动脉粥样硬化相关的血清miRNA标志物组及其特异引物与应用

摘要

本发明涉及一种动脉粥样硬化相关的血清miRNA标志物组及其特异引物与应用，该标志物组由核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的miR－135b标志物与核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的miR－499a－3p标志物构成。本发明还涉及该miRNA标志物组的特异引物与应用。本发明提供的血清微小核糖核酸（microRNAs）标志物组筛选出的两个标志物互补性强，从而使检测定量精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性。

权利要求

1.一种与动脉粥样硬化相关的血清miRNA标志物组，该标志物组由核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的miR－135b标志物与核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的miR－499a－3p标志物构成。

2.权利要求1所述与动脉粥样硬化相关的血清miRNA标志物组的特异引物，miR－

135b标志物的特异引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；miR－499a－

3p标志物的特异引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

3.权利要求1所述与动脉粥样硬化相关的血清miRNA标志物组在制备动脉粥样硬化辅助早期诊断试剂盒中的应用。

4.权利要求2所述与动脉粥样硬化相关的血清miRNA标志物组的特异引物在制备动脉粥样硬化辅助早期诊断试剂盒中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的诊断试剂盒含有下列两种血清miRNAs组合的引物：miR－135b标志物的特异引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；miR－499a－3p标志物的特异引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，该试剂盒还包括逆转录酶、缓冲液，dNTPs，MgCl2，DEPC水和Taq酶，以及标准品和/或对照品。

说明书

动脉粥样硬化相关的血清miRNA标志物组及其特异引物与

应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种动脉粥样硬化相关的血清miRNA标志物组及其特异引物与应用，属于医学分子生物学技术领域。

背景技术

[0002] 心血管病严重危害人类健康，据WHO统计心血管病已成为全球范围第一位的死亡原因。我国心血管病的流行趋势与全球完全相符，到2006年已占全国总死亡人数的1/3,是危害城乡居民健康的头号杀手，每年主要用于心血管病的医疗费用高达1300亿人民币，心血管病已成为制约我国社会和经济发展的重要因素之一。动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是大部分心血管病的病理学基础，是心血管疾病致残致死的主要原因,目前研究的共识是动脉粥样硬化生物标记物(Biomarker)和心血管病明显相关。动脉粥样硬化是一种涉及多种病因和多种生理、生化和病理变化的慢性复杂疾病。合适的生物标记物可为心血管疾病的分子诊断提供重要的线索和依据，促进早期诊断和个体化治疗目标的实现。

[0003] 目前大部分动脉粥样硬化生物标记物是血液中特定表达的蛋白。其中传统标记物如总胆固醇和低密度脂蛋白(LDL)；C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)是近十年研究最多的动脉粥样硬化生物标记物，主要由肝细胞在感染、损伤等条件下受IL-6诱导合2+
成,在Ca 存在下CRP与受损细胞结合，激活补体系统，促进动脉粥样硬化的形成；此外单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)属于趋化因子,动物模型研究表明MCP-1具有促动脉形成作用，在动脉粥样硬化斑块中大量表达，抑制MCP-1活性可减少斑块的形成；其它如妊娠相关血浆蛋白A(pregnancy associated plasma protein A,PAPPA)是一种由合胞体滋养层合成的糖蛋白(>200kDa)，传统上用于妊娠期间Down氏综合征筛查，PAPPA可能导致完整的粥样硬化保护帽破裂，其浓度升高与动脉粥样硬化相关；
近期研究发现软骨糖蛋白YKL-40浓度水平升高也与动脉粥样硬化相关。但是上述动脉粥样硬化标记物都有一定的局限性，主要由于蛋白质翻译后修饰呈多样化、丰度相对较低。近年来外周循环血液检测到的microRNA被逐步确定具有很好的疾病分子标志物的潜能。

