一种绿臭蛙抗菌肽odorranain-H-OM1及其编码序列的基因与应用

摘要

本发明公开了一种绿臭蛙抗菌肽odorranain-H-OM1，它是具有序列表中SEQIDNO：1所示的氨基酸序列的蛋白，或者是将SEQIDNO：2的氨基酸残基序列经过一个以上氨基酸残基的取代、缺失或添加，且具有与SEQIDNO：2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQIDNO：2衍生的蛋白质。本发明克隆得到绿臭蛙抗菌肽odorranain-H-OM1的编码基因，并利用化学合成的方法合成了odorranain-H-OM1。该抗菌肽分子量小，对奇异变形杆菌、屎肠球菌和耐氨苄青霉素大肠杆菌、光滑念珠菌具有强的杀灭作用。此外还具有低的溶血活性。

权利要求

1.一种绿臭蛙抗菌肽odorranain-H-OM1，其特征在于：它为序列表中SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的蛋白，该绿臭蛙抗菌肽odorranain-H-OM1为环状多肽，含有21个氨基酸残基，分子量为2044.58 Da，等电点为8.90。

2.一种如权利要求1所述的绿臭蛙抗菌肽odorranain-H-OM1的编码基因，其特征在于：它是下列核苷酸之一：（1）编码序列表中SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多核苷酸。

3.根据权利要求2所述的绿臭蛙抗菌肽odorranain-H-OM1的编码基因，其特征在于：绿臭蛙抗菌肽odorranain-H-OM1的编码基是序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

4.一种如权利要求1所述的绿臭蛙抗菌肽odorranain-H-OM1在制备抗微生物药物中的应用，其特征在于：所述的微生物为奇异变形杆菌、屎肠球菌、耐药菌株大肠杆菌或耐药菌株光滑念珠菌。

说明书

一种绿臭蛙抗菌肽odorranain-H-OM1及其编码序列的基

因与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及分子遗传学领域，尤其是一种绿臭蛙抗菌肽及编码序列的基因与应用。

背景技术

[0002] 随着青霉素等传统抗生素的大规模和不恰当使用，微生物对传统抗生素产生了越来越强的耐受性，在临床上已经出现了大量能够完全耐受青霉素等传统抗生素的微生物，已有的抗生素对这些病原微生物无能为力。抗菌肽是一种新型的抗微生物多肽，大多数抗菌肽分子量小于10000 Da，带正电，富含疏水碱基，能够形成两亲性的结构。抗菌肽的杀菌机制主要是通过静电相互作用吸引并结合到带负电的细菌细胞膜表面，进一步在细菌细胞膜上形成跨膜的孔洞，导致细菌细胞内容物的外泄，从而导致细菌细胞的死亡。而传统抗生素主要是作用于细菌细胞内的一些酶类。正是由于作用方式的不同，抗菌肽介导的杀菌作用远远快于传统抗生素，并且不易使细菌产生耐受性。除此之外，越来越多的文献报道表明抗菌肽还具有其他的杀菌机制，如抑制细菌细胞壁合成、改变细菌细胞质膜抑制隔膜形成、激活自溶素、抑制细胞内酶活性、抑制DNA、RNA和蛋白质的合成等。

[0003] 两栖动物皮肤抗菌肽具有高效、广谱、不易产生耐药性等特点。这使其在耐抗生素病原菌株大量涌现的今天有望成为新一代的临床抗菌药物。抗菌肽可以识别革兰氏阴性菌脂多糖、革兰氏阳性菌胞壁酸和细菌未甲基化CpG DNA等细菌信号分子，并因为其特殊的氨基酸结构、两亲性、阳离子特性及小分子特征等，可以较为容易粘附磷脂双分子层，并以“桶-板模式”、“覆毯模式”、“胶束模式”等方式插入细菌的细胞膜，从而在细胞膜上形成穿膜孔道，引起胞内物质外漏，最终导致菌体的死亡。研究表明，两栖类皮肤抗菌肽odorranain-H家族对金黄色葡萄球菌等细菌有一定得抑制效果，可通过多种不同的机制发挥作用，如有的在细菌内形成片层样的囊泡状结构，有些可能导致细胞质壁的分离，有些在细菌的膜上形成穿孔，有些则导致了细菌染色质的固缩。因此，在医药领域和食品防腐具有一定的开发前景。

