抗-系统ASC氨基酸转运蛋白2(ASCT2)抗体

摘要

本发明公开了单克隆抗体或其抗体片段，所述单克隆抗体特异性识别ASC氨基酸转运蛋白2系统(ASCT2)的细胞外区域的天然结构并与该细胞外区域结合；能够产生所述抗体的杂交瘤；编码所述抗体的DNA；携带所述DNA的载体；通过导入所述载体产生的转化体；利用所述杂交瘤或转化体生产抗体或其抗体片段的方法；和包含所述抗体或其抗体片段的治疗药，以及包含所述抗体或其抗体片段的诊断试剂。

权利要求

1.单克隆抗体或其抗体片段，其特异性识别系统ASC氨基酸转运蛋白2的细胞外区域的天然三维结构并与该细胞外区域结合，其中：抗体的VH的CDR1、CDR2和CDR3分别由SEQ ID NO:32、33和34表示的氨基酸序列组成，和抗体的VL的CDR1、CDR2和CDR3分别由SEQ ID NO:35、36和37表示的氨基酸序列组成,其中所述抗体片段是选自Fab、Fab'、F(ab')2、单链抗体scFv、二聚体化V区双抗体、二硫键稳定的V区dsFv和包含CDR的肽的抗体片段。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗体片段，其抑制通过系统ASC氨基酸转运蛋白2细胞内摄取氨基酸。

3.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体或其抗体片段，其具有细胞毒性。

4.根据权利要求3所述的单克隆抗体或其抗体片段，其中所述细胞毒性是抗体依赖性细胞毒性ADCC活性或补体依赖性细胞毒性CDC活性。

5.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体或其抗体片段，其与人类系统ASC氨基酸转运蛋白2结合而不与小鼠系统ASC氨基酸转运蛋白2结合。

6.根据权利要求5所述的单克隆抗体或其抗体片段，其与人类系统ASC氨基酸转运蛋白2的至少EL2区域结合。

7.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗体片段，其中所述单克隆抗体是与被选自保藏号为FERM BP-10963的杂交瘤KM4012产生的单克隆抗体所识别的表位结合的单克隆抗体。

8.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗体片段，其中所述单克隆抗体是由选自保藏号为FERM BP-10963的杂交瘤KM4012产生的单克隆抗体。

9.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗体片段，其中所述单克隆抗体是重组抗体。

10.根据权利要求9所述的重组抗体或其抗体片段，其中所述重组抗体是选自人嵌合抗体、人源化抗体和人类抗体的重组抗体。

11.根据权利要求9所述的重组抗体或其抗体片段，其包括权利要求1至8任一项所述的单克隆抗体的重链可变区VH和轻链可变区VL的互补决定区CDR。

12.根据权利要求10所述的人嵌合抗体或其抗体片段，其包含权利要求l至7任一项所述的单克隆抗体的VH和VL。

13.根据权利要求12所述的人嵌合抗体或其抗体片段，其选自其中抗体的VH由SEQ ID NO:23表示的氨基酸序列组成和抗体的VL由SEQ ID NO:25表示的氨基酸序列组成的人嵌合抗体。

14.保藏号为FERM BP-10963的杂交瘤KM4012。

15.DNA，其编码权利要求1至13任一项所述的抗体或其抗体片段。

16.重组载体，其包含权利要求15所述的DNA。

17.转化体，其能通过将权利要求16所述的重组载体导入宿主细胞获得。

18.生产权利要求1至13任一项所述的抗体或其抗体片段的方法，包括在培养基中培养权利要求14所述的杂交瘤或权利要求17所述的转化体以在培养物中形成和累积权利要求1至13任一项所述的抗体或其抗体片段，和从所述培养物收集所述抗体或其抗体片段。

19.系统ASC氨基酸转运蛋白2相关疾病的治疗药，其包含权利要求1至13任一项所述的抗体或其抗体片段作为活性成分。

20.根据权利要求19所述的治疗药，其中与系统ASC氨基酸转运蛋白2相关的疾病是癌症。

21.根据权利要求20所述的治疗药，其中癌症是血液癌、食道癌、胃癌、结肠直肠癌、肝癌或前列腺癌。

22.免疫学检测或测量系统ASC氨基酸转运蛋白2的试剂，其利用权利要求1至13任一项所述的抗体或其抗体片段。

23.系统ASC氨基酸转运蛋白2相关疾病的诊断试剂，其利用权利要求1至13任一项所述的抗体或其抗体片段。

24.根据权利要求23所述的诊断试剂，其中与系统ASC氨基酸转运蛋白2相关的疾病是癌症。

25.根据权利要求24所述的诊断试剂，其中癌症是血液癌、食道癌、胃癌、直肠结肠癌、肝癌或前列腺癌。

26.权利要求1至13任一项所述的抗体或其抗体片段在制备试剂中的应用，所述试剂用于免疫学检测或测量系统ASC氨基酸转运蛋白2。

27.根据权利要求26所述的应用，其中免疫学测量采用免疫沉淀法。

28.权利要求1至13任一项所述的抗体或其抗体片段在制备试剂中的应用，所述试剂用于免疫学检测或测量表达系统ASC氨基酸转运蛋白2的细胞。

29.根据权利要求28所述的应用，其中免疫学检测采用荧光细胞染色法。

说明书

抗-系统ASC氨基酸转运蛋白2(ASCT2)抗体

[0001] 本申请为国际申请日2009年7月17日、国际申请号PCT/JP2009/062988于2011年1月17日进入中国国家阶段、申请号200980127964.X、发明名称“抗-系统ASC氨基酸转运蛋白2(ASCT2)抗体”的分案申请。

技术领域

[0002] 本发明涉及单克隆抗体或其抗体片段，所述单克隆抗体特异性识别系统ASC氨基酸转运蛋白2(以下称为“ASCT2”)的细胞外区域的天然三维结构并与该细胞外区域结合；产生所述抗体的杂交瘤；编码所述抗体的DNA；包含所述DNA的载体；可通过导入所述载体获得的转化体；利用所述杂交瘤或转化体生产抗体或其抗体片段的方法；和利用所述抗体或其抗体片段的治疗药，以及利用所述抗体或其抗体片段的诊断试剂。

背景技术

[0003] ASCT2多肽是由541个氨基酸构成的全长10次跨膜蛋白，并依赖钠离子发挥将中性氨基酸转运过细胞膜的转运蛋白的功能。氨基酸转运蛋白根据包括底物特异性等在内的功能功能特征分成几个系统。ASCT2属于系统ASC并具有依赖钠离子进行中性氨基酸例如L-丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-半胱氨酸、和L-谷氨酰胺的细胞内摄取的功能(非专利文献1)。

[0004] 此外，ASCT2是D型猿逆转录病毒和三种C型病毒[猫内源病毒(RD114)，狒狒内源病毒，和鸟类网状内皮组织增殖病毒］(非专利文献2和3)共享的病毒细胞表面受体。

[0005] ASCT2也被称为2型钠依赖性中性氨基酸转运蛋白，脂肪细胞氨基酸转运蛋白，0 0
AAAT，中性氨基酸转运蛋白B，ATB，氨基酸转运蛋白B，ATB，ATBO，狒狒M7病毒受体，M7V1，M7VS1，胰岛素活化氨基酸转运蛋白，FLJ31068，RD114病毒受体，RD114/猿D型逆转录病毒受体，RDR，RDRC，或R16(非专利文献1和3)。

[0006] 此外，作为另一个名称，ASCT2被称为溶质载体家族1(中性氨基酸转运)、成员5、溶质载体家族1成员5或SLC1A5，并属于SLC1家族。

[0007] 关于癌症发展和ASCT2或SLC1A5表达之间的关系，利用表达序列标签(EST)数据库已经发现，SLC1A5、SLC7A5和SLC38A5三者在癌组织中的表达水平显著增加(非专利文献4)。此外，在正常肝脏中没有发现SLC1A5的表达，但是在肝细胞癌或肝母细胞瘤的临床组织中发现SLC1A5的表达(非专利文献5)。另外已经发现，在低分化的星形细胞瘤或多形性胶质母细胞瘤的临床组织中SLC1A5的表达比在正常组织中高(非专利文献6)。

[0008] 此外，通过免疫组织学染色或Western印迹法，在大肠癌和前列腺癌临床组织中检出了ASCT2的表达，而高度表达ASCT2的患者的后果较差(非专利文献7和8)。

[0009] 此外，ASCT2担负大肠癌、肝癌、乳腺癌、星形细胞瘤和神经母细胞瘤的几个细胞系中谷氨酰胺的摄取(非P专利文献9至12)，并通过利用ASCT2的底物丙氨酸-丝氨酸-苏氨酸混合物来竞争性抑制谷氨酰胺的细胞内摄取，从而抑制了细胞增殖(非专利文献9)。

[0010] 至于与ASCT2结合的抗体，已知的是抗人ASCT2的细胞内N-末端或C-末端部分肽的多克隆抗体(非专利文献13、14和15)。因为这些抗体全都是识别ASCT2的细胞内部分，所以它们不能与细胞的细胞膜 上表达的ASCT2相结合。已知当抗体与细胞膜上表达的抗原蛋白结合时，在生物体内诱导了抗体的效应子活性引起的细胞毒性，例如抗体依赖性细胞的细胞毒性(以下称为“ADCC活性”)或补体依赖性细胞毒性(以下称为“CDC活性”)(非专利文献16)。但是，因为这些抗体不能与细胞的细胞膜上表达的ASCT2结合，不能期待由效应子活性引起的这些细胞毒性。另外，因为所有这些抗体是识别ASCT2的细胞内部分的抗体，它们不能抑制由活细胞中表达的ASCT2细胞内摄取氨基酸。

[0011] 另外，识别人类ASCT2的多克隆抗体可以从：LifeSpan BioSciences (产品编号：LS-C16840和LC-C31887)，Avia Systems Biology(产品编号：ARP42247_T100)，Santa Cruz Biotechnology(产品编号：sc-50698和sc-50701)，或Millipore(产品编号：AB5468)获得。

[0012] 但是，尚不知道特异性识别ASCT2的细胞外区域的天然三维结构并与所述细胞外区域结合的单克隆抗体。

[0013] 现有技术文献

[0014] 非专利文献

[0015] 非专利文献1：J.Biol.Chemistry,271,18657(1996)

[0016] 非专利文献2：Proc,Natl.Acad,Sci.USA,96,2129(1999)

[0017] 非专利文献3：J.Virology,73,4470(1999)

[0018] 非专利文献4：Seminars in Cancer Biology,15,254(2005)

[0019] 非专利文献5：Am.J.Physiol.Gastrointest.Liver Physiol.,283,G1062(2002)[0020] 非专利文献6：NeuroReport,15,575(2004)

[0021] 非专利文献7：Anticancer Research,22,2555(2002)

[0022] 非专利文献8：Anticancer Research,23,3413(2003)

[0023] 非专利文献9：J.Surgical Research,90,149(2000)

[0024] 非专利文献10：J.Cellular Physiology,176,166(1998)

[0025] 非专利文献11：J.Neuroscience Research,66,959(2001)

[0026] 非专利文献12：Am.J.Physiol.Cell Physiol.,282,C1246(2002)

[0027] 非专利文献13：J.Gene Medicine,6,249(2004)

[0028] 非专利文献14：Am.J.Physiol.Cell Physiol.,281,C963(2001)

[0029] 非专利文献15：Biochem.J.,382,27(2004)