[0004] microRNA（微RNA，miRNA）是细胞内一类在进化上高度保守，长度约为22个核苷酸的非编码RNA的基因产物。miRNA来源于细胞内源性转录体，以单链形式存在，通过与靶mRNA的互补配对在转录后水平对基因表达进行调控，导致mRNA的降解或翻译抑制。研究表明miRNA参与包括细胞增殖、凋亡、细胞分化、发育和逆境应答等多种生物学过程，因此人体的众多生命活动和疾病的发生发展都与miRNA的变化密不可分。近年的研究进一步证实miRNA不仅在细胞内调节机体生理病理进程，而且还存在于体液中，如血清、血浆、脑脊液等。其中外周血中 存在几百种的miRNA，这些小分子RNA性质稳定、含量丰富、易于定量检测，且存在疾病特异性。许多心血管疾病以一种或几种miRNA表达异常为特征，对于疾病的早期诊断和鉴别诊断都有重要作用。近年来，研究发现来自外周血循环miRNA表达水平和一系列心血管疾病有着密不可分的关系。比如循环中心肌细胞来源的miRNAs可以作为心肌梗死的潜在生物标记物。在急性心肌梗死的实验模型和患者的血浆中，心脏特异性表达的miR-208a在急性心梗症状发生前4小时内即显著升高。对急性心梗的诊断具有较高的敏感性和特异性。Mamoru Satoh等对扩张型心肌病（DCM）病人心内膜进行活检，发现与正常人群相比，DCM患者心内膜miR-208水平显著上调，长时间随访证实miR-208水平可以有效预测临床结局，提示miR-208与DCM的发病进程相关性强。Tijsen等最初利用miRNA芯片挑选出16种在心衰患者特异表达的miRNA，而后的评价中表明miR－423可以作为心衰的生物标记物。Fukushima报道miR-126与心衰的严重程度相关，可以作为心衰的潜在生物标记物。由于miRNA的变化早于基因和蛋白的改变，也早于疾病症状的出现，由此检测外周血循环miRNA的动态变化，有可能为动脉粥样硬化的发生发展提供线索，进而可以指导临床进行早期诊断，有效控制疾病的发展。利用外周血循环miRNA作为动脉粥样硬化早期诊断分子标记物的方法比传统的特异蛋白分子检测方法将更加有效。

[0005] 然而，到目前为止，外周血循环miRNA用于动脉粥样硬化早期诊断中的应用报道非常少。如专利号201010101280.7，名称：血浆miR－208a在急性心梗诊断早期标志物中的应用。本发明公开了血浆miR－208a在急性心梗诊断早期标志物中的新用途，miRNA本身仅有18－25个核苷酸，其成熟体稳定存在于细胞浆中，因此在急性心梗后miRNA早于结构蛋白类物质（如肌钙蛋白troponin）释放进入循环血中，可在心梗早期被检测到水平的升高，作为急性心梗诊断的早期标志物。

[0006] 专利号200810040487.0，名称：动脉粥样硬化炎症相关的miRNA的筛选方法。本发明通过选择ox－LDL（30μg/ml）作为刺激因子，刺激人原代单核细胞，诱导其分化为巨噬细胞和泡沫细胞，结合microarray analysis技术，体外检测细胞miRNAs表达的差异，筛选出可能参与动脉粥样硬化炎症反应的miRNAs，最大程度筛选出贴近动脉粥样硬化特异性炎症反应病理状态的miRNA，进一步完善动脉粥样硬化的形成机制。

[0007] 专利号00807857.2，名称：动脉粥样硬化和冠心病的诊断和治疗。本发明涉及人HSP60（热激蛋白60）在人的治疗或诊断方法中的新用途，本发明涉及由于因动脉粥样硬化而患有血管疾病的患者的诊断实验试剂盒，这些患者倾向于热激蛋白诱导的补体激活。

[0008] 专利号200580024187.8，名称：动脉粥样硬化的标志物。本发明描述了一种用于动脉粥样硬化倾向和动脉粥样硬化斑块和/或血管梗阻发生易感性的诊断、判定预后或鉴别的方法，该方法包括分析标本，以测定T淋巴细胞多种亚群的百分数。