[0004] 两栖类动物作为水生和陆生动物的中间类群，其生活环境恶劣，容易滋生各种病原微生物。为了避免微生物感染，两栖类动物进化出强大的先天免疫系统，用以抵抗病原微生物的侵袭。其中抗菌肽是两栖类动物先天免疫系统中的重要组分，在两栖类动物抵御外界微生物侵袭过程中发挥了重要的作用。到目前为止，已从各种两栖类动物中发现大量抗菌肽，这些抗菌肽具有不同的结构和抗菌活性，是新型多肽类抗微生物药物开发的优良模板库。目前，国外对多种两栖类抗菌肽进行了研究开发，已有多种进入临床试验阶段。如来源于非洲爪蟾抗菌肽magainin的改造体MSI-78对糖尿病患者的足部溃疡有显著疗效且副作用小，已进入临床Ⅲ期试验阶段。

[0005] 绿臭蛙（Rana margaratae)属于两栖纲无尾目蛙科臭蛙属。目前关于绿臭蛙形态、发育和分子进化已有报道，但是关于绿臭蛙抗菌肽的研究还没有报道。

发明内容

[0006] 技术要求

[0007] 本发明所要解决的技术问题是提供一种绿臭蛙抗菌肽odorranain-H-OM1。

[0008] 本发明还要解决的技术问题是提供上述蛋白的编码序列。

[0009] 本发明还要解决的技术问题是提供上述蛋白在制备抗氧化药物或化妆品添加剂的应用。

[0010] 本发明是这样实现的：一种绿臭蛙抗菌肽odorranain-H-OM1，它是具有序列表中SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的蛋白，或者是将SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列经过一个以上氨基酸残基的取代、缺失或添加，且具有与SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID NO：2衍生的蛋白质。

[0011] 所述的绿臭蛙抗菌肽odorranain-H-OM1具有序列表中SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；该绿臭蛙抗菌肽odorranain-H-OM1为环状多肽，含有21个氨基酸残基，分子量为2044.58Da，等电点为8.90。

[0012] 绿臭蛙抗菌肽odorranain-H-OM1的编码基因，它是下列核苷酸之一：

[0013] （1）序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；

[0014] （2）编码序列表中SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多核苷酸；

[0015] （3）在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO：1限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

[0016] 绿臭蛙抗菌肽odorranain-H-OM1的编码基是序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

[0017] 绿臭蛙抗菌肽odorranain-H-OM1在制备抗微生物药物中的应用。

[0018] 有益效果

[0019] 本发明克隆得到绿臭蛙抗菌肽odorranain-H-OM1的编码基因，并利用化学合成的方法合成了odorranain-H-OM1。该抗菌肽分子量小，对奇异变形杆菌、屎肠球菌和耐氨苄青霉素大肠杆菌、光滑念珠菌具有强的杀灭作用。此外还具有低的溶血活性。

具体实施方式

[0020] 根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

[0021] 本发明的实施例1：绿臭蛙抗菌肽odorranain-H-OM1基因克隆。

[0022] 1）绿臭蛙皮肤总RNA提取：

[0023] ①取300 mg绿臭蛙皮肤组织，放入研钵中加入液氮研磨成粉末，转移到EP管中，加入1 m1总RNA提取缓冲液( Trizol，美国Invitrogen公司产品 )，充分混匀，而后于4℃，12000 rpm离心10 min。

[0024] ②离心取上清，加入0.2 ml氯仿溶液，剧烈混匀，室温放置10分钟，而后以4℃，12000 rpm离心10分钟，弃除沉淀。

[0025] ③上清加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟，以4℃，12000 rpm离心10分钟，收集沉淀用75%（V/V）乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为绿臭蛙皮肤总RNA。

[0026] 2）绿臭蛙皮肤cDNA文库构建：采用CLONTECH公司In-Fusion SMARTer TM Directional cDNA Library Construction Kit。

[0027] （1）cDNA第一链合成( mRNA 反转录 )：

[0028] ①经DEPC处理（DEPC处理是在含0.1% （V/V） DEPC的水浸泡过夜，高压灭菌，烘干）的离心管中加入1 μl 绿臭蛙皮肤总RNA、1 μl 3’端一链合成引物（3’In-Fusion SMARTer CDS Primer）和2.5 μl 经DEPC处理（DEPC处理是将含0.1%（V/V） DEPC的水，放置过夜，高压灭菌）的水使总体积达到 4.5 μl，混匀后短暂离心（2000 rpm，30 s），离心后于72℃保温3分钟；保温后再将离心管在42℃孵育2分钟。

