副溶血性弧菌的LAMP检测试剂盒及其检测方法

摘要

本发明公开了一种副溶血性弧菌的LAMP检测试剂盒及其检测方法，具体涉及一组检测副溶血性弧菌的引物，其具有序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.6所示的寡核苷酸序列，及含有这些引物的试剂盒及其检测方法，本发明所述的试剂盒灵敏度高、特异性强、成本低、操作简便。

权利要求

1.一种副溶血性弧菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括以下物质：(1)偶联有抗副溶血性弧菌单克隆抗体的超顺磁性Fe3O4纳米粒子；

(2)LAMP反应液，其包括：序列表SEQ ID No.1所示的外侧上游引物，序列表SEQ ID No.2所示的外侧下游引物，序列表SEQ ID No.3所示的内侧上游引物，序列表SEQ ID No.4所示的内侧下游引物，序列表SEQ ID No.5所示的环状上游引物，序列表SEQ ID No.6所示的环状下游引物；

(3)Bst DNA聚合酶；

(4)阴性对照；

(5)阳性对照；

(6)显色液：SYBR Green I染料；

其中，所述偶联有抗副溶血性弧菌单克隆抗体的超顺磁性Fe3O4纳米粒子是通过下述方法制备的：(a)铁源的制备：称取0.8mmol FeCl3和8mmol的聚丙烯酸到34ml二乙二醇溶剂中，在机械搅拌的条件下，氩气气氛中将混合液加热到220℃，保持加热30min；

(b)氢氧化钠溶液的制备：称取2.0gNaOH到20mL二乙二醇溶剂中，在氩气气氛下将混合液加热到120℃，保持1h，然后将温度降低到70℃，待用；

(c)取1.75mL氢氧化钠溶液，快速注入到铁源的混合液中，然后将反应温度调节到

210℃，在机械搅拌下保持1h，然后降温到室温，得到磁性纳米粒子；

(d)以乙醇为沉淀剂对所得磁性纳米粒子进行离心清洗，最后将磁性纳米粒子分散在去离子水中，备用；

(e)取2mg步骤(d)制备的磁性纳米粒子，在1mL pH＝6.0的磷酸缓冲溶液中通过磁分离的方法对粒子进行清洗；

(f)称取1.38mg Sufo-NHS和3mg EDC到1mL2mg/mL步骤(e)的溶液中，在冰浴中震荡条件下保持30min进行表面活化，然后对混合液进行磁分离两次，洗掉过量的Sufo-NHS和EDC活化剂；

(g)将活化后的磁性纳米粒子分散到pH＝7.9的磷酸缓冲溶液中，分散液中磁性纳米粒子的浓度为2mg/mL，取100μg由CGMCC No.6061的杂交瘤细胞株分泌产生的副溶血性弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体到1mL活化的磁性纳米粒子溶液中，室温下在摇床中保 持4h，摇床转速为200r/min，最后通过磁分离进行清洗，去除未偶联到磁性粒子表面的过量的抗体；

(h)将2mg步骤(g)中清洗后的粒子分散到2mL BSA质量浓度为1％，pH＝7.4的磷酸缓冲溶液中，室温下在摇床中保持10h进行非特异性位点的封闭，摇床转速为200r/min，然后通过磁分离将所得粒子进行分离，最后分散到2mL BSA质量浓度为0.1％，pH＝7.4的磷酸缓冲溶液中保存。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述LAMP反应液还包括ThermoPol缓冲液、dNTPs和MgSO4。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述LAMP反应液中各种成分的使用终浓度为1×ThermoPol缓冲液、1.6mM dNTPs、2.0mM MgSO4、0.2μM外侧上游引物、0.2μM外侧下游引物、2.0μM内侧上游引物、2.0μM内侧下游引物、1.0μM环状上游引物、1.0μM环状下游引物。

说明书

副溶血性弧菌的LAMP检测试剂盒及其检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种副溶血性弧菌的LAMP检测试剂盒及其检测方法，属生物技术领域。

