70-100％甲醇水溶液等度洗脱，采用紫外检测器检测，检测波长270nm，收集相应保留时间处馏分，浓缩干燥即得纯度大于98％的宝霍苷I纯品。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：水解步骤中柠檬酸缓冲体系的PH值控制在4-7，水解时间控制在3-6小时，水解温度控制在19-80摄氏度。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：宝霍苷I纯品获得采用反相高效制备色谱柱，填料优选10-20um C18键合硅胶，柱效大于等于2500。

说明书

一种制备宝霍苷I纯品的方法

[0001] 技术领域本发明涉及一种制备宝霍苷I纯品的方法。主要包括淫羊藿苷的葡聚糖酶水解，及宝霍苷I的反相高效液相制备纯化。

背景技术

[0002] 淫羊藿(Herba Epimedii)隶属小檗科(Berberridaceae)淫羊藿属，为常用中药，具有强筋骨，祛风湿，抗病毒等功效。现代药理研究发现，淫羊藿中宝霍苷I等去糖后的低分子量化合物具有比含量较高的淫羊藿苷具有更高的活性。目前市场上，宝霍苷I非常稀缺，而且价格昂贵，而对宝霍苷I的需求越来越大，因此开发宝霍苷I的制备方法是非常有意义的。根据现有的专利及文献，宝霍苷的主要制备方法有酸水解法，碱水解法以及酶水解法。酸碱水解法，方法简单，然而由于其水解环境剧烈，制备出的宝霍苷I往往活性损失较大。酶水解法主要采用β-葡萄糖苷酶，然而其活性较低，水解效率低，原材料浪费严重。

[0003] 葡聚糖酶也叫β-1，3-1，4葡聚糖酶，是一种专一作用于β-葡聚糖的1，3及1，4糖苷键的内切酶。该酶可以通过Bacillus Lichenifomis菌株经过液态深层发酵制得，制备工艺路线成熟，是一种廉价高活性的葡萄糖苷键水解酶。其活性非常高，水解淫羊藿苷为宝霍苷I的转化率最高大于98％，且通过合适的回收，酶可二次利用，第二次的转化率大于50％，充分利用了原材料，节省了成本。本文首次尝试采用葡聚糖酶作为淫羊藿苷的水解酶，将相对价廉易得的淫羊藿苷纯品，转化为学术及经济价值均较高的宝霍苷I纯品，并对其生产条件进行了优化研究。结果发现，葡聚糖酶具有很高的内切酶活性，可以高产量的转化淫羊藿苷为宝霍苷I，同时结合反相高效制备色谱技术，可以制备高纯宝霍苷I纯品。

发明内容

[0004] 本发明主要目的在于通过葡聚糖酶水解淫羊藿苷制备宝霍苷I粗品，并进一步通过反相高效制备液相纯化，制备的宝霍苷I纯品纯度大于98％。

[0005] 主要技术流程如下所示：

[0006] 1.一种宝霍苷I纯品的制备方法，其特征在于：以淫羊藿苷为原料，葡聚糖酶水解及反相高效制备色谱纯化，即可获得纯度大于98％的宝霍苷I纯品；具体步骤如下：

[0007] 1)淫羊藿苷葡聚糖酶水解获得宝霍苷I粗品：

[0008] 将1-25mg淫羊藿苷用10-100ml PH为4-7的柠檬酸缓冲溶液溶解，加入40-150ul、4-10ug/ul的葡聚糖酶水溶液，保持19-80摄氏度并搅拌3-6小时，即可将绝大部分淫羊藿苷转化为宝霍苷I；得宝霍苷I沉淀；

[0009] 宝霍苷I沉淀经水洗除去部分酶和大部分葡萄糖，进一步用-4到4摄氏度冷甲醇溶解除去残余酶和不溶沉淀，上清液浓缩干燥即可得到宝霍苷I粗品；经过处理后的宝霍苷I含量大于90％。

[0010] 2)反相高效制备液相获得宝霍苷I纯品

[0011] 宝霍苷I粗品用甲醇溶解，经0.45um微膜过滤；采用Waters DP4000高效制备系统，采用C18反相填料制备色谱柱分离纯化，优选10-20um粒径的C18硅胶键合填料，以100％-70％甲醇为洗脱剂等度洗脱，0.45um滤膜处理样品，通过微膜滤出的样品上样分析。采用紫外检测器检测，检测波长270nm，宝霍苷I在10分钟内流出，收集相应保留时间处馏分(通常为3-9分钟的馏分)，浓缩干燥后既得宝霍苷I纯品，得到的宝霍苷I含量大于98％。

[0012] 水解步骤中柠檬酸缓冲体系的PH值控制在4-7。

[0013] 宝霍苷I纯品获得采用反相高效制备色谱柱，填料优选10-20um C18键合硅胶，柱效大于等于2500。

[0014] 本发明以淫羊藿苷为原料，通过葡聚糖酶水解和高效制备系统获得目标产物宝霍苷I纯品，与传统方法相比具有以下优点：

[0015] 1)葡聚糖酶水解能力强，淫羊藿苷转化为宝霍苷I的转化率最高可达98％，且酶可二次利用，充分利用了原材料。

[0016] 2)以反相高效制备液相为手段，可以制备高纯度宝霍苷I，纯度大于98％。通过不同填料选择进行制备柱自装填，有效提高宝霍苷I的选择性。

[0017] 3)采用等度条件，分离快速，高效，而且宝霍苷出峰时间短，出峰时间在3-9分钟内。

[0018] 4)操作过程简单，无需复杂样品处理手段，适合大规模生产制备附图说明

[0019] 图1为淫羊藿苷原料的HPLC分析图(270nm)，其积分报告如下：

[0020]化合物 保留时间 峰面积 峰面积％
1 1.789 88314 0.14
2 淫羊藿苷 2.874 62085290 98.72
3 3.815 716754 1.14