[0029] ②在上述离心管中加入以下试剂（均为CLONTECH公司In-Fusion SMARTer TMDirectional cDNA Library Construction Kit建库试剂盒中配备），2.0 μl 5×第一链缓冲液、0.25 μl 100 mM DTT、1.0 μl 10 mM dNTP Mix、1.0 μl SMARTer V Oligonucleotide、0.25 μl RNase Inhibitor 和 1.0 μl SMARTScribe Reverse Transcriptase反转录酶，混合离心管中试剂并短暂离心（2000 rpm，30 s），在42℃ 保温
90 min，然后68℃保温10 min。保温处理后将离心管置于冰上中止第一链的合成。从离心管取2 μl所合成的cDNA第一链备用。

[0030] （2）采用长末端聚合酶链式反应(LD- PCR)方法扩增第二链（所用试剂均为TMCLONTECH公司In-Fusion SMARTer Directional cDNA Library Construction Kit建库试剂盒中配备）

[0031] ① 将2 μl cDNA 第 一 链（mRNA 反 转 录）、80 μl 去 离 子 水、10 μl10×Advantage 2 PCR 缓冲液、2 μl 50×dNTP 混合物、2 μl 5’PCR引物、2 μl CDS /3’ PCR引物以及2 μl 50×Advantage 2 Polymerase Mix在95℃预热的PCR管中进行混合。

[0032] ②在PCR仪中按以下程序扩增：

[0033] 95℃，1 min；18个循环：95℃，15 sec，65℃，30 sec，68℃，6 min。循环结束后，将离心管中合成的 cDNA 双链－80℃保存。

[0034] （3）绿臭蛙抗菌肽odorranain-H-OM1基因克隆筛选：

[0035] 根据蛙科抗菌肽信号肽区保守序列设计正向引物进行PCR扩增，其序列为5’-CCAAAGATGTTCACCTTGAAG-3’，PCR另一扩增引物为CLONTECH 公司In-Fusion TMSMARTer Directional cDNA Library Construction Kit中的3’-PCR引物，其序列为
5’-CGGGGTACGATGAGACACCAT-3’。PCR反应在如下条件下进行：94 ℃ 4 min，94 ℃ 30 sec，
57℃ 30 sec和72 ℃ 1 min，30个循环。扩增完成后用胶回收试剂盒（天根生物）进行目的片段回收。将回收的目的片段连接到pMD19-T载体 (Takara, 大连)，转化进CaCl2-MgCl2法制备好的DH5α感受态细胞。涂板并进行氨苄青霉素和蓝白斑双重筛选，挑取单菌落用M13引物PCR检测插入片段大小。挑取阳性菌落，摇菌提取质粒，使用Applied Biosystems DNA sequencer, model ABI PRISM 377进行核苷酸测序。

[0036] 测定结果：

[0037] 编码绿臭蛙抗菌肽odorranain-H-OM1前体的基因自5’端至3’端序列SEQ ID No：1所示。

[0038] 绿臭蛙抗菌肽odorranain-H-OM1基因核苷酸的序列表为：序列长度为317个碱基，序列类型：核酸，链数：单链，拓扑学：直链状，序列种类：cDNA，来源： 绿臭蛙皮肤。

[0039] 实施例2：绿臭蛙抗菌肽odorranain-H-OM1的化学合成。

[0040] Ⅰ、绿臭蛙抗菌肽odorranain-H-OM1的化学合成方法：根据基因推导的成熟肽氨基酸序列，用自动多肽合成仪(433A, Applied Biosystems)合成其全序列，通过HPLC反相柱层析脱盐。

[0041] Ⅱ、分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）。

[0042] Ⅲ、纯化的绿臭蛙抗菌肽odorranain-H-OM1用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF），等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。

[0043] 绿臭蛙抗菌肽odorranain-H-OM1是绿臭蛙抗菌肽odorranain-H-OM1基因编码的一种环状多肽，含有二十一个氨基酸残基，分子量2044.58Da，等电点8.90。

[0044] 绿臭蛙抗菌肽odorranain-H-OM1全序列如SEQ ID No：2所示。实施例3：绿臭蛙抗菌肽odorranain-H-OM1药理实验：

[0045] 1、绿臭蛙抗菌肽odorranain-H-OM1抗菌活性检测：

[0046] 分别挑取保存于斜面上的试验菌株（奇异变形杆菌、屎肠球菌、耐氨苄青霉素大肠杆菌和耐氨苄青霉素光滑念珠菌）均匀涂布于LB固体培养基（购自青岛海博生物技术有限公司）平板上，将经过灭菌的0.5 cm直径的滤纸片置于培养基表面，滴加溶解于灭菌去离子水的2 mg/ml的绿臭蛙抗菌肽odorranain-H-OM1样品溶液10 µl，于37℃倒置培养18－20小时，观察抑菌圈形成与否。若样品具有抗菌活性，则会在滤纸片周围形成清晰透明的抑菌圈，抑菌圈越大表明样品抗菌活性越强。