[0030] 非专利文献16：Cancer Res.,56,1118(1996)发明概要

[0031] 本发明要解决的技术问题

[0032] 本发明的目的是提供单克隆抗体或其抗体片段，所述单克隆抗体特异性识别ASCT2的细胞外区域的天然三维结构并与该细胞外区域结合；产生所述抗体的杂交瘤；编码所述抗体的DNA；包含所述DNA的载体；可通过导入所述载体获得的转化体；利用所述杂交瘤或转化体生产抗体或其抗体片段的方法；和利用所述抗体或其抗体片段的治疗药，以及利用所述抗体或其抗体片段的诊断试剂

[0033] 解决问题的方案

[0034] 本发明涉及以下(1)至(44)：

[0035] (1) 单克隆抗体或其抗体片段，所述单克隆抗体特异性识别系统ASC氨基酸转运蛋白2(以下称为“ASCT2”)的细胞外区域的天然三维结构并与该细胞外区域结合；

[0036] (2) (1)所述的单克隆抗体或其抗体片段，其抑制通过ASCT2细胞内摄取氨基酸；

[0037] (3) (1)或(2)所述的单克隆抗体或其抗体片段，其具有细胞的细胞毒性；

[0038] (4) (3)所述的单克隆抗体或其抗体片段，其中所述细胞毒性是抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)活性或补体依赖性细胞毒性(CDC)活性；

[0039] (5) (1)至(4)任一项所述的单克隆抗体或其抗体片段，其与人类ASCT2结合而不与小鼠ASCT2结合；

[0040] (6) (5)所述的单克隆抗体或其抗体片段，其与人类ASCT2 的至少EL2区域结合；

[0041] (7) (6)所述的单克隆抗体或其抗体片段，其与选自SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列中154、159至160、163至171、173至174、177、188、204至205、207、210至212和214至223位的至少任何一个氨基酸结合；

[0042] (8) (1)至(7)任一项所述的抗体或其抗体片段，其中所述单克隆抗体是与选自杂交瘤KM4008(FERM BP-10962)和杂交瘤KM4012(FERM BP-10963)的任何一种杂交瘤产生的单克隆抗体所识别的表位结合的单克隆抗体；

[0043] (9) (1)至(8)任一项所述的抗体或其抗体片段，其中所述单克隆抗体是选自杂交瘤KM4008(FERM BP-10962)和杂交瘤KM4012(FERM BP-10963)的任何一种杂交瘤产生的单克隆抗体；

[0044] (10) (1)至(9)任一项所述的抗体片段，其中所述抗体片段是选自Fab、Fab'、F(ab')2、单链抗体(scFv)、二聚体化V区(双抗体)、二硫键稳定的V区(dsFv)和包含CDR的肽的抗体片段；

[0045] (11) (1)至(10)任一项所述的抗体或其抗体片段，其中所述单克隆抗体是重组抗体；

[0046] (12) (11)所述的重组抗体或其抗体片段，其中所述重组抗体是选自人嵌合抗体、人源化抗体和人类抗体的重组抗体；

[0047] (13) (11)所述的重组抗体或其抗体片段，其包括(1)至(9)任一项所述的单克隆抗体的重链可变区(以下称为“VH”)和轻链可变区(以下称为“VL”)的互补决定区(以下称为“CDR”)；

[0048] (14) (13)所述的重组抗体或其抗体片段，其中抗体的VH的CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:26、27和28表示的氨基酸序列；

[0049] (15) (13)所述的重组抗体或其抗体片段，其中抗体的VL的CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:29、30和31表示的氨基酸序列；

[0050] (16) (13)所述的重组抗体或其抗体片段，其中抗体的VH的CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:26、27和28表示的氨基 酸序列，和抗体的VL的CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:29、30和31表示的氨基酸序列；

[0051] (17) (13)所述的重组抗体或其抗体片段，其中抗体的VH的CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:32、33和34表示的氨基酸序列；

[0052] (18) (13)所述的重组抗体或其抗体片段，其中抗体的VL的CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:35、36和37表示的氨基酸序列；

[0053] (19) (13)所述的重组抗体或其抗体片段，其中抗体的VH的CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:32、33和34表示的氨基酸序列，而抗体的VL的CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:35、36和37表示的氨基酸序列；

[0054] (20) (13)所述的重组抗体或其抗体片段，其中抗体的VH的CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:49、50和51表示的氨基酸序列；

[0055] (21) (13)所述的重组抗体或其抗体片段，其中抗体的VL的CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:52、53和54表示的氨基酸序列；

[0056] (22) (13)所述的重组抗体或其抗体片段，其中抗体的VH的CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:49、50和51表示的氨基酸序列，而抗体的VL的CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:52、53和54表示的氨基酸序列；

[0057] (23) (12)所述的人嵌合抗体或其抗体片段，其包含(l)至(8)的任一项所述的单克隆抗体的VH和VL；

[0058] (24) (23)所述的人嵌合抗体或其抗体片段，其选自其中抗体的VH包含SEQ ID NO:19表示的氨基酸序列和抗体的VL包含SEQ IDNO:21表示的氨基酸序列的人嵌合抗体、其中抗体的VH包含SEQ IDNO:23表示的氨基酸序列和抗体的VL包含SEQ ID NO:25表示的氨基酸序列的人嵌合抗体、和其中抗体的VH包含SEQ ID NO:46表示的氨基酸序列和抗体的VL包含SEQ ID NO:48表示的氨基酸序列的人嵌合 抗体；

[0059] (25) (12)所述的人源化抗体或其抗体片段，其中抗体的VH包含SEQ ID NO:71表示的氨基酸序列，或其中选自SEQ ID NO:71表示的氨基酸序列中第2位Val、第9位Ser、第20位Val、第30位Ser、第38位Arg、第46位Glu、第86位Leu、第93位Val、第95位Tyr和第116位Val的至少一个氨基酸残基被其它氨基酸残基取代的氨基酸序列；和/或其中抗体的VL包含SEQ ID NO:72表示的氨基酸序列，或其中选自SEQ ID NO:72表示的氨基酸序列中第8位Pro、第15位Val、第38位Gln、第43位Ala、第44位Pro、71位Phe和第87位Tyr的至少一个氨基酸残基被其它氨基酸残基取代的氨基酸序列，

[0060] (26) (25)所述的人源化抗体或其抗体片段，其中抗体的VH包含的氨基酸序列在SEQ ID NO:71表示的氨基酸序列中导入选自Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val，Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的修饰中的至少一个修饰，和抗体的VL包含的氨基酸序列在SEQ ID NO:72表示的氨基酸序列中导入选自Thr取代第8位Pro、Leu取代第15位Val、Arg取代第38位Gln、Thr取代第43位Ala、Val取代第44位Pro、Tyr取代71位Phe和Phe取代第87位Tyr的修饰中的至少一个修饰；

[0061] (27) (25)所述的人源化抗体或其抗体片段，其中人源化抗体选自抗体的VH包含SEQ ID NO:76表示的氨基酸序列和/或抗体的VL包含SEQ ID NO:72表示的氨基酸序列的人源化抗体，抗体的VH包含SEQ ID NO:78表示的氨基酸序列和/或抗体的VL包含SEQ ID NO:72表示的氨基酸序列的人源化抗体，抗体的VH包含SEQ ID NO:80表示的氨基酸序列和/或抗体的VL包含SEQ ID NO:72表示的氨基酸序列的人源化抗体，抗体的VH包含SEQ ID NO:82表示的氨基酸序列和/或抗体的VL包含SEQ ID NO:72表示的氨基酸序列的人源化抗体，抗体的VH包含SEQ ID NO:71表示的氨基酸序列和/或抗体的VL包含SEQ ID NO:84表示的氨基酸序列的人源化抗体，抗体的VH包含SEQ ID NO: 76表示的氨基酸序列和/或抗体的VL包含SEQ ID NO:84表示的氨基酸序列的人源化抗体，抗体的VH包含SEQ ID NO:78表示的氨基酸序列和/或抗体的VL包含SEQ ID NO:84表示的氨基酸序列的人源化抗体，抗体的VH包含SEQ ID NO:80表示的氨基酸序列和/或抗体的VL包含SEQ ID NO:84表示的氨基酸序列的人源化抗体，和抗体的VH包含SEQ ID NO:82表示的氨基酸序列和/或抗体的VL包含SEQ ID NO:84表示的氨基酸序列的人源化抗体；

[0062] (28) 产生(1)至(27)任一项所述的单克隆抗体的杂交瘤；

[0063] (29) (28)所述的杂交瘤，其中所述杂交瘤是杂交瘤KM4008(FERM BP-10962)或杂交瘤KM4012(FERM BP-10963)；

[0064] (30) 编码(1)至(29)任一项所述的抗体或其抗体片段的DNA；

[0065] (31) 包含(30)所述的DNA的重组载体；

[0066] (32) 可通过将(31)所述的重组载体导入宿主细胞而获得的转化体；

[0067] (33) 生产(1)至(27)任一项所述的抗体或其抗体片段的方法，包括在培养基中培养(28)或(29)所述的杂交瘤或(32)所述的转化体以在所述培养物中形成和累积(1)至(27)任一项所述的抗体或其抗体片段，和从所述培养物收集所述抗体或其抗体片段；

[0068] (34) 包含(1)至(27)任一项所述的抗体或其抗体片段作为活性成分的ASCT2相关疾病的治疗药；

[0069] (35) (34)所述的治疗药，其中所述与ASCT2相关的疾病是癌症；

[0070] (36) (35)所述的治疗药，其中所述癌症是血液癌，食道癌，胃癌，大肠癌，肝癌或前列腺癌；

[0071] (37) 免疫学检测或测量ASCT2的方法，其利用(1)至(27)的任一项所述的抗体或其抗体片段；

[0072] (38) (37)所述的方法，其中所述免疫学测量方法是免疫沉淀法；

[0073] (39) 免疫学检测或测量表达ASCT2的细胞的方法，其利用(1)至(27)任一项所述的抗体或其抗体片段；

[0074] (40) (39)所述的方法，其中所述免疫学检测方法是荧光细胞染色法；

[0075] (41) 免疫学检测或测量ASCT2的试剂，其利用(1)至(27)任一项所述的抗体或其抗体片段；

[0076] (42) ASCT2相关疾病的诊断试剂，其利用(1)至(27)任一项所述的抗体或其抗体片段；

[0077] (43) (42)所述的诊断试剂，其中所述与ASCT2相关的疾病是癌症；和

[0078] (44) (43)所述的诊断试剂，其中所述癌症是血液癌，食道癌，胃癌，大肠癌，肝癌或前列腺癌。

[0079] 发明的有益效果

[0080] 本发明能提供单克隆抗体或其抗体片段，所述单克隆抗体特异性识别ASCT2的细胞外区域的天然三维结构并与该细胞外区域结合；产生所述抗体的杂交瘤；编码所述抗体的DNA；包含所述DNA的载体；可通过导入所述载体获得的转化体；利用所述杂交瘤或转化体产生抗体或其抗体片段的方法；和利用所述抗体或其抗体片段的治疗药，以及利用所述抗体或其抗体片段的诊断试剂

附图说明

[0081] 图1-1显示了NM_005628(SEQ ID NO:l)和HCHON2001712(SEQ ID NO:87)的比对。*表示两个核苷酸序列在该位置相同。

[0082] 图1-2显示了NM_005628(SEQ ID NO:l)和HCHON2001712(SEQ ID NO:87)的比对。*表示两个核苷酸序列在该位置相同。

[0083] 图1-3显示了NM_005628(SEQ ID NO:l)和HCHON2001712(SEQ ID NO:87)的比对。*表示两个核苷酸序列在该位置相同。下划线处是用于Q-PCR的扩增引物的设计位置(Fw#1对应NM_005628的2281至2301位核苷酸和HCHON2001712的1689至1709位核苷酸，Rv#1对应NM_005628的2739至2719位反向核苷酸链和HCHON2001712的2139至2119位的反向核苷酸链)。