背景技术

[0002] 副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，简称Vp）是一种革兰氏阴性嗜盐菌，广泛分布于近海区域、盐湖及鱼、贝类等海产品中，是沿海地区引起食物中毒的重要病原菌，可导致患者出现腹泻、肠痉挛、恶心、呕吐、发烧等典型胃肠炎反应，严重者可引起败血症。近年来，由感染副溶血性弧菌引发的食物中毒已经成为世界范围内严重的食源性公共卫生问题之一。在日本，由该菌引起的食物中毒占全国食物中毒例数的20%～30%；我国国家食源性疾病监测网数据显示沿海省份副溶血性弧菌引起食物中毒的发生规模及人群暴露规模呈明显上升趋势，已经高居微生物食物中毒首位。为确保食品安全，保护人民身体健康，欧盟、美国等发达国家对水产品中的副溶血性弧菌做出了明确的规定。如欧盟规定副溶血
4
性弧菌不得检出，而美国规定小于l×10CFU/g。我国已将该菌列为主要的检验或监测对象。目前，该菌是多数进出口水产品必检的致病菌之一。

[0003] 目前检测食品中致病微生物的方法主要以传统方法为主，即分离鉴定方法，该方法所需时间长，一般情况下需要5～7天，有时达到10～15天，很难满足快速鉴定的需要；近几年发展起来的PCR技术，是一种快速、灵敏、特异性好的技术，但是目前该技术还是依赖于传统方法的前增菌步骤，增菌液中往往含有PCR抑制剂，从而影响PCR的扩增结果；快速的ELISA方法检测，作为筛选方法具有快速、灵敏的特点，是受到广泛欢迎的筛选方法，但是所使用的试剂盒均来自国外，价格昂贵，而且需要配备其专门的仪器。环介导等温扩增（LAMP）是继PCR技术发展起来的基于检测遗传物质DNA的一种新的扩增技术。该技术依赖于能够识别靶序列上6个特异区域的引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下可高效、快速、高特异地扩增靶序列；其特点是无需特殊的、昂贵的检测仪器，只需简单的恒温设备或者是加热块，即可完成PCR扩增，可以满足现场检测的需要。

[0004] 纳米磁珠是运用纳米技术，在传统生物学和现代分子生物技术的基础上，开展生物科学、医学等方面的研究。在分子、细胞和个体水平上为食源性致病菌检测和疾病的诊断等方面提供新材料、新技术和新方法。纳米磁珠在生物样品的分离分析中有着重要应用价值：（1）高效富集：纳米磁珠比表面积大，显著增加反应界面能够高效富集生物样品；（2）非常有效的去除核酸扩增反应中的抑制剂：以现在的检测方法，不同种的致病微生物采用不同的增菌液，增菌液中的添加剂往往对核酸扩增有较强的抑制作用，采用磁珠分离的方法可以非常有效的去除抑制剂；（3）可操作性：纳米磁珠具有超顺磁效应，外加磁场能够快速对其进行移动和分离；（4）标记性质：生物分子标记方法简单、可靠。抗体是一类重要的生物活性材料，广泛应用于检验检疫、疾病诊断、药物筛选、国防、航天、司法鉴定、食品卫生、环境监测及军事侦检等领域，已成为发展新型免疫检测技术和推动检测检疫产业快速发展的重要资源。本发明应用与抗副溶血性弧菌单克隆抗体偶联的纳米磁珠，即免疫磁珠（Immunomagnetic Beads，IMB），其具有选择性好，特异性强，能起到富集浓缩细菌的作用，有效避免或减少漏检，且可去除食品样品中抑制核酸扩增的成分。将免疫磁珠分离（Immunomagnetic separation，IMS）与LAMP技术相结合，建立IMS-LAMP检测方法，可以极大地提高检测效率。并由此开发了副溶血性弧菌IMS-LAMP检测试剂盒，具有广阔的应用前景。