[0021] 图2为淫羊藿苷经葡聚糖酶水解得到的宝霍苷I粗品的HPLC分析图(270nm)，其积分报告如下：

[0022]化合物 保留时间 峰面积 峰面积％
1 0.181 8662 0.01
2 1.337 10398 0.01
3 1.952 218012 0.31
4 2.180 155413 0.22
5 淫羊藿苷 2.854 1767417 2.51
6 3.210 91617 0.13

[0023]7 3.571 735834 1.05
8 宝霍苷I 4.565 67184530 95.52
9 7.945 164691 0.23

[0024] 图3高效制备色谱制备得到的宝霍苷I纯品的HPLC分析图(270nm)，[0025] 其积分报告如下：

[0026]化合物 保留时间 峰面积 峰面积％
1 1.617 16107 0.24
2 宝霍苷I 4.610 6807473 99.76

[0027] 注：三个谱图的分析条件：色谱柱Chromatorex(250mm×4.6mm，5um)，洗脱采用甲醇∶水(90∶10，v/v)等度洗脱。

具体实施方式

[0028] 现结合实施例和附图对本发明做进一步详细说明，实施例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。

[0029] 实施例1

[0030] 取淫羊藿苷1mg(图1)，用10ml PH 5.4的柠檬酸缓冲液溶解，加入5ug/ul的酶母液100ul，40摄氏度下水解4小时；离心得宝霍苷I沉淀。将酶解产物宝霍苷I沉淀加水洗涤并于2000r/min下离心5分钟，弃去上清液，重复洗涤、离心、弃去上清液过程三次。收集沉淀，用3ml冷甲醇(-4摄氏度)溶解，超声助溶，2000r/min下离心5分钟，收集上清，固体再次用冷甲醇溶解、超声助溶、离心、收集上清，共重复三次，合并三次上清液浓缩既得宝霍苷I粗品(图2)，转化率可达98％。

[0031] 采用Waters 600E制备系统制备宝霍苷。以体积浓度90％甲醇为流动相，制备柱填料为Varian Microsorb C18，填料粒径10μm，柱长25cm、直径1cm，采用紫外检测器检测，检测波长270nm。1mg/ml宝霍苷I粗品的甲醇溶液经0.45um微膜过滤后滤出的样品进样，进样体积0.5ml，流速控制在4ml/min，搜集4.2-4.8分钟处馏分，浓缩后既得宝霍苷I纯品，纯度大于98％(图3)

[0032] 实施例2

[0033] 取淫羊藿苷5mg，用15ml PH 7的柠檬酸缓冲液溶解，加入5ug/ul的酶母液500ul，室温下(19摄氏度左右)水解6小时；离心得宝霍苷I沉淀。将酶解产物宝霍苷I沉淀加水洗涤并于2000r/min下离心5分钟，弃去上清液，重复洗涤、离心、弃去上清液过程三次。收集沉淀，用5ml冷甲醇(4摄氏度)溶解，超声助溶，2000r/min下离心5分钟，收集上清，固体再次用冷甲醇溶解、超声助溶、离心、收集上清，共重复三次，合并三次上清液浓缩既得宝霍苷I粗品，转化率可达97％。

[0034] 采用Waters DP4000制备系统制备宝霍苷。以体积浓度70％甲醇为流动相，制备柱填料为Fuji Chromatorex C18，填料粒径10μm，柱长25cm、直径2cm，采用紫外检测器检测，检测波长270nm。1mg/ml宝霍苷I粗品的甲醇溶液经0.45um微膜过滤后滤出的样品进样，进样体积2ml，流速控制在10ml/min，搜集8.7-9.3分钟处馏分，浓缩后既得宝霍苷I纯品，纯度大于98％。

[0035] 实施例3

[0036] 取淫羊藿苷25mg，用100ml PH 4的柠檬酸缓冲液溶解，加入5ug/ul的酶母液1ml，80摄氏度下水解3小时；离心得宝霍苷I沉淀。将酶解产物宝霍苷I沉淀加水洗涤并于
2000r/min下离心5分钟，弃去上清液，重复洗涤、离心、弃去上清液过程三次。收集沉淀，用
8ml冷甲醇(-2摄氏度)溶解，超声助溶，2000r/min下离心5分钟，收集上清，固体再次用冷甲醇溶解、超声助溶、离心、收集上清，共重复三次，合并三次上清液浓缩既得宝霍苷I粗品，转化率可达97.5％。

[0037] 采用Waters DP4000制备系统制备宝霍苷。以100％甲醇为流动相，制备柱填料为Sepax C18，填料粒径15μm，柱长35cm、直径5cm，采用紫外检测器检测，检测波长270nm。1mg/ml宝霍苷I粗品的甲醇溶液经0.45um微膜过滤后滤出的样品进样，进样体积5ml，流速控制在15ml/min，搜集4.7-5.3分钟处馏分，浓缩后既得宝霍苷I纯品，纯度大于98％。