[0084] 图1-4显示了NM_005628(SEQ ID NO:l)和HCHON2001712(SEQ ID NO:87)的比对。*表示两个核苷酸序列在该位置相同。下划线处是用于Q-PCR的扩增引物的设计位置(Fw#1对应NM_005628的2281至2301位核苷酸和HCHON2001712的1689至1709位核苷酸，Rv#1对应NM_005628的2739至2719位反向核苷酸链和HCHON2001712的2139至2119位的反向核苷酸链)。

[0085] 图2-1显示癌细胞系、异种移植物、正常组织和临床癌组织中ASCT2基因的mRNA表达水平。

[0086] 图2-2显示癌细胞系、异种移植物、正常组织和临床癌组织中ASCT2基因的mRNA表达水平。

[0087] 图3显示通过流式细胞仪测量的抗-myc抗体(抗-myc)和抗-His抗体(抗-His)与固定化的人ASCT2-myc/His基因-导入CHO细胞(ASCT2/CHO)和载体导入CHO细胞(载体/CHO)的反应性。横坐标表示荧光强度，纵坐标表示细胞计数。抗体通过涂黑指示，缓冲液由白色曲线指示。

[0088] 图4显示在结合ELISA中，抗ASCT2的N-末端肽的单克隆抗体KM3842与ASCT2的N-末端肽的反应性。横坐标表示抗体浓度(μg/mL)，纵坐标表示吸光度比值(OD415/490)。▲表示在利用人ASCT2N-末端肽-THY结合物情况下的吸光度比值和■表示在利用对照肽-THY结合物情况下的吸光度比值。

[0089] 图5显示利用荧光细胞染色(流式细胞仪)检测的抗ASCT2单克隆抗体KM3998与ASCT2-myc/His基因导入的CHO细胞(ASCT2/CHO)、载体导入的CHO细胞(载体/CHO)和KMS-11的反应性。横坐标表示荧光强度，纵坐标表示细胞计数。KM3998通过涂黑指示，大鼠IgG2a-UNLB由白色曲线指示。

[0090] 图6显示利用荧光细胞染色(流式细胞仪)检测的抗-ASCT2单克隆抗体KM4000、KM4001、KM4008、KM4012和KM4018与人ASCT2-myc/His基因导入的CHO细胞(ASCT2/CHO)、载体导入的CHO细胞(载体/CHO)和KMS-11的反应性。横坐标表示抗体浓度(μg/mL)，纵坐标表示平均荧光强度。KM511的平均荧光强度由●和实线表示， KM4000的平均荧光强度由■和粗实线表示，KM4001的平均荧光强度由▲和虚线表示，KM4008的平均荧光强度由O和虚线表示，KM4012的平均荧光强度由□和虚线表示，大鼠IgG2a-UNLB的平均荧光强度由符号□和实线表示，和KM4018的平均荧光强度由▲和粗实线表示。

[0091] 图7显示抗-ASCT2单克隆抗体KM3998对人大肠癌细胞系WiDr的谷氨酰胺依赖性增殖的抑制活性。横坐标表示KM3998的终浓度(μg/mL)，纵坐标表示以抗体未处理的细胞的增殖作为100%得到的相对值(%)。KM3998的相对增殖率由◆和实线表示，大鼠IgG2a-UNLB的相对增殖率由符号×和实线表示，AST混合物的相对增殖率由虚线表示。

[0092] 图8显示抗-ASCT2单克隆抗体KM4000、KM4001、KM4008、KM4012和KM4018对人大肠癌细胞系WiDr的谷氨酰胺依赖性增殖的抑制活性。横坐标表示各个抗体的终浓度(μg/mL)，纵坐标表示以抗体未处理的细胞的增殖作为100%得到的相对值(%)。KM4000的相对增殖率由◆和实线表示，KM4001的相对增殖率由■和实线表示，KM4008的相对增殖率由Δ和实线表示，KM4012的相对增殖率由O和实线表示，KM511的相对增殖率由×和实线表示，KM4018的相对增殖率由■和实线表示，大鼠IgG2a-UNLB的相对增殖率由×和实线表示，AST混合物的相对增殖率由虚线表示。

[0093] 图9显示利用荧光细胞染色(流式细胞仪)检测的抗-ASCT2人嵌合抗体与人ASCT2-myc/His基因导入的CHO细胞(ASCT2/CHO)和人多发性骨髓瘤细胞系OPM-2的反应性。横坐标表示抗体浓度(μg/mL)，纵坐标表示平均荧光强度。cKM4008的平均荧光强度由O和实线表示，cKM4012的平均荧光强度由Δ和实线表示，cKM4018的平均荧光强度由■和实线表示。

[0094] 图10显示抗-ASCT2人嵌合抗体对人多发性骨髓瘤细胞系KMS-11的ADCC活性。横坐标表示抗体浓度(ng/mL)，纵坐标表示ADCC活性。cKM4008的ADCC活性由O和实线表示，CKM4012的ADCC活性由Δ和实线表示，cKM4018的ADCC活性由■和实线表示。

[0095] 图11显示抗-ASCT2人嵌合抗体对人ASCT2-myc/His基因导入的 CHO细胞(ASCT2/CHO)和人大肠癌细胞系Colo205的CDC活性。横坐标表示抗体浓度(μg/mL)，纵坐标表示CDC活性。CKM4008的CDC活性由O和实线表示，CKM4012的CDC活性由Δ和实线表示，cKM4018的CDC活性由■和实线表示。

[0096] 图12显示抗-asct2人嵌合抗体对人大肠癌细胞系WiDr的谷氨酰胺依赖性增殖的抑制活性。横坐标表示各个抗体的终浓度(μg/mL)，纵坐标表示以抗体未处理的细胞的增殖作为100%得到的相对值(%)。KM4008的相对增殖率由O和实线表示，KM4012的相对增殖率由Δ和实线表示，KM4018的相对增殖率由■和实线表示，KM511的相对增殖率由+和实线表示，AST混合物的相对增殖率由虚线表示。

[0097] 图13显示人ASCT2蛋白和小鼠ASCT2蛋白的示意图。黑色表示在推定的细胞外区域(EL1，EL2，EL3，EL4和EL5)中人和小鼠蛋白之间不同的氨基酸。具体实施方案

[0098] 本发明涉及单克隆抗体或其抗体片段，所述单克隆抗体特异性识别ASCT2的细胞外区域的天然三维结构并与该细胞外区域结合。

[0099] 本发明的ASCT2的物种没有特别的限制。物种的例子可优选是哺乳动物，具体是人类。

[0100] ASCT2的氨基酸序列信息可以从已知的数据库例如NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得。实例包括SEQ ID NO:2表示的人ASCT2(NCBI登录号NP_005619)，SEQ ID NO:86表示的小鼠ASCT2(NCBI登录号NP_033227)，等等。

[0101] 本发明的ASCT2包括包含SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列或者SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列中一个或多个氨基酸残基被缺失、取代和/或添加并具有ASCT2功能的多肽。本发明的ASCT2还包括与SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列具有60%以上同源性、优选80%以上同源 性、更优选90%以上同源性、更加优选95%以上同源性并具有ASCT2功能的多肽。

[0102] 在本发明中，包含在SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列中有一个或多个氨基酸残基缺失、取代和/或添加的氨基酸序列的所述多肽，可通过位点特异性诱变得到[Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Second Edition（分子克隆：实验室手册，第二版）,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；Current Protocols in Molecular Biology（现代分子生物学技术）,John Wiley & Sons(1987-1997),Nucleic Acids Research,10,6487(1982),Prop,Natl.Acad Sci.,USA,79,6409(1982),Gene,34,315(1985),Nucleic Acids Research,13,4431(1985),Proc.Natl Acad Sci USA,82,488(1985)]。例如，其可在具有带有SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列的多肽的编码核苷酸序列中导入位点特异性突变而得到。被缺失、取代和/或添加飞氨基酸残基数量没有特别限定。适当的数量是1至数十个，优选1至20个，更优选1至数个，更加优选1至5个。

[0103] 编码ASCT2的基因的实例包括SEQ ID NO:1表示的核苷酸序列。编码ASCT2的基因的实例还包括：其包含的DNA含有在SEQ ID NO:1表示的核苷酸序列中具有一个或多个核苷酸的缺失、取代或添加的核苷酸序列、并编码具有ASCT2功能的多肽的基因；其包含的DNA含有与SEQ ID NO:1表示的核苷酸序列具有至少60%以上同源性、优选80%以上同源性和更优选95%以上同源性的核苷酸序列、并编码具有ASCT2功能的多肽的基因；其包含的DNA在严格条件下与具有SEQ ID NO:1表示的核苷酸序列的DNA杂交、并包含具有ASCT2功能的多肽的编码DNA的基因；等等。

[0104] 在本发明中，在严格条件下杂交的DNA是指通过集落杂交、噬斑杂交、Southern杂交、DNA微阵列等，利用具有SEQ ID NO:1表示的核苷酸序列的DNA作为探针而得到的DNA。这样的DNA的具体实例 是杂交的菌落或斑块来源的DNA，其可如下进行鉴别：在0.7至1.0mol/1氯化钠存在下，利用其上有固定化PCR产物或寡聚DNA的滤光片或载玻片，在65℃进行杂交，然后在65℃下用0.1至2-倍浓度的SSC溶液(1-倍浓度SSC溶液:150mmol/1氯化钠和15mmol/1柠檬酸钠)洗涤所述滤光片或载玻片。杂交可以根据下列文献中记载的方法进行：Molecular Cloning，A Laboratory Manual,Second Edition（分子克隆：实验室手册，第二版）,Cold Spring Harbor Lab,Press(1989),Current Protocols in Molecular Biology（现代分子生物学技术）,John Wiley & Sons(1987-1997);DNA Cloning 1:Core Techniques,A Practical Approach,Second Edition（DNA克隆1：核心技术，实用方法）,Oxford University(1995)。具体地说，能够杂交的DNA包括与SEQ ID NO:1表示的核苷酸序列具有至少60%以上同源性、优选80%以上同源性、更优选90%以上同源性和最优选95%以上同源性的DNA。

[0105] 在编码真核生物蛋白质的核苷酸序列中，经常发现遗传多态性。用于本发明的ASCT2基因还包括在核苷酸序列中通过这样的多态性产生小修饰的基因。

[0106] 除非另有陈述，本发明所记载的同源性数值可以是利用技术人员已知的同源性检索程序计算的数值。关于核苷酸序列，所述数值可以通过BLAST[J. Mot Biol,215,403(1990)]用缺省参数等计算，而关于氨基酸序列，所述数值可以利用BLAST2[Nucleic Acids Res.,25,3389(1997);Genome Res.,7,649(1997); http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/information3.html]用缺省参数等计算。

[0107] 作为缺省参数，G（开放缺口成本（cost to open gap））对于核苷酸序列来说是5，对于氨基酸序列来说是11；-E（延伸缺口成本（cost to extend gap））对于核苷酸序列来说是2，对于氨基酸序列来说是1；-q（核苷酸错配的罚分（penalty for nucleotide mismatch））是-3；-r（核 苷酸匹配的奖励（reward for nucleotide match））是1；-e（预期值（expect value））是10；-W（字长（wordsize））对于核苷酸序列来说是11个残基，对于氨基酸序列来说是3个残基；-y（以比特计blast延伸的下降值（X）（dropoff(X)for blast extensions in bits））对于blastn来说是20，对于blastn之外的程序来说是7；-X（以比特计的缺口比对的X下降值（X dropoff value for gapped alignment in bits））是15；和-Z(以比特计的缺口比对的最终X下降值（final X dropoff value for gapped alignment in bits）)对blastn是50和对于blastn之外的程序是25（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/html/blastcgihelp.html）。