发明内容

[0005] 本发明要解决的第一个技术问题是提供一组特异性强、灵敏度高的用于检测副溶血性弧菌的LAMP引物。

[0006] 本发明要解决的第二个技术问题是提供一种操作简单、结果准确的副溶血性弧菌的LAMP检测试剂盒。

[0007] 本发明要解决的第三个技术问题是提供一种副溶血性弧菌的IMS-LAMP检测方法。

[0008] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

[0009] 本发明提供了一组检测副溶血性弧菌的引物，该组引物是依据NCBI收录号M36437对应的基因序列设计的，由序列表SEQ ID No.1至序列表SEQ ID No.6所示碱基序列的寡核苷酸组成；其中SEQ ID No.1为外侧上游引物，SEQ ID No.2为外侧下游引物，SEQ ID No.3为内侧上游引物，SEQ ID No.4为内侧下游引物，SEQ ID No.5为环状上游引物，SEQ ID No.6为环状下游引物。详见表1。

[0010] 表1引物序列

[0011]

[0012] 本发明所提供的引物具有以下优点：（1）高效灵敏。近年来的研究显示引入环状引物将有助于提高检测灵敏度，缩短反应时间。（2）特异性强。

[0013] 本发明提供了一种副溶血性弧菌的LAMP检测试剂盒，其包括以下物质：

[0014] （1）偶联有抗副溶血性弧菌单克隆抗体的免疫磁珠；

[0015] 其中，抗副溶血性弧菌单克隆抗体可以是现有技术中已经公开的抗副溶血性弧菌单克隆抗体，优选地该单克隆抗体是由保藏编号为CGMCC No.6061的杂交瘤细胞株分泌产生的副溶血性弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体，具体信息及获得方法见中国发明专利申请CN102659942A中的内容。通过使用偶联有抗副溶血性弧菌单克隆抗体的免疫磁珠，可有效富集待检样品中的副溶血性弧菌，提高检测的特异性和灵敏度。

[0016] （2）LAMP反应液，其包括序列表SEQ ID No.1所示的外侧上游引物（F3），序列表SEQ ID No.2所示的外侧下游引物（B3），序列表SEQ ID No.3所示的内侧上游引物（FIP），序列表SEQ ID No.4所示的内侧下游引物（BIP），序列表SEQ ID No.5所示的环状上游引物（LF），序列表SEQ ID No.6所示的环状下游引物（LB）；所述引物均委托大连宝生物工程有限公司合成；

[0017] （3）Bst DNA聚合酶：8U/μL，购自NEB公司；

[0018] （4）阴性对照：DEPC水；

[0019] （5）阳性对照：由副溶血性弧菌标准菌株ATCC17802提取的核酸作为阳性对照，采用细菌基因组DNA提取试剂盒并按其操作说明提取1mL样品基因组DNA，核酸浓度约为80ug/ml；

[0020] （6）显色液：SYBR Green I染料，购自Invitrogen公司。

[0021] 进一步地，上述LAMP反应液还包括ThermoPol缓冲液、dNTPs和MgSO4；其中ThermoPol缓 冲 液，购 自NEB公 司，1×ThermoPol缓 冲 液 含 0.1%TritonX-100、10mM(NH4)2SO4、10mM KCl、20mM Tris-HCl(pH8.8)；dNTPs：购自天根。

[0022] 本发明还提供了一种副溶血性弧菌的检测方法，该方法包括以下步骤：

[0023] （1）免疫磁珠富集菌体：取1.5mL免疫磁珠于离心管中，置于磁分离架吸附1min后，弃上清，免疫磁珠用30μL PBS重悬；取1mL待检样品或菌悬液加入免疫磁珠悬液中，颠倒混匀使磁珠处于悬浮状态；30min后，磁分离架吸附磁珠1min以富集菌体，弃上清，免疫磁珠用PBS洗涤两次，每次30s，最后用50μL DEPC水重悬磁珠，获得富集后的菌体样品；