[0009] 综上所述，miRNA是细胞内一类重要的调节因子，调控许多基因的表达，与动脉粥样硬化发生发展关系密切。通过检测miRNA表达进行早期诊断比传统的蛋白或基因表达分析具有更高的准确度。然而现有动脉粥样硬化早期诊断标记物均没有针对疾病中血清miRNA表达变化的特点，不涉及本发明提供的基于疾病血清miRNA表达谱变化引出的miR－135b和miR－499a－3p组合作为动脉粥样硬化早期诊断分子标记物的应用。结合动脉粥样硬化中异常表达的血清miR－135b和miR－499a－3p组合，并研制相对应的动脉粥样硬化辅助诊断试剂盒，对我国动脉粥样硬化的诊断现状一定有良好的促进作用。

发明内容

[0010] 本发明针对现有技术的不足，提供一种动脉粥样硬化相关的血清miRNA标志物组及其特异引物与应用。

[0011] 本发明的目的之一是提供一种与动脉粥样硬化辅助早期诊断相关的血清miRNA标志物组：

[0012] 一种与动脉粥样硬化相关的血清miRNA标志物组，该标志物组由核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的miR－135b标志物与核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的miR－499a－3p标志物构成。

[0013] 本发明的第二个目的是提供血清miRNA标志物组的特异引物：

[0014] 上述与动脉粥样硬化相关的血清miRNA标志物组的特异引物，miR－135b标志物的特异引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；miR－499a－3p标志物的特异引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

[0015] 本发明的第三个目的是提供上述血清miRNA标志物及其引物在制备动脉粥样硬化早期诊断试剂盒中的应用。

[0016] 上述与动脉粥样硬化相关的血清miRNA标志物组在制备动脉粥样硬化辅助早期诊断试剂盒中的应用。

[0017] 上述与动脉粥样硬化相关的血清miRNA标志物的特异引物在制备动脉粥样硬化辅助早期诊断试剂盒中的应用。

[0018] 所述的诊断试剂盒含有下列两种血清miRNAs组合的引物：miR－135b标志物的特异引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；miR－499a－3p标志物的特异引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，该试剂盒还包括逆转录酶、缓冲液，dNTPs，MgCl2，DEPC水和Taq酶，以及标准品和/或对照品。逆转录酶、缓冲液，dNTPs，MgCl2，DEPC水和Taq酶等均为PCR反应常用的酶和试剂。

[0019] 上述试剂盒的使用过程如下：（1）血清miRNA差异表达谱分析：选择动脉粥样硬化病例和与其匹配的健康对照，检测其血清miRNA表达谱及含量，分析病例和健康对照间miRNA的共性和特性，筛选特异表达的miRNAs。（2）筛选疾病相关血清miRNAs：对已筛选的血清miRNAs进行更优化的定量分析，确定动脉粥样硬化相关miRNAs。（3）血清miRNAs筛查和诊 断试剂盒的研制：根据动脉粥样硬化相关血清miRNAs开发的miRNAs辅助诊断试剂盒，实现动脉粥样硬化早期诊断的目的。

[0020] 有益效果

[0021] 1、本发明提供的血清微小核糖核酸（microRNAs）标志物组作为动脉粥样硬化辅助早期诊断的标志物的优越性在于:miRNA本身仅有18－25个核苷酸，其成熟体稳定存在于细胞质中，因此在动脉粥样硬化中miRNA极有可能早于结构蛋白类物质释放进入循环血液系统中，检测其水平可作为动脉粥样硬化辅助早期诊断的生物标记物。

[0022] 2、本发明提供的血清微小核糖核酸（microRNAs）标志物组筛选出的两个标志物互补性强，从而使检测定量精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性。

附图说明

[0023] 图1为动脉粥样硬化患者组和正常健康对照组miRNAs表达差异，其中：深色代表高表达，浅色代表低表达；

[0024] 图2为动脉粥样硬化患者组和正常健康对照组miR－135b和miR－499a－3p表达差异；

[0025] 图3为筛选的miRNAs Real－time PCR芯片验证结果；

[0026] 图4为hsa－miR－135b和hsa－miR－499a－3p在较大样本病例组和健康组的Real－timePCR检测结果。具体实施方式：

[0027] 下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

[0028] 实施例1

[0029] 1.接受冠心病患者54例和体检正常健康对照35例，使用凝血管抽取5ml外周血，在4℃进行两步离心，最后取上层血清于RNase/DNase-free的离心管中。