[0108] 包含SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列的部分序列的多肽可通过为本领域技术人员所知的方法制备，例如通过部分缺失编码SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列的DNA、并培养导入了包含所述部分缺失的DNA的表达载体的转化体而制备。基于这样构建的多肽或DNA，还可以依照上面描述的相同方法，得到在SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列的部分序列中缺失、取代和/或添加一个或多个氨基酸的多肽。还可以通过化学合成方法，例如芴基甲氧基羰基(Fmoc)法、叔丁氧基羰基(tBoc)法等，生产包含SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列的部分序列的多肽，或在SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列的部分序列中缺失、取代和/或添加一个或多个氨基酸的多肽。

[0109] 本发明ASCT2的细胞外区域的实例包括根据SEQ ID NO:2表示的多肽的氨基酸序列，通过已知的跨膜区域预测程序预测的区域，所述预测程序是SOSUI(http;//sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp/sosuiframe0.html)、TMHMM第二版(http:/www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/),ExPAsy Proteomics Server(http://Ca.expasy.org/)等。具体地说，范例包括在74至98位、154至224位、287至305位、357至376位和420至425位的五个区，它们是ExPASy Proteomics Server预测的细胞外区域。或者，范例包括在65至88位、152至224位、288至306位、361至380位和447至451位的五个区，它们是文献[J. Biol.Chemistry,271. 18657(1996)]或[J. Virology,73,4470(1999)]预测的细胞外区域。在本发明中，所述五个细胞外区域从N-末端侧起顺序表示为EL1区域、EL2区域、EL3区域、EL4区域和EL5区域。例如，在SEQ ID NO:2表示的ASCT2多肽的氨基酸序列中的EL2区域对应154至224位或152至224位。

[0110] 本发明的单克隆抗体与ASCT2的细胞外区域结合，优选与ASCT2的细胞外区域中以上所述的EL1至EL5结合，更优选至少与ASCT2的细胞外区域中的EL2结合。

[0111] 本发明中ASCT2的细胞外区域的天然三维结构可以是任意结构，只要它具有的三维结构等同于由具有SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列的ASCT2的细胞外区域以天然状态形成的三维结构即可。

[0112] 本发明的抗体或其抗体片段是否特异性识别ASCT2的细胞外区域的天然三维结构并与所述细胞外区域结合，可通过利用固相夹心法等的放射免疫分析，或通过利用例如酶免疫分析(ELISA)法等的ASCT2表达细胞的已知免疫检测方法来证实，优选能够研究抗体与特定抗原和表达所述特定抗原的细胞结合的方法，例如荧光细胞染色法。例如，具体例子包括利用FMAT8100HTS系统的荧光抗体染色法(Applied Biosystems制造)[Cancer Immunol.Immunother,36,373(1993)]等，利用流式细胞术荧光细胞染色法，利用Biacore系统的表面等离子体共振(GE Healthcare制造)等，或其它方法。此外，已知的免疫学检测方法[Monoclonal Antibodies-Principles and practice,Third edition（单克隆抗体-原理和实践，第三版）,Academic Press(1996)；Antibodies-A Laboratory Manual(抗体- 实 验 室 手 册 ),Cold Spring Harbor Laboratory(1988),Monoclonal Antibody Experimental Manual(单克隆抗体实验手册),Kodan-sha Scientific(1987)]等可加以组合来验证结合。

[0113] 在本发明中，表达ASCT2的细胞可以是任意细胞，只要它表达 ASCT2即可，例子包括天然存在于人体的细胞、从天然存在于人体的细胞建立的细胞系、通过基因重组技术得到的细胞等等。

[0114] 天然存在于人体的细胞包括在癌症患者体内表达多肽的细胞，例如通过活组织检查得到的在肿瘤细胞中表达ASCT2的细胞等。

[0115] 从天然存在于人体的细胞建立的细胞系的例子包括通过建立从上述癌症患者得到的ASCT2-表达细胞而制备的细胞系中，表达ASCT2的细胞系，例子还包括多发性骨髓瘤细胞系KMS-11[人类科学研究资源库(HSRRB)序号：JCRB1179],RPMI 8226(HSRRB序号：JCRB0034)等。

[0116] 通过基因重组技术得到的细胞的具体例子可包括通过将包含ASCT2-编码cDNA的表达载体导入昆虫细胞、动物细胞等得到的ASCT2-表达细胞，等等。

[0117] 本发明的单克隆抗体包括通过杂交瘤生产的抗体和通过用包含抗体编码基因的表达载体转化的转化体生产的重组抗体。

[0118] 杂交瘤可以例如如下制备：制备表达ASCT2作为抗原的上述细胞，从用所述抗原免疫的动物诱导抗原特异性的抗体生产细胞，和将该抗体生产细胞与骨髓瘤细胞融合。而抗-ASCT2抗体可以如下得到：培养杂交瘤或将所述杂交瘤细胞施用到动物中以在所述动物中引起腹水肿瘤，分离和提纯所述培养物或腹水。

[0119] 用抗原免疫的动物可以是任何动物，只要可以制备杂交瘤即可，小鼠、大鼠、仓鼠、兔子等都适合使用。本发明的抗体还包括从这样的动物得到具有抗体生产活性的细胞，并在体外免疫之后，与骨髓瘤细胞融合得到的杂交瘤生产的抗体。

[0120] 本发明的杂交瘤生产的单克隆抗体的具体例子可以包括杂交瘤KM3998生产的抗体KM3998、杂交瘤KM4000生产的抗体KM4000、杂交瘤KM4001生产的抗体KM4001、杂交瘤KM4008生产的抗体KM4008、杂交瘤KM4012生产的抗体KM4012、杂交瘤KM4018生产的抗体KM4018等。杂交瘤KM4008和KM4012已经根据布达佩斯公约，在2008年5月1日保藏独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心，保藏号分别为FERM BP-10962和FERM BP-10963。

[0121] 此外，本发明的单克隆抗体还包括与以上所述杂交瘤生产的抗体所结合的表位相结合的单克隆抗体。

[0122] 本发明的重组抗体包括通过基因重组生产的抗体，例如人嵌合抗体、人源化抗体、人类抗体和其抗体片段。在重组抗体当中，具有单克隆抗体的共有特性、即免疫原性低和血液半衰期延长的重组抗体优选作为治疗药。

[0123] 所述重组抗体的例子包括利用重组技术修饰上述单克隆抗体得到的重组抗体。

[0124] 本发明的重组抗体的例子包括：其中抗体的重链可变区(以下称为VH)的互补性决定区(以下称为CDR1、CDR2和CDR3)分别包含SEQ ID NOs:26、27和28表示的氨基酸序列，和/或抗体的轻链可变区(以下称为VL)的CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NOs:29、30和31表示的氨基酸序列的抗体；其中抗体的VH的CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NOs:32、33和34表示的氨基酸序列，和/或抗体的VL的CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NOs:35、36和37表示的氨基酸序列的重组抗体；其中抗体的VH的CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NOs:49、50和51表示的氨基酸序列，和/或抗体的VL的CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NOs:52、53和54表示的氨基酸序列的重组抗体；等等。

[0125] 人嵌合抗体是包含非人动物的抗体的VH和VL、以及人类抗体的重链恒定区(以下称为CH)和轻链恒定区(以下称为CL)的抗体。具体地说，本发明的人嵌合抗体可以如下生产：从生产特异性识别ASCT2的细胞外区域的天然三维结构并与所述细胞外区域结合的单克隆抗体的杂交瘤获得编码VH和VL的cDNA，将它们各插入包含编码人类抗体的CH和CL的DNA的动物细胞用表达载体从而构建用于表达人嵌合抗体的载体，然后将所述载体导入动物细胞以表达所述抗体。

[0126] 对于人嵌合抗体的CH来说，可以使用任何CH，只要它属于人免疫球蛋白(以下称为“hIg”)即可，并优选属于hIgG类别的CH，并可以使用属于hIgG类别的任一亚类，例如hIgG1、hIgG2、hIgG3、和hIgG4。对于人嵌合抗体的CL来说，可以使用任何CL，只要它属于hIg类别即可，可以使用属于κ类或λ类的CL。

[0127] 本发明的人嵌合抗体的例子包括：其中抗体的VH包含SEQ ID NO:19表示的氨基酸序列而抗体的VL包含SEQ ID NO:21表示的氨基酸序列的人嵌合抗体；其中抗体的VH包含SEQ ID NO:23表示的氨基酸序列而抗体的VL包含SEQ ID NO:25表示的氨基酸序列的人嵌合抗体；其中抗体的VH包含SEQ ID NO:46表示的氨基酸序列而抗体的VL包含SEQ ID NO:48表示的氨基酸序列的人嵌合抗体等。具体的例子包括人嵌合抗体cKM4008、cKM4012、cKM4018等。

[0128] 人源化抗体是其中源自非人动物抗体的VH和VL的CDR的氨基酸序列被移植到人类抗体的VH和VL的适当位置中的抗体，也被称为人CDR移植抗体、重构抗体（reshaped-antibody）等。本发明的人源化抗体可以如下产生：构建编码抗体可变区（以下称为“V区”）的cDNA，其中源自于非人动物的、由生产特异性识别ASCT2的三维结构并与所述细胞外区域结合的单克隆抗体的杂交瘤产生的抗体的VH和VL的CDR的氨基酸序列，被移植到合适的人类抗体的VH和VL的构架中 （在后文中称为“FR”）；将cDNA分别插入到用于动物细胞表达的、含有人类抗体的CH和CL的编码基因的载体中，从而构建人源化抗体表达载体；以及将所述载体导入到动物细胞中以表达和生产人源化抗体。

[0129] 对于人源化抗的VH和VL的FR的氨基酸序列来说，可以使用任何氨基酸序列，只要它们分别是源自于人类抗体的VH和VL的FR的氨基酸序列即可。例子包括在数据库例如蛋白数据库（Protein Data Bank）中登记的人类抗体的VH和VL的FR的氨基酸序列、在例如美国卫生与人类服务部（Dept.Health and Human Services）的《免疫学重要的蛋白序列》（Sequences of Proteins of Immunological Interest）（1991）中描述的人类抗体的VH和VL的每个亚组FR的共有氨基酸序列，等等。

[0130] 对于人源化抗体的CH来说，可以使用任何CH，只要它属于hIg类别即可，优选的是hIgG类别的，并可以使用属于hIgG类别的任何一个亚类，例如hIgG1、hIgG2、hIgG3和hIgG4。对于人源化抗体的CL来说，可以使用任何CL，只要它属于hIg类别即可，并可以使用属于κ类别或λ类别的CL。

[0131] 本发明的人源化抗体的具体例子包括下面的人源化抗体：其中抗体的VH包含SEQ ID NO:71表示的氨基酸序列，或其中在SEQ ID NO:71表示的氨基酸序列中选自第2位Val、第9位Ser、第20位Val、第30位Ser、第38位Arg、第46位Glu、第86位Leu、第93位Val、第95位Tyr和第116位Val的至少一个氨基酸残基被其它氨基酸残基取代的氨基酸序列，和/或其中抗体的VL包含SEQ ID NO:72表示的氨基酸序列，或其中选自SEQ ID NO:72表示的氨基酸序列中第8位Pro、第15位Val、第38位Gln、第43位Ala、第44位Pro、71位Phe和第87位Tyr的至少一个氨基酸残基被其它氨基酸残基取代的氨基酸序列；等等。在这方面，导入的修饰数量没有限制。

[0132] 抗体的VH的氨基酸序列的例子优选包括：

[0133] 包含的氨基酸序列中SEQ ID NO:71表示的氨基酸序列的第9位Ser、第20位Val、第38位Arg、第46位Glu、第93位Val、第95位Tyr和第116位Val被其它氨基酸残基取代的人源化抗体；