[0024] 其中，10×PBS缓冲溶液为：NaCl80g，NaHPO4×12H2O29g，KCl2g，KH2PO42g，先溶于900ml去离子水，待充分溶解后再加去离子水至1000ml，室温保存，使用时进行1:10稀释。

[0025] （2）提取步骤（1）获得的菌体样品的DNA，即模板DNA，可以利用现有技术中已知的方法或试剂盒提取，例如细菌基因组DNA提取试剂盒或等效试剂盒，或者煮沸方法提取样品基因组DNA；

[0026] （3）进行LAMP反应，该LAMP反应体系见下表：

[0027] 表2LAMP反应体系

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[0030] （4）反应条件：65℃恒温反应60min，85℃加热2min使酶失活，反应即结束；

[0031] （5）结果判定：

[0032] 颜色变化：向反应终体系加入1μL显色液即SYBR GreenⅠ荧光染料，阳性反应呈荧光绿色，而阴性反应则保持SYBR GreenⅠ染料的荧光橙色。

[0033] 电泳检测：LAMP法的扩增产物是各种不同长度的茎—环状结构DNA，因此阳性反应通过1.5%琼脂糖电泳检测呈梯形条带，而阴性反应则没有梯形扩增条带出现。

[0034] 本发明的优点是：

[0035] 本发明应用与抗副溶血性弧菌单克隆抗体偶联的免疫磁珠，具有选择性好，特异性强，能起到富集浓缩细菌的作用，有效避免或减少漏检，且可去除食品样品中抑制核酸扩增的成分。本发明设计6条引物对靶序列的6个特异序列区的识别，保证了LAMP扩增的高度特异性。即LAMP能从仅相差1个核苷酸的基因标本中，找出相应的靶序列进行扩增。并且本发明在等温条件下扩增，不会因温度改变而造成时间的损失，而且受非靶序列的影响小。同时耗时短，在1h内可将靶序列扩增至109倍。

[0036] 下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明作进一步说明，凡依照本发明公开内容所做的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。

附图说明

[0037] 图1IMS-LAMP检测特异性图；（其中M：分子量标准，DL2000；1副溶血性弧菌核酸扩增结果；2溶藻弧菌核酸扩增结果；3创伤弧菌核酸扩增结果；4河流弧菌核酸扩增结果；5费尼斯弧菌核酸扩增结果；6解蛋白弧菌核酸扩增结果；7单增李斯特氏菌核酸扩增结果；
8阴沟肠杆菌核酸扩增结果；9金黄色葡萄球菌核酸扩增结果；10甲型副伤寒沙门氏菌核酸扩增结果；11大肠杆菌核酸扩增结果；12肠炎沙门氏菌核酸扩增结果；13福氏志贺氏菌核酸扩增结果；14鼠伤寒沙门氏菌核酸扩增结果；15阪崎肠杆菌核酸扩增结果；16粪肠球菌核酸扩增结果；NC为阴性对照。）

[0038] 图2IMS-LAMP检测灵敏度图；（其中M：分子量标准，DL2000；PC：副溶血性弧菌阳性对照；-1～-7：副溶血性弧菌阳性对照倍比稀释后扩增结果；NC为阴性对照。）[0039] 图3IMS-LAMP检测基质添加实验图；（其中M：分子量标准，DL2000；PC：副溶血性弧菌阳性对照；2h～12h：相应时间增菌后检测结果；NC为阴性对照。）

具体实施方式

[0040] 下面结合具体实施例，进—步阐述本发明。但这些实施例仅限于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。

[0041] 以下实施例中的实验方法如无特别说明均为常规方法。

[0042] 以下实施例中所用材料、试剂等如无特别说明均可从商业途径得到。

[0043] 实施例1：偶联有抗副溶血性弧菌单克隆抗体的免疫磁珠的制备

[0044] 抗副溶血性弧菌单克隆抗体的获得

[0045] 本发明可以使用现有技术中已经公开的抗副溶血性弧菌单克隆抗体，为了达到更好的检测效果，优选地，本发明使用由保藏编号为CGMCC No.6061的杂交瘤细胞株分泌产生的副溶血性弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体，该单克隆抗体的具体信息及获得方法见中国发明专利申请CN102659942A中的内容。