[0030] 2.血清总RNA抽提：采用TRI Reagent BD从血清中抽提RNA。

[0031] （1）裂解：0.75mlTRI Reagent BD+0.25ml血清；

[0032] （2）两相分离：裂解液+0.1ml溴氯丙烷或者0.2ml氯仿；

[0033] （3）RNA沉淀：水相层+0.5ml异丙醇；

[0034] （4）清洗RNA：1ml75%乙醇；

[0035] （5）RNA溶解：用FORMAzol、水或者用枪头吹打混匀配制而成的0.5%SDS溶液溶解RNA。

[0036] 3．miRNA芯片杂交：采用Exiqon miRCURY LNATM11.0芯片，包括miBase数据库人、小鼠、大鼠三物种的全部miRNA，芯片上捕获探针均为专利的LNA探针，实现了Tm均一TM化。本研究以冠心病患者为实验组，以正常健康人为对照组，分别提取RNA。采用miRCURY TM TM
Array Power标记试剂盒，用标记酶将Hy3 或者Hy5 荧光基团标记miRNA，然后进行芯片杂交。杂交液为100μL含25%甲醛的6×SSPE缓冲液（0.90M NaCl，60mM Na2HPO4，6mM EDTA，pH6.8）。杂交后的芯 片用Axon GenePix4000B进行图像扫描，采用GenepixPro6.0软件进行数据分析，P<0.05，fold change>1.5为有显著性差异。相关芯片结果如图1和图
2所示。

[0037] 4.Real－time PCR检测

[0038] 使用美国应用生物公司的miRNA检测试剂盒（包括反转录试剂盒、特异性miRNA引物及探针、荧光定量检测试剂盒等）检测血清中10种miRNA以及参照物miRNA（hsa－miR－93）的水平，以三次结果（Ct值）的平均值作为特定miRNA的Ct值。

[0039] 5．数据的标准化处理：根据测得的样品血清中miRNA和参照miRNA（hsa－miR－93）的Ct值。以hsa－miR－93为参照，求得特定miRNA在血清中的相对含量，以PCR检测－ΔCt
中的经典的2 的方式表示血清中特定miRNA的水平（ΔCt为目标miRNA与参照has－miR－93的Ct值之差）。

[0040] 6.结果：发现10个miRNA在13例冠心病患者和5例正常对照人中表达有显著差异，如表1、表2和图3所示。

[0041] 表1.相关miRNAs的序列信息

[0042]

[0043]

[0044] 表2.相关miRNA芯片Fold－change和P值结果

[0045]

[0046] 实施例2

[0047] 利用miR－135b和miR－499a－3p的特异性引物（如表3所示），在随后的26例冠心病患者和15例正常对照的进一步检测中发现hsa－miR－135b和hsa－miR－499a－3p在动脉粥样硬化病例组和健康对照组的表达情况存在显著性差异，如图4所示。

[0048] 表3.相关miRNA的引物信息（注：GSP是对应特异引物，R是与RT引物相匹配的引物）

[0049]

[0050] 根据上述结果，通过对两组血清样品（病例组和健康对照组）的miRNAs表达水平的分析，分别以健康对照组miR－135b和miR－499a－3p表达量的90百分位数为阈值，利用miR -135b和miR-499a-3p进行分组，表达量小于90百分位数评为0分，分作健康组，表达量大于等于90百分位数评为1分，分作病例组，进而评估miR-135b、miR-499a-3p单独和组合高表达对动脉粥样硬化发病的判断能力。经实际检测结果显示(表4和表5)采用miR-135b和mir-499a-3p的组合较之单一miRNA分子能够很好地将健康组和患者组区分开。

[0051] 表4．miR-135b单独分组及表达水平得分结果

[0052]健康组(0) 患者组(1) 总数量
健康对照 14 l 15
患者组 3 12 15
总数量 17 13 30

[0053] 表5.miR-135b和miR-499a-3p联合分组及表达水平得分结果

[0054]健康组(0) 患者组(1) 患者组(2) 总数量
健康对照 14 l 0 15
患者组 1 6 8 15
总数量 15 7 8 30