[0134] 包含的氨基酸序列中SEQ ID NO:71表示的氨基酸序列的第20位Val、第46位Glu、第95位Tyr和第116位Val被其它氨基酸残基取代的人源化抗体；或

[0135] 包含的氨基酸序列中SEQ ID NO:71表示的氨基酸序列的第46位Glu和第95位Tyr被其它氨基酸残基取代的人源化抗体。

[0136] 通过上述氨基酸修饰得到的抗体的VH的氨基酸序列可包括，例如，其中在SEQ ID NO:71表示的氨基酸序列中引入选自Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第
86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸修饰中的至少一个修饰的氨基酸序列。

[0137] 导入十个修饰的氨基酸序列的具体例子包括其中在SEQ ID NO:71表示的氨基酸序列中导入Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列。

[0138] 在SEQ ID NO:71表示的氨基酸序列中导入九个修饰的VH的氨基酸序列的具体例子包括下列氨基酸序列：

[0139] Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0140] Ile取代第2位Val、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0141] Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0142] Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0143] Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0144] Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0145] Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0146] Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0147] Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、 Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，和

[0148] Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列。

[0149] 其中在SEQ ID NO:71表示的氨基酸序列中导入八个修饰的VH的氨基酸序列的具体例子包括下列氨基酸序列：

[0150] Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0151] Pro取代第9位Ser、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0152] Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0153] Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0154] Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0155] Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0156] Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0157] Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0158] Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，

[0159] Ile取代第2位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0160] Ile取代第2位Val、Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0161] Ile取代第2位Val、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0162] Ile取代第2位Val、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0163] Ile取代第2位Val、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0164] Ile取代第2位Val、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0165] Ile取代第2位Val、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0166] Ile取代第2位Val、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，

[0167] Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0168] Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Thr取代第30位Ser、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0169] Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0170] Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0171] Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0172] Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0173] Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，

[0174] Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0175] Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0176] Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0177] Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0178] Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0179] Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，

[0180] Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0181] Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0182] Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0183] Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0184] Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，

[0185] Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0186] Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Val取代第86位Leu、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0187] Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0188] Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，

[0189] Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0190] Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0191] Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，

[0192] Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0193] Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，和

[0194] Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、和Thr取代第93位Val的氨基酸序列。

[0195] 其中在SEQ ID NO:71表示的氨基酸序列中导入七个修饰的VH的氨基酸序列的具体例子包括下列氨基酸序列：

[0196] Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第46位Glu、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，[0197] Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，[0198] Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，[0199] Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，[0200] Ile取代第2位Val、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0201] Ile取代第2位Val、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0202] Ile取代第2位Val、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0203] Ile取代第2位Val、Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0204] Ile取代第2位Val、Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0205] Ile取代第2位Val、Ile取代第20位Val、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0206] Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0207] Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0208] Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0209] Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0210] Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0211] Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0212] Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0213] Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0214] Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列。

[0215] 其中在SEQ ID NO:71表示的氨基酸序列中导入六个修饰的VH的氨基酸序列的具体例子包括下列氨基酸序列：

[0216] Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0217] Pro取代第9位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0218] Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0219] Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0220] Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0221] Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0222] Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列。

[0223] 其中在SEQ ID NO:71表示的氨基酸序列中导入五个修饰的VH的氨基酸序列的具体例子包括下列氨基酸序列：

[0224] Ile取代第2位Val、Ile取代第20位Val、Lys取代第46位Glu、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0225] Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Lys取代第46位Glu、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0226] Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第46位Glu、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0227] Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0228] Ile取代第20位Val、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、 Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0229] Ile取代第20位Val、Lys取代第46位Glu、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列。

[0230] 其中在SEQ ID NO:71表示的氨基酸序列中导入四个修饰的VH的氨基酸序列的具体例子包括下列氨基酸序列：

[0231] Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Lys取代第46位Glu、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，

[0232] Pro取代第9位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，

[0233] Pro取代第9位Ser、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，

[0234] Pro取代第9位Ser、Lys取代第46位Glu、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0235] Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，

[0236] Ile取代第20位Val、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，

[0237] Ile取代第20位Val、Lys取代第46位Glu、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0238] Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，

[0239] Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0240] Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列等。

[0241] 其中在SEQ ID NO:71表示的氨基酸序列中导入三个修饰的VH的氨基酸序列的具体例子包括下列氨基酸序列：

[0242] Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、和Lys取代第38位Arg 的氨基酸序列，

[0243] Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、和Lys取代第46位Glu的氨基酸序列，

[0244] Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、和Thr取代第93位Val的氨基酸序列，

[0245] Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，

[0246] Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0247] Pro取代第9位Ser、Lys取代第38位Arg、和Lys取代第46位Glu的氨基酸序列，

[0248] Pro取代第9位Ser、Lys取代第38位Arg、和Thr取代第93位Val的氨基酸序列，

[0249] Pro取代第9位Ser、Lys取代第38位Arg、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，

[0250] Pro取代第9位Ser、Lys取代第38位Arg、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0251] Pro取代第9位Ser、Lys取代第46位Glu、和Thr取代第93位Val的氨基酸序列，

[0252] Pro取代第9位Ser、Lys取代第46位Glu、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，

[0253] Pro取代第9位Ser、Lys取代第46位Glu、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0254] Pro取代第9位Ser、Thr取代第93位Val、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，

[0255] Pro取代第9位Ser、Thr取代第93位Val、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0256] Pro取代第9位Ser、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0257] Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、和Lys取代第46位 Glu的氨基酸序列，

[0258] Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、和Thr取代第93位Val的氨基酸序列，

[0259] Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，

[0260] Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0261] Ile取代第20位Val、Lys取代第46位Glu、和Thr取代第93位Val的氨基酸序列，

[0262] Ile取代第20位Val、Lys取代第46位Glu、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，

[0263] Ile取代第20位Val、Lys取代第46位Glu、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0264] Ile取代第20位Val、Thr取代第93位Val、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，

[0265] Ile取代第20位Val、Thr取代第93位Val和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0266] Ile取代第20位Val、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0267] Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、和Thr取代第93位Val的氨基酸序列，

[0268] Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，

[0269] Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0270] Lys取代第38位Arg、Thr取代第93位Val、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，

[0271] Lys取代第38位Arg、Thr取代第93位Val、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0272] Lys取代第38位Arg、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116 位Val的氨基酸序列，

[0273] Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，

[0274] Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0275] Lys取代第46位Glu、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0276] Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列。

[0277] 其中在SEQ ID NO:71表示的氨基酸序列中导入两个修饰的VH的氨基酸序列的具体例子包括下列氨基酸序列：

[0278] Ile取代第2位Val、和Pro取代第9位Ser的氨基酸序列，

[0279] Ile取代第2位Val、和Ile取代第20位Val的氨基酸序列，

[0280] Ile取代第2位Val、和Thr取代第30位Ser的氨基酸序列，

[0281] Ile取代第2位Val、和Lys取代第38位Arg的氨基酸序列，

[0282] Ile取代第2位Val、和Lys取代第46位Glu的氨基酸序列，

[0283] Ile取代第2位Val、和Val取代第86位Leu的氨基酸序列，

[0284] Ile取代第2位Val、和Thr取代第93位Val的氨基酸序列，

[0285] Ile取代第2位Val、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，

[0286] Ile取代第2位Val、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0287] Pro取代第9位Ser、和Ile取代第20位Val的氨基酸序列，

[0288] Pro取代第9位Ser、和Thr取代第30位Ser的氨基酸序列，

[0289] Pro取代第9位Ser、和Lys取代第38位Arg的氨基酸序列，

[0290] Pro取代第9位Ser、和Lys取代第46位Glu的氨基酸序列，

[0291] Pro取代第9位Ser、和Val取代第86位Leu的氨基酸序列，

[0292] Pro取代第9位Ser、和Thr取代第93位Val的氨基酸序列，

[0293] Pro取代第9位Ser、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，

[0294] Pro取代第9位Ser、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0295] Ile取代第20位Val、和Thr取代第30位Ser的氨基酸序列，

[0296] Ile取代第20位Val、和Lys取代第38位Arg的氨基酸序列，

[0297] Ile取代第20位Val、和Lys取代第46位Glu的氨基酸序列，

[0298] Ile取代第20位Val、和Val取代第86位Leu的氨基酸序列，

[0299] Ile取代第20位Val、和Thr取代第93位Val的氨基酸序列，

[0300] Ile取代第20位Val、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，

[0301] Ile取代第20位Val、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0302] Thr取代第30位Ser、和Lys取代第38位Arg的氨基酸序列，

[0303] Thr取代第30位Ser、和Lys取代第46位Glu的氨基酸序列，

[0304] Thr取代第30位Ser、和Val取代第86位Leu的氨基酸序列，

[0305] Thr取代第30位Ser、和Thr取代第93位Val的氨基酸序列，

[0306] Thr取代第30位Ser、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，

[0307] Thr取代第30位Ser、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0308] Lys取代第38位Arg、和Lys取代第46位Glu的氨基酸序列，

[0309] Lys取代第38位Arg、和Val取代第86位Leu的氨基酸序列，

[0310] Lys取代第38位Arg、和Thr取代第93位Val的氨基酸序列，

[0311] Lys取代第38位Arg、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，

[0312] Lys取代第38位Arg、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0313] Lys取代第46位Glu、和Val取代第86位Leu的氨基酸序列，

[0314] Lys取代第46位Glu、和Thr取代第93位Val的氨基酸序列，

[0315] Lys取代第46位Glu、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，

[0316] Lys取代第46位Glu、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0317] Val取代第86位Leu、和Thr取代第93位Val的氨基酸序列，

[0318] Val取代第86位Leu、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，

[0319] Val取代第86位Leu、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

[0320] Thr取代第93位Val、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，

[0321] Thr取代第93位Val、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，和

[0322] Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列。

[0323] 在SEQ ID NO:71表示的氨基酸序列中导入一个修饰的VH的氨基 酸序列的具体例子包括下列氨基酸序列：

[0324] Ile取代第2位Val的氨基酸序列，

[0325] Pro取代第9位Ser的氨基酸序列，

[0326] Ile取代第20位Val的氨基酸序列，

[0327] Thr取代第30位Ser的氨基酸序列，

[0328] Lys取代第38位Arg的氨基酸序列，

[0329] Lys取代第46位Glu的氨基酸序列，

[0330] Val取代第86位Leu的氨基酸序列，

[0331] Thr取代第93位Val的氨基酸序列，

[0332] Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，和

[0333] Leu取代第116位Val的氨基酸序列。

[0334] 关于抗体的VL，优选的例子包括：

[0335] 包含SEQ ID NO:72表示的氨基酸序列中第15位Val、第43位Ala、第44位Pro、第71位Phe、和第87位Tyr被其它氨基酸残基取代的氨基酸序列的人源化抗体

[0336] 包含SEQ ID NO:72表示的氨基酸序列中第15位Val、第71位Phe和第87位Tyr被其它氨基酸残基取代的氨基酸序列的人源化抗体，等等。

[0337] 通过上述氨基酸修饰得到的抗体的VL的氨基酸序列包括，例如，在SEQ ID NO:72表示的氨基酸序列中导入选自Thr取代第8位Pro、Leu取代第15位Val、Arg取代第38位Gln、Thr取代第43位Ala、Val取代第44位Pro、Tyr取代第71位Phe、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸修饰中的至少一个修饰的氨基酸序列。

[0338] 导入七个修饰的VL的氨基酸序列的具体例子包括：在SEQ ID NO:72表示的氨基酸序列中导入Thr取代第8位Pro、Leu取代第15位Val、Arg取代第38位Gln、Thr取代第43位Ala、Val取代第44位Pro、Tyr取代第71位Phe、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列。