[0046] 偶联有该抗副溶血性弧菌单克隆抗体的免疫磁珠的制备

[0047] 1.纳米磁珠的制备

[0048] 本发明所述的免疫磁珠的制备方法包括纳米超顺磁性Fe3O4的制备及其特异性抗体的表面修饰，具体在此提供一种优选的制备方法：

[0049] 2.聚丙烯酸稳定的超顺磁性Fe3O4的制备

[0050] （1）铁源的制备：准确称取0.8mmol FeCl3和8mmol的聚丙烯酸（Mw=～1800）到34ml二乙二醇溶剂中，在快速机械搅拌的条件下，氩气气氛中将混合液加热到220℃，保持加热30min.

[0051] （2）氢氧化钠溶液的制备：准确称取2.0gNaOH到20mL二乙二醇溶剂中，在氩气气氛下将混合液加热到120℃，保持1h，然后将温度降低到70℃，待用。

[0052] （3）取1.75mL氢氧化钠溶液，快速注入到铁源的混合液中，然后将反应温度调节到210℃，在快速的机械搅拌下保持1h，然后降温到室温，对样品进行清洗。

[0053] （4）样品清洗：以乙醇为沉淀剂（体积比2:1）对所得样品进行离心清洗（10000r/min），重复清洗三次，最后将样品分散在去离子水中。

[0054] 3.特异性抗体的修饰

[0055] 抗体的修饰包括磁性粒子表面的活化，特异性抗体的偶联修饰及非特异性位点的BSA封闭。

[0056] （1）磁性粒子的表面活化：取2mg所制备的磁性纳米粒子，在1mL PH=6.0的磷酸缓冲溶液中通过磁分离的方法对粒子进行清洗两次。

[0057] （2）准确称取1.38mg Sufo-NHS和3mg EDC到1mL2mg/mL磁性纳米粒子分散液中，在冰浴中震荡条件下保持30min进行表面活化。然后对混合液进行磁分离两次，洗掉过量的Sufo-NHS和EDC活化剂。

[0058] （3）将活化后的磁性纳米粒子分散到pH=7.9的磷酸缓冲溶液中，分散液中磁性纳米粒子的浓度为2mg/mL。取100μg特异性抗体到1mL活化的磁性纳米粒子溶液中，室温下在摇床(200r/min)中保持4h，最后通过磁分离进行清洗，去除未偶联到磁性粒子表面的过量的特异性抗体。

[0059] （4）将2mg步骤3中清洗后的粒子分散到2mL BSA质量浓度为1%的磷酸缓冲溶液中（pH=7.4），室温下在摇床(200r/min)中保持10h进行非特异性位点的封闭，然后通过磁分离将所得粒子进行分离，最后分散到2mL BSA质量浓度为0.1%的磷酸缓冲溶液中（pH=7.4）保存。

[0060] （5）所得免疫磁珠的粒径在90nm左右，饱和磁化强度可以达到64emu/g，超顺磁性能好，磁响应性强，分散稳定性好，生物免疫活性高。

[0061] 实施例2：副溶血性弧菌的LAMP检测试剂盒的组成

[0062] （1）偶联有抗副溶血性弧菌单克隆抗体的免疫磁珠；例如实施例1中制备的免疫磁珠；

[0063] （2）LAMP反应液，其包括序列表SEQ ID No.1所示的外侧上游引物（F3），序列表SEQ ID No.2所示的外侧下游引物（B3），序列表SEQ ID No.3所示的内侧上游引物（FIP），序列表SEQ ID No.4所示的内侧下游引物（BIP），序列表SEQ ID No.5所示的环状上游引物（LF），序列表SEQ ID No.6所示的环状下游引物（LB）；所述引物均委托大连宝生物工程有限公司合成；