[0047] 2、绿臭蛙抗菌肽odorranain-H-OM1最小抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration）测定：

[0048] 试验菌株（奇异变形杆菌、屎肠球菌、耐氨苄青霉素大肠杆菌和耐氨苄青霉素光滑念珠菌）接种到LB液体培养基（青岛海博生物技术有限公司）中，37℃振荡培养到对数生长5
期，而后用新鲜LB液体培养基将培养至对数生长期的培养液稀释到2×10 cfu/ml待用。

[0049] 取1.9 mL上述稀释的细菌培养液，加入经0.22μm孔径膜过滤的2 mg/ml的绿臭蛙抗菌肽odorranain-H-OM1样品溶液0.1 mL作为第一管,第一管混匀后取出1 mL加入第2管中，依次倍比稀释（参见表1），自第9管吸出1 mL弃去，第10管系对照管。

[0050] 表1稀释方法

[0051]

[0052] 将上述各管混匀后放置37℃缓慢振荡培养18小时，于600 nm波长处测定光吸收。最小抑菌浓度为看不见细菌生长的最低样品浓度。结果如表2所示。

[0053] 由表2可见，绿臭蛙抗菌肽odorranain-H-OM1对奇异变形杆菌、屎肠球菌、耐药菌株大肠杆菌和耐药菌株光滑念珠菌具有较强的抗菌活性。表明其在奇异变形杆菌、屎肠球菌、大肠杆菌和光滑念珠菌感染的治疗方面具有一定应用潜力。

[0054] 表2绿臭蛙抗菌肽odorranain-H-OM1抗菌活性

[0055]

[0056] MIC：最小抑菌浓度，以上结果为三次独立重复实验平均值。

[0057] 3、绿臭蛙抗菌肽odorranain-H-OM1溶血活性测定：

[0058] 将采集的健康人血与阿氏液混合抗凝，生理盐水洗涤2次并重悬成107-108 cell/ml的悬浮液。上述稀释好的红细胞悬液与溶解于生理盐水的不同浓度的绿臭蛙抗菌肽odorranain-H-OM1样品混合，37℃保温30 min，再于1000 rpm离心5 min，上清液于540 nm测吸收值。阴性对照使用生理盐水，阳性对照使用Triton X-100，溶血百分比按以下公式计算：溶血百分比H%=A样品-A阴性对照/A阳性对照×100%。结果表明样品浓度为100 µg/ml时，odorranain-H-OM1的溶血百分比为6.08%，说明odorranain-H-OM1具有极低的溶血活性，不会引起人体红细胞破裂溶解而对人体产生伤害，因此十分利于其在医药领域进一步的开发应用。

[0059] 本发明涉及的序列及记号分列如下：

[0060] (1) SEQ ID NO. 1的信息

[0061] (i)序列特征：

[0062] (A)长度：317bp

[0063] (B)类型：核苷酸

[0064] (C)链性：单链

[0065] (D)拓扑结构：直链状

[0066] (ii)分子类型：核苷酸

[0067] (iii)序列描述：SEQ ID NO.：1

[0068] (2) SEQ ID NO. 2的信息

[0069] (i)序列特征：

[0070] (A)长度：21 a.a

[0071] (B)类型：氨基酸

[0072] (C)链性：单链

[0073] (D)拓扑结构：直链状

[0074] (ii)分子类型：蛋白质

[0075] (iii)序列描述：SEQ ID NO.：2

[0076] (3) SEQ ID NO. 3的信息

[0077] (i)序列特征：

[0078] (A)长度：21bp

[0079] (B)类型：核苷酸

[0080] (C)链性：单链

[0081] (D)拓扑结构：直链状

[0082] (ii)分子类型：核苷酸

[0083] (iii)序列描述：SEQ ID NO.3

[0084] (4) SEQ ID NO. 4的信息

[0085] (i)序列特征：

[0086] (A)长度：21bp

[0087] (B)类型：核苷酸

[0088] (C)链性：单链

[0089] (D)拓扑结构：直链状

[0090] (ii)分子类型：核苷酸

[0091] (iii)序列描述：SEQ ID NO.4。