[0339] 在SEQ ID NO:72表示的氨基酸序列中导入六个修饰的VL的氨基酸序列的具体例子包括下列氨基酸序列：

[0340] Leu取代第15位Val、Arg取代第38位Gln、Thr取代第43位Ala、Val取代第44位Pro、Tyr取代第71位Phe、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，

[0341] Thr取代第8位Pro、Arg取代第38位Gln、Thr取代第43位Ala、Val取代第44位Pro、Tyr取代第71位Phe、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，

[0342] Thr取代第8位Pro、Leu取代第15位Val、Thr取代第43位Ala、Val取代第44位Pro、Tyr取代第71位Phe、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，

[0343] Thr取代第8位Pro、Leu取代第15位Val、Arg取代第38位Gln、Val取代第44位Pro、Tyr取代第71位Phe、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，

[0344] Thr取代第8位Pro、Leu取代第15位Val、Arg取代第38位Gln、Thr取代第43位Ala、Tyr取代第71位Phe、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，

[0345] Thr取代第8位Pro、Leu取代第15位Val、Arg取代第38位Gln、Thr取代第43位Ala、Val取代第44位Pro、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，和

[0346] Thr取代第8位Pro、Leu取代第15位Val、Arg取代第38位Gln、Thr取代第43位Ala、Val取代第44位Pro、和Tyr取代第71位Phe的氨基酸序列。

[0347] 在SEQ ID NO:72表示的氨基酸序列中导入五个修饰的VL的氨基酸序列的具体例子包括下列氨基酸序列：

[0348] Arg取代第38位Gln、Thr取代第43位Ala、Val取代第44位Pro、Tyr取代第71位Phe、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，

[0349] Leu取代第15位Val、Thr取代第43位Ala、Val取代第44位Pro、 Tyr取代第71位Phe、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，

[0350] Leu取代第15位Val、Arg取代第38位Gln、Val取代第44位Pro、Tyr取代第71位Phe、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，

[0351] Leu取代第15位Val、Arg取代第38位Gln、Thr取代第43位Ala、Tyr取代第71位Phe、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，

[0352] Leu取代第15位Val、Arg取代第38位Gln、Thr取代第43位Ala、Val取代第44位Pro、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，

[0353] Leu取代第15位Val、Arg取代第38位Gln、Thr取代第43位Ala、Val取代第44位Pro、和Tyr取代第71位Phe的氨基酸序列，

[0354] Thr取代第8位Pro、Thr取代第43位Ala、Val取代第44位Pro、Tyr取代第71位Phe、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，

[0355] Thr取代第8位Pro、Arg取代第38位Gln、Val取代第44位Pro、Tyr取代第71位Phe、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，

[0356] Thr取代第8位Pro、Arg取代第38位Gln、Thr取代第43位Ala、Tyr取代第71位Phe、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，

[0357] Thr取代第8位Pro、Arg取代第38位Gln、Thr取代第43位Ala、Val取代第44位Pro、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，

[0358] Thr取代第8位Pro、Arg取代第38位Gln、Thr取代第43位Ala、Val取代第44位Pro、和Tyr取代第71位Phe的氨基酸序列，

[0359] Thr取代第8位Pro、Leu取代第15位Val、Val取代第44位Pro、Tyr取代第71位Phe、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，

[0360] Thr取代第8位Pro、Leu取代第15位Val、Thr取代第43位Ala、Tyr取代第71位Phe、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，

[0361] Thr取代第8位Pro、Leu取代第15位Val、Thr取代第43位Ala、Val取代第44位Pro、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，

[0362] Thr取代第8位Pro、Leu取代第15位Val、Thr取代第43位Ala、Val取代第44位Pro、和Tyr取代第71位Phe的氨基酸序列，

[0363] Thr取代第8位Pro、Leu取代第15位Val、Arg取代第38位Gln、Tyr取代第71位Phe、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，

[0364] Thr取代第8位Pro、Leu取代第15位Val、Arg取代第38位Gln、 Val取代第44位Pro和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，

[0365] Thr取代第8位Pro、Leu取代第15位Val、Arg取代第38位Gln、Val取代第44位Pro、和Tyr取代第71位Phe的氨基酸序列，

[0366] Thr取代第8位Pro、Leu取代第15位Val、Arg取代第38位Gln、Thr取代第43位Ala、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，

[0367] Thr取代第8位Pro、Leu取代第15位Val、Arg取代第38位Gln、Thr取代第43位Ala、和Tyr取代第71位Phe的氨基酸序列，和

[0368] Thr取代第8位Pro、Leu取代第15位Val、Arg取代第38位Gln、Thr取代第43位Ala、和Val取代第44位Pro的氨基酸序列。

[0369] 在SEQ ID NO:72表示的氨基酸序列中导入四个修饰的VL的氨基酸序列的具体例子包括下列氨基酸序列：

[0370] Leu取代第15位Val、Val取代第44位Pro、Tyr取代第71位Phe、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，

[0371] Leu取代第15位Val、Thr取代第43位Ala、Tyr取代第71位Phe、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，

[0372] Leu取代第15位Val、Arg取代第38位Gln、Tyr取代第71位Phe、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，

[0373] Thr取代第8位Pro、Leu取代第15位Val、Tyr取代第71位Phe、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，等等。

[0374] 在SEQ ID NO:72表示的氨基酸序列中导入三个修饰的VL的氨基酸序列的具体例子包括下列氨基酸序列：

[0375] Thr取代第8位Pro、Leu取代第15位Val、和Tyr取代第71位Phe的氨基酸序列，

[0376] Thr取代第8位Pro、Leu取代第15位Val、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，

[0377] Thr取代第8位Pro、Tyr取代第71位Phe、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，

[0378] Leu取代第15位Val、Arg取代第38位Gln、和Tyr取代第71位 Phe的氨基酸序列，

[0379] Leu取代第15位Val、Arg取代第38位Gln、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，

[0380] Leu取代第15位Val、Thr取代第43位Ala、和Tyr取代第71位Phe的氨基酸序列，

[0381] Leu取代第15位Val、Thr取代第43位Ala、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，

[0382] Leu取代第15位Val、Val取代第44位Pro、和Tyr取代第71位Phe的氨基酸序列，

[0383] Leu取代第15位Val、Val取代第44位Pro、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，

[0384] Leu取代第15位Val、Tyr取代第71位Phe、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，

[0385] Arg取代第38位Gln、Tyr取代第71位Phe、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，

[0386] Thr取代第43位Ala、Tyr取代第71位Phe、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，

[0387] Val取代第44位Pro、Tyr取代第71位Phe、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，等等。

[0388] 在SEQ ID NO:72表示的氨基酸序列中导入两个修饰的VL的氨基酸序列的具体例子包括下列氨基酸序列：

[0389] Thr取代第8位Pro、和Leu取代第15位Val的氨基酸序列，

[0390] Thr取代第8位Pro、和Arg取代第38位Gln的氨基酸序列，

[0391] Thr取代第8位Pro、和Thr取代第43位Ala的氨基酸序列，

[0392] Thr取代第8位Pro、和Val取代第44位Pro的氨基酸序列，

[0393] Thr取代第8位Pro、和Tyr取代第71位Phe的氨基酸序列，

[0394] Thr取代第8位Pro、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，

[0395] Leu取代第15位Val、和Arg取代第38位Gln的氨基酸序列，

[0396] Leu取代第15位Val、和Thr取代第43位Ala的氨基酸序列，

[0397] Leu取代第15位Val、和Val取代第44位Pro的氨基酸序列，

[0398] Leu取代第15位Val、和Tyr取代第71位Phe的氨基酸序列，

[0399] Leu取代第15位Val、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，

[0400] Arg取代第38位Gln、和Thr取代第43位Ala的氨基酸序列，

[0401] Arg取代第38位Gln、和Val取代第44位Pro的氨基酸序列，

[0402] Arg取代第38位Gln、和Tyr取代第71位Phe的氨基酸序列，

[0403] Arg取代第38位Gln、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，

[0404] Thr取代第43位Ala、和Val取代第44位Pro的氨基酸序列，

[0405] Thr取代第43位Ala、和Tyr取代第71位Phe的氨基酸序列，

[0406] Thr取代第43位Ala、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，

[0407] Val取代第44位Pro、和Tyr取代第71位Phe的氨基酸序列，

[0408] Val取代第44位Pro、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，

[0409] Tyr取代71位Phe、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列。

[0410] 在SEQ ID NO:72表示的氨基酸序列中导入一个修饰的VL的氨基酸序列的具体例子包括下列氨基酸序列：

[0411] Thr取代第8位Pro的氨基酸序列，

[0412] Leu取代第15位Val的氨基酸序列，

[0413] Arg取代第38位Gln的氨基酸序列，

[0414] Thr取代第43位Ala的氨基酸序列，

[0415] Val取代第44位Pro的氨基酸序列，

[0416] Tyr取代第71位Phe的氨基酸序列，

[0417] Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列。

[0418] 另外，本发明的人源化抗体的具体例子还包括：抗体的VH包含SEQ ID NO:71表示的氨基酸序列和/或抗体的VL包含SEQ ID NO:72表示的氨基酸序列的人源化抗体；抗体的VH包含SEQ ID NO:76表示的氨基酸序列和/或抗体的VL包含SEQ ID NO:72表示的氨基酸序列的人源化抗体；抗体的VH包含SEQ ID NO:78表示的氨基酸序列和/或抗体的VL包含SEQ ID NO:72表示的氨基酸序列的人源化抗体；抗体 的VH包含SEQ ID NO:80表示的氨基酸序列和/或抗体的VL包含SEQ ID NO:72表示的氨基酸序列的人源化抗体；抗体的VH包含SEQ ID NO:82表示的氨基酸序列和/或抗体的VL包含SEQ ID NO:72表示的氨基酸序列的人源化抗体；抗体的VH包含SEQ ID NO:71表示的氨基酸序列和/或抗体的VL包含SEQ ID NO:84表示的氨基酸序列的人源化抗体；抗体的VH包含SEQ ID NO:76表示的氨基酸序列和/或抗体的VL包含SEQ ID NO:84表示的氨基酸序列的人源化抗体；抗体的VH包含SEQ ID NO:78表示的氨基酸序列和/或抗体的VL包含SEQ ID NO:84表示的氨基酸序列的人源化抗体；抗体的VH包含SEQ ID NO:80表示的氨基酸序列和/或抗体的VL包含SEQ ID NO:84表示的氨基酸序列的人源化抗体；抗体的VH包含SEQ ID NO:82表示的氨基酸序列和/或抗体的VL包含SEQ ID NO:84表示的氨基酸序列的人源化抗体等等。

[0419] 人类抗体本来是人体中天然存在的抗体，它还包括从人类抗体噬菌体文库或产生人类抗体的转基因动物得到的抗体，所述噬菌体文库或转基因动物是基于遗传工程、细胞工程和发育工程的新进展技术制备的。

[0420] 举例而言，人体中存在的抗体可以如下制备：分离人外周血淋巴细胞，用EB病毒等感染使其永生化，然后将其克隆从而得到能够生产所述抗体的淋巴细胞，培养这样得到的淋巴细胞，和从培养物的上清液提纯所述抗体。

[0421] 人类抗体噬菌体文库是通过将从人类B细胞制备的编码抗体的基因插入到噬菌体基因中，而在噬菌体表面上表达抗体片段例如Fab和scFv的文库。表达具有所需抗原结合活性的抗体片段的噬菌体，可以利用它与固定有抗原的基质的结合活性作为指标，从文库中回收。抗体片段可以通过遗传工程技术进一步转变为含有两条完整的H链和两条完整的L链的人类抗体分子。