[0064] 进一步地，所述LAMP反应液还包括ThermoPol缓冲液、dNTPs和MgSO4；其中ThermoPol缓 冲 液，购 自NEB公 司，1×ThermoPol缓 冲 液 含 0.1%TritonX-100、10mM(NH4)2SO4、10mM KCl、20mM Tris-HCl(pH8.8)；dNTPs：购自天根；

[0065] （3）Bst DNA聚合酶：8U/μL，购自NEB公司；

[0066] （4）阴性对照：DEPC水；

[0067] （5）阳性对照：由副溶血性弧菌标准菌株ATCC17802提取的核酸作为阳性对照，采用细菌基因组DNA提取试剂盒并按其操作说明提取1mL样品基因组DNA，核酸浓度约为80ug/ml；

[0068] （6）显色液：SYBR Green I染料，购自Invitrogen公司。

[0069] 实施例3：检测副溶血性弧菌试剂盒的特异性和灵敏性试验

[0070] 1.检测特异性分析

[0071] 对表3中所列菌株分别进行IMS-LAMP检测，结果显示副溶血性弧菌标准菌株的扩增产物经SYBR GreenⅠ染色显荧光绿色，经琼脂糖凝胶电泳检测则出现典型的梯状扩增带；而其余菌株均无特异性扩增（见图1），无任何假阳性和假阴性结果出现，说明该方法检测副溶血性弧菌具有良好的特异性。

[0072] 表3实验用菌株列表

[0073]序号 菌株名称 编号
1 副溶血性弧菌 ATCC17802
2 溶藻弧菌 ATCC1833
3 创伤弧菌 ATCC1758
4 河流弧菌 ATCC1.1611
5 费尼斯弧菌 ATCC1.1612
6 解蛋白弧菌 ATCC1.1826
7 单增李斯特氏菌 ATCC15313
8 阴沟肠杆菌 CGMCC1.57
9 金黄色葡萄球菌 ATCC25923
10 甲型副伤寒沙门氏菌 CMCC50001
11 大肠杆菌 ATCC25912
12 肠炎沙门氏菌 CMCC50041
13 福氏志贺氏菌 CMCC51571
14 鼠伤寒沙门氏菌 CMCC50115
15 阪崎肠杆菌 ATCC29544
16 粪肠球菌 CGMCC1.2135

[0074] 2.检测灵敏度分析

[0075] 对副溶血性弧菌标准菌株ATCC17802的菌悬液进行10倍梯度稀释，分别取1mL各梯度稀释液进行IMS-LAMP检测。结果发现LAMP可检测到-5稀释度（图2），相应的副溶血2 2
性弧菌菌体浓度为6.8×10CFU/mL，即该检测方法的灵敏度为6.8×10CFU/mL。

[0076] IMS-LAMP检测方法如上所述。

[0077] 实施例4：检测副溶血性弧菌试剂盒的食品基质添加实验

[0078] （1）副溶血性弧菌标准菌株ATCC17802菌悬液用梯度稀释并平板计数，取浓度为0～10CFU/mL的菌悬液做低浓度添加实验。

[0079] （2）取经传统方法（GB4789.7）验证无副溶血性弧菌的扇贝25g，加入装有225mL碱性蛋白胨水（APW）的广口瓶中（已灭菌），加入1mL添加浓度为0～10CFU/mL的菌悬液。充分混匀后，置于36℃培养。

[0080] （3）分别于2h、4h、6h、8h、10h、12h取1mL培养液进行IMS-LAMP检测，IMS-LAMP检测方法如上所述。

[0081] 经计数，用于添加实验的菌悬液浓度为1CFU/mL，表明食品基质添加实验的添加浓度为1CFU/25g样品。增菌8h后取样，可用IMS-LAMP检测方法检出副溶血性弧菌（图3）。

[0082] 结果表明本发明所述的检测副溶血性弧菌IMS-LAMP试剂盒在食品样品的检测中，灵敏度可达1CFU/25g样品。

[0083] 显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。