[0422] 产生人类抗体的转基因动物是细胞中整合了人类抗体基因的动物。具体来说，产生人类抗体的转基因动物可以如下制备：将编码人类抗体的基因导入到小鼠ES细胞中，将ES细胞移植到另一只小鼠的早期胚胎中，然后使其发育。人类抗体可以从产生人类抗体的转基因非人类动物如下制备：通过通常在非人类哺乳动物中进行的杂交瘤制备方法获得产生人类抗体的杂交瘤，将获得的杂交瘤进行培养，并在培养上清液中形成和积累人类抗体。

[0423] 在构成上述的抗体或抗体片段的氨基酸序列中，其中一个或多个氨基酸被缺失、取代、插入或添加、但仍与上述抗体或其抗体片段具有相似活性的抗体或其抗体片段，也包括在本发明的抗体或抗体片段中。

[0424] 被缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸数量是一个或多个，没有具体的限制，但是它在通过已知方法例如位点定向诱变位点有可能进行缺失、取代或添加的范围内，所述方法定向诱变描述在[Molecular Cloning，Second Edition（分子克隆，第二版）,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989);Current Protocols in Molecular Biology（现代分子生物学技术）,John Wiley & Sons(1987-1997);Nucleic Acids Research,10,6487(1982),Proc.Natl.Acad Sci USA,79,6409(1982);Gene,34,315(1985),Nucleic Acids Research,13,4431(1985);Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,488(1985)]等中。例如，数量为1到几十个，优选为1到20个，更优选为1到10个，最优选为1到5个。

[0425] 上述抗体的氨基酸序列中“一个或多个氨基酸残基被缺失、取代、插入或添加”的表述意义如下。即，它意味着在同一序列和一个或多个氨基酸序列中的任选位置上，存在着一个或多个氨基酸的缺失、取代、插入或添加。此外，缺失、取代、插入或添加可以同时发生，被取代、插入或添加的氨基酸可以是天然类型或非天然类型的。天然类型的氨基酸包括L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨 酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-半胱氨酸等。

[0426] 可互相取代的氨基酸的优选例子显示在下面。同样组中的氨基酸可以互相取代。

[0427] A组：亮氨酸，异亮氨酸，正亮氨酸，缬氨酸，正缬氨酸，丙氨酸，2-氨基丁酸，甲硫氨酸，O-甲基丝氨酸，叔丁基甘氨酸，叔丁基丙氨酸，环己基丙氨酸

[0428] B组：天冬氨酸，谷氨酸，异天冬氨酸，异谷氨酸，2-氨基己二酸，2-氨基辛二酸[0429] C组：天冬酰胺，谷氨酰胺

[0430] D组：赖氨酸，精氨酸，鸟氨酸，2,4-二氨基丁酸，2,3-二氨基丙酸

[0431] E组：脯氨酸，3-羟基脯氨酸，4-羟基脯氨酸

[0432] F组：丝氨酸，苏氨酸，高丝氨酸

[0433] G组：苯丙氨酸，酪氨酸

[0434] 本发明的抗体片段包括Fab、F(ab')2、Fab'、scFv、双抗体、dsFv、包含CDR的肽等。

[0435] Fab是具有大约50,000的分子量并具有抗原结合活性的抗体片段，其中在蛋白酶——木瓜蛋白酶（在H链的224位切开氨基酸残基）处理IgG抗体分子获得的片段中，H链的大约一半N-端侧和整个L链通过二硫键结合在一起。本发明的Fab可以通过用木瓜蛋白酶处理特异性识别ASCT2的细胞外区域的三维结构并与所述细胞外区域结合的单克隆抗体而产生。此外，Fab也可以通过将编码抗体的Fab的DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中，并将载体导入到原核生物或真核生物中以表达Fab来生产。

[0436] F(ab')2是具有大约100,000分子量并具有抗原结合活性的抗体片段，并包含通过用酶---胃蛋白酶消化IgG的绞链区中两个二硫键的下半部而得到的、在所述铰链位置中结合的两个Fab区。本发明的F(ab')2可以通过用胃蛋白酶处理特异性识别ASCT2的细胞外区域的三维结构并与所述细胞外区域结合的单克隆抗体而产生。F(ab')2还可以通过硫醚键或二硫键结合下述的Fab'而制备。

[0437] Fab'是具有大约50,000分子量和抗原结合活性的抗体片段，是通过切开上述F(ab')2的铰链区中的二硫键得到的。本发明的Fab'可以通过用还原剂例如二硫苏糖醇处理特异性识别ASCT2的细胞外区域的三维结构并与所述细胞外区域结合的F(ab')2来生产。此外，Fab'也可以通过将编码抗体的Fab'片段的DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中、并将载体导入到原核生物或真核生物中以表达Fab'来生产。

[0438] scFv是其中一条VH链和一条VL链使用适当的肽接头（在后文中称为“P”）连接在一起的VH-P-VL或VL-P-VH多肽，并且是具有抗原结合活性的抗体片段。本发明的scFv可以如下生产：获得特异性识别ASCT2的细胞外区域的三维结构并与所述细胞外区域结合的单克隆抗体的VH和VL的编码cDNA，构建编码scFv的DNA，将所述DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中，然后将表达载体导入到原核生物或真核生物中以表达scFv。

[0439] 双抗体是其中scFvs被二聚体化的抗体片段，是具有二价抗原结合活性的抗体片段。两个抗原在二价抗原结合活性方面可以相同或不同的。本发明的双抗体可以如下生产：获得特异性识别ASCT2的细胞外区域的三维结构并与所述细胞外区域结合的单克隆抗体的VH和VL的编码cDNA，构建编码scFv的DNA使得蛋白接头的氨基酸序列长度是8个残基以下，将所述DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表 达载体中，然后将表达载体导入到原核生物或真核生物中以表达双抗体。

[0440] dsFv是通过将VH和VL的各一个氨基酸残基被半胱氨酸残基取代的多肽经半胱氨酸残基之间的二硫键连接在一起而获得的。用半胱氨酸残基取代的氨基酸残基，可以按照已知的方法（Protein Engineering, 7,697-704(1994)），根据抗体的三维结构预测进行选择。本发明的dsFv可以如下生产：获得特异性识别ASCT2的细胞外区域的三维结构并与所述细胞外区域结合的单克隆抗体的VH和VL的编码cDNA，构建编码dsFv的DNA，将所述DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中，然后将表达载体导入到原核生物或真核生物中以表达dsFv。

[0441] 包含CDR的肽通过包含VH或VL的一个或多个CDR而构成。包含多个CDR的肽可以直接或通过适当的肽接头结合。本发明的含有CDR的肽，可以如下生产：构建特异性识别ASCT2的细胞外区域的三维结构并与所述细胞外区域结合的单克隆抗体的VH和VL的CDR的编码DNA，将所述DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中，然后将表达载体导入到原核生物或真核生物中以表达肽。含有CDR的肽也可以通过化学合成方法例如Fmoc法或tBoc法来生产。

[0442] 本发明的单克隆抗体包括抗体结合物，其中特异性识别ASCT2的细胞外区域的三维结构并与所述细胞外区域结合的单克隆抗体或其抗体片段与放射性同位素、低分子药剂、高分子量药剂、蛋白质、治疗抗体等用化学或遗传学手段进行结合。

[0443] 本发明的抗体结合物可以如下产生：用化学手段将放射性同位素、低分子药剂、高分子量药剂、蛋白质、治疗抗体等与本发明的特异性识别ASCT2的细胞外区域的三维结构并与所述细胞外区域结合的单克隆抗体或其抗体片段的H链或L链的N末端侧或C末端侧、所述抗体或抗体片段的适当的取代基或侧链、所述抗体或抗体片段中的糖链等 结合[抗体工学入门，地人书馆(1994)]。

[0444] 所述抗体结合物还可以通过遗传学手段产生：将本发明中特异性识别ASCT2的细胞外区域的三维结构并与所述细胞外区域结合的单克隆抗体或其抗体片段的编码DNA与待结合的另一种编码蛋白质或治疗抗体的DNA连接，将所述DNA插入表达载体，并将所述表达载体导入适当的宿主细胞。

[0445] 放射性同位素包括131I、125I、90Y、64Cu、199Tc、77Lu、211At等。放射性同位素可以通过氯胺-T方法等与所述抗体结合。螯合放射性同位素的物质还可以与抗体结合。螯合剂包括1-异硫氰酸基并苯甲基-3-甲基二亚乙基-三胺五乙酸(MX-DTPA)等等。

[0446] 低分子药剂包括：抗肿瘤剂例如烷基化剂，亚硝基脲剂，代谢拮抗剂，抗生素物质，来源于植物的生物碱，拓扑异构酶抑制剂，激素疗法药剂，激素拮抗剂，芳香化酶抑制剂，P糖蛋白抑制剂，铂复合物衍生物，M期抑制剂和激酶抑制剂[临床肿瘤学，癌症化学疗法社(1996)]，类固醇剂例如氢化可的松和泼尼松龙，非类固醇药剂例如阿司匹林和吲哚美辛，免疫调节剂例如金硫代苹果酸盐，青霉胺，免疫抑制剂例如环磷酰胺和硫唑嘌呤，抗炎剂例如抗组胺剂，例如马来酸氯苯那敏和氯马斯汀[炎症和抗炎症疗法，医齿药出版株式会社(1982)]等。抗肿瘤剂的例子包括阿米福汀（Ethyol）、顺铂、达卡巴嗪（DTIC）、更生霉素、氮芥（氮芥子气）、链脲佐菌素、环磷酰胺、异环磷酰胺、卡莫司汀（BCNU）、洛莫司汀（CCNU）、多柔比星（亚德里亚霉素）、表柔比星、吉西他滨（Gemsal）、柔红霉素、丙卡巴肼、丝裂霉素、阿糖胞苷、依托泊苷、氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶、氟尿嘧啶、长春花碱、长春新碱、博来霉素、道诺霉素、培洛霉素、雌氮芥、紫杉醇（泰素）、多烯紫衫醇（泰素帝）、阿地白介素、天冬酰胺酶、白消安、卡铂、奥沙利铂、奈达铂、克拉曲滨、喜树碱、10-羟基-7-乙基喜树碱（SN38）、氟尿苷、氟达拉滨、羟基脲、异环磷酰胺、伊达比星、美司那、伊立 替康（CPT-11）、盐酸拓扑替康、米托蒽醌、拓扑替康、亮丙瑞林、甲地孕酮、美法仑、巯基嘌呤、羟基脲（hydroxycarbamide）、普卡霉素、米托坦、培门冬酶、戊制菌素、哌泊溴烷、链脲霉素、他莫昔芬、戈舍瑞林、亮丙瑞林、氟他胺、替尼泊苷、睾内酯、硫鸟嘌呤、硫替哌、尿嘧啶氮芥、长春瑞宾、苯丁酸氦芥、氢化可的松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、长春地辛、尼莫司汀、司莫司汀、卡培他滨、雷替曲塞、氮胞苷、UFT、奥沙利铂、吉非替尼（易瑞沙）、伊马替尼（STI 571）、埃罗替尼、FMS-样酪氨酸激酶3（Flt3）抑制剂、血管内皮生长因子受体（VEGFR）抑制剂、成纤维细胞生长因子受体（FGFR）抑制剂、表皮生长因子受体（EGFR）抑制剂例如易瑞沙和特罗凯、根赤壳菌素、17-烯丙基氨基-17-去甲氧基格尔德霉素、雷帕霉素、安丫啶、全反式视黄酸、沙利度胺、来那度胺、阿那曲唑、法曲唑、来曲唑、依西美坦、硫代苹果酸金、D-青霉胺、布西拉明、硫唑嘌呤、咪唑立宾、环孢霉素、雷帕霉素、氢化可的松、蓓萨罗丁（塔革雷汀）、他莫昔芬、地塞米松、孕激素物质、雌激素物质、阿那曲唑（瑞宁得）、来普隆、阿司匹林、吲哚美辛、塞来考昔、硫唑嘌呤、青霉胺、硫代苹果酸金、马来酸氯苯那敏、氯苯那敏、氯马斯汀、维A酸、蓓萨罗丁、砷、voltezomib、别嘌呤醇、加里刹霉素、替伊莫单抗、塔革雷汀、奥唑米星、克拉霉素、甲酰四氢叶酸、异环磷酰胺、酮康唑、氨鲁米特、苏拉明、氨甲蝶呤、美登醇及其衍生物等。

[0447] 将低分子药剂与抗体结合的方法包括：所述药剂与抗体的氨基通过戊二醛结合的方法，所述药剂的氨基与抗体的羧基通过水溶性碳二亚胺连接的方法，等等。

[0448] 高分子药剂包括聚乙二醇(以下称为“PEG”)、白蛋白、葡聚糖、聚氧乙烯、苯乙烯-马来酸共聚物、聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、羟丙基甲基丙烯酰胺等等。通过将这些高分子化合物与抗体或抗体片段结合，预期有下列作用：(1)提高对各种化学、物理或生物因子的稳定性；(2)显著延长血液半衰期；(3)免疫原性消失，抑制抗体产生；等等[生物 结合物药物，广川书店(1993)]。例如，将PEG与抗体结合的方法包括使抗体与PEG修饰试剂反应[生物结合物药物，广川书店(1993)]。PEG修饰试剂包括赖氨酸的ε-氨基的修饰剂(特开昭61-178926)、天冬氨酸和谷氨酸的羧基的修饰剂(特开昭56-23587)、精氨酸的胍基的修饰剂(特开平2-117920)等。

[0449] 免疫刺激剂可以是任何被称为免疫佐剂的天然产物。增强免疫原的药剂的例子包括β(1→3)葡聚糖（香菇多糖，裂裥菌素）、α-半乳糖苷神经酰胺（KRN7000）等。

[0450] 蛋白质包括激活免疫活性细胞例如NK细胞、巨噬细胞或中性粒细胞的细胞因子或生长因子；毒性蛋白等等。

[0451] 细胞因子或生长因子的例子包括干扰素（在后文中称为“INF”）-α、INF-β、INF-γ、白介素（后文称为“IL”）-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）等。毒性蛋白包括篦麻毒素、白喉毒素、ONTAK等，还包括在蛋白中导入突变以便控制毒性的毒性蛋白。

[0452] 治疗性抗体包括针对通过结合抗体诱导凋亡的抗原的抗体、针对参与肿瘤的病态形成的抗原的抗体、调节免疫功能的抗体、以及与病变部位中血管生成有关的抗体。

[0453] 与抗体的结合诱导凋亡的抗原包括分化簇（在后文中称为“CD”）19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD53、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CDw78、CD79a、CD79b、CD80（B7.1）、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85、CD86（B7.2）、II类人类白细胞抗原（HLA）、表皮生长因子受体（EGFR），等等。

[0454] 参与肿瘤病态形成的抗原或调节免疫功能的抗体的抗原包括CD4、CD40、CD40配体、B7家族分子（CD80、CD86、CD274、B7-DC、B7-H2、B7-H3、B7-H4）、B7家族分子的配体（CD28、CTLA-4、ICOS、PD-1、BTLA）、OX-40、OX-40配体、CD137、肿瘤坏死因子（TNF）受体家族分子（DR4、DR5、TNFR1、TNFR2）、诱导TNF相关的凋亡的配体受体（TRAIL）家族分子、TRAIL家族分子的受体家族（TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRAIL-R3、TRAIL-R4）、核因子κB配体（RANK）的受体激活剂、RANK配体、CD25、叶酸受体4、细胞因子[IL-1α、IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、转化生长因子（TGF）β、TNFα，等等]、这些细胞因子的受体、趋化因子（SLC、ELC、I-309、TARC、MDC、CTACK等）以及这些趋化因子的受体。

[0455] 在病变部位抑制血管生成的抗体的抗原包括血管内皮生长因子（VEGF）、促血管生成素、成纤维细胞生长因子（FGF）、EGF、血小板衍生的生长因子（PDGF）、胰岛素样生长因子（IGF）、促红细胞生成素（EPO）、TGFβ、IL-8、Ephilin、SDF-1、它们的受体，等等。

[0456] 带有蛋白质或治疗抗体的融合抗体可以如下生产：将编码单克隆抗体或抗体片段的cDNA与编码蛋白质的cDNA连接，构建编码融合抗体的DNA，将所述DNA插入原核生物或真核生物的表达载体，然后将所述表达载体导入原核生物或真核生物以表达融合抗体。

[0457] 在上述抗体结合物在本发明中用于检测方法、定量测定方法、检测试剂、定量测定试剂或诊断试剂的情况下，特异性识别ASCT2的细胞外区域的三维结构并与所述细胞外区域结合的单克隆抗体或其抗体片段所结合的药剂的例子包括用于常规免疫检测或测量方法的标记物。所述标记物包括酶例如碱性磷酸酶、过氧化物酶和荧光素酶，发光物质例如吖啶酯和洛芬碱，荧光物质例如异硫氰酸荧光素(FITC)和四甲基若丹明异硫氰酸酯(RITC)，等等。

[0458] 此外，本发明包括抑制由ASCT2细胞内摄取氨基酸的单克隆抗体，和其抗体片段。

[0459] 本发明的抗体或其抗体片段对由ASCT2介导细胞内摄取氨基酸的抑制活性的评价方法的例子包括：使抗体或其抗体片段与表达ASCT2的正常或癌细胞反应，然后利用活细胞计数试剂等评价谷氨酰胺依赖性增殖的抑制[J Surgical Research,90,149(2000)]；使抗体或其抗体片段与表达ASCT2的正常或癌细胞反应，然后利用适当的设备例
如闪烁计数器评价氨基酸例如放射性物质标记的丙氨酸的摄取的抑制[J. Biol
Chem.,271,14883(1996)]，等等。

[0460] 另外，本发明包括具有细胞毒性例如补体依赖性细胞毒性(CDC)活性或抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC活性)的单克隆抗体和其抗体片段。

[0461] 本发明的抗体或其抗体片段对抗原阳性细胞系的CDC活性或ADCC活性可以通过已知的测定法进行评价[Cancer Immunol Immunother,36,373(1993)]。

[0462] 此外，本发明包括具有凋亡诱导活性的单克隆抗体，和其抗体片段。

[0463] 此外，本发明包括不与小鼠ASCT2结合、但是与人ASCT2结合的单克隆抗体，和其抗体片段。

[0464] 此外，本发明包括与人ASCT2的细胞外区域中至少EL2区域结合的单克隆抗体和其抗体片段，例如，与选自SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列中154、159至160、163至171、173至174、177、188、204至205、207、210至212、和214至223处的氨基酸中的至少任何一个氨基酸结合的单克隆抗体和其抗体片段。

[0465] 本发明的抗体或其抗体片段的结合特异性可以通过已知的表位分析法评价，例如根据氨基酸序列信息，测量与其中适当的位点被小鼠ASCT2的序列置换的人/小鼠嵌合ASCT2的结合活性。

[0466] 本发明还涉及与ASCT2有关的疾病的治疗药，其包含特异性识别ASCT2的细胞外区域的三维结构并与所述细胞外区域结合的单克隆抗体或其抗体片段作为活性成分。

[0467] 与ASCT2有关的疾病没有限制，只要它是与表达ASCT2的细胞有关的疾病即可，例如癌症。

[0468] 癌症包括血液癌、乳腺癌、子宫癌、大肠癌、食道癌、胃癌、卵巢癌、肺癌、肾癌、直肠癌、甲状腺癌、子宫颈癌、小肠癌、前列腺癌和胰腺癌。优选的癌症例子包括血液癌、食道癌、胃癌、大肠癌、肝癌和前列腺癌。血液癌的例子包括骨髓性白血病、淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、霍奇金氏（Hodgkin’s）淋巴瘤和非霍奇氏金淋巴瘤。

[0469] 本发明的治疗药包括包含本发明的上述单克隆抗体或抗体片段作为活性成分的治疗药。

[0470] 包含本发明的抗体或其抗体片段、或其结合物的治疗药可以只包含所述抗体或其抗体片段、或其结合物作为活性成分。通常优选治疗药制备成通过在制药技术领域中众所周知的适当方法并通过将其与一种或多种药用可接受的载体混合而生产的药物制剂。

[0471] 优选通过治疗最有效的途径施用所述治疗药。实例包括经口给药和肠胃外给药，例如经颊、气管、直肠、皮下、肌内或静脉内给药，优选静脉内给药。

[0472] 治疗药可以是喷雾剂、胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、乳剂、栓剂、注射剂、软膏、带剂（tape）等的形式。

[0473] 虽然给药剂量或频率根据目标治疗效果、给药方法、治疗时间、年龄、体重等而异，但通常是成人每天10μg/kg至8mg/kg。

[0474] 此外，本发明涉及免疫学检测或测量ASCT2的方法、免疫学检测或测量ASCT2的试剂、免疫学检测或测量表达ASCT2的细胞的方法和诊断与ASCT2有关的疾病的诊断试剂，它们包含特异性识别ASCT2的细胞外区域的天然三维结构并与所述细胞外区域结合的单克隆抗体或其抗体片段作为活性成分。

[0475] 在本发明中，检测或测量ASCT2量的方法可以是任何已知的方法。例如，包括免疫检测或测量方法。

[0476] 免疫学检测或测量方法是利用标记抗原或抗体来检测或确定抗体量或抗原量的方法。免疫学检测或测量方法的实例包括放射性物质标记的免疫抗体法(RIA)、酶免疫分析(EIA或ELISA)、荧光免疫分析(FIA)、发光免疫分析、Western印迹法、物理化学方法等。

[0477] 与ASCT2有关的上述疾病可以通过利用本发明的单克隆抗体或抗体片段来检测或测量表达ASCT2的细胞进行诊断。

[0478] 至于检测表达ASCT2的细胞，可以使用已知的免疫学检测方法，并优选使用免测沉淀法、荧光细胞染色法、免疫组织染色法等。利用FMAT 8100 HTS系统(Applied Biosystem)的荧光抗体染色法等也可以使用。

[0479] 在本发明中，用于检测或测量ASCT2的生物体样品没有特别的限 制，只要它可能含有表达ASCT2的细胞即可，所述样品例如组织细胞、血液、血浆、血清、胰液、尿、粪便、组织液或培养液。

[0480] 含有单克隆抗体或其抗体片段、或其结合物的诊断试剂还可以根据目的诊断法包含用于执行抗原-抗体反应的试剂或用于检测所述反应的试剂。执行抗原-抗体反应的试剂包括缓冲液、盐等等。检测试剂包括通常用于免疫学检测或测量方法的试剂，例如识别所述单克隆抗体、其抗体片段、或结合物的标记第二抗体和与所述标记对应的底物。

[0481] 本发明可提供单克隆抗体或其抗体片段，所述单克隆抗体特异性识别系统ASC氨基酸转运蛋白2(以下称为“ASCT2”)的细胞外区域的天然三维结构并与该细胞外区域结合；产生所述抗体的杂交瘤；编码所述抗体的DNA；包含所述DNA的载体；可通过导入所述载体获得的转化体；利用所述杂交瘤或转化体产生抗体或其抗体片段的方法；和利用所述抗体或其抗体片段的治疗药，以及利用所述抗体或其抗体片段的诊断试剂。。

[0482] 下面具体描述本发明抗体的生产方法、疾病治疗方法和疾病诊断方法。

[0483] 1.单克隆抗体的制备方法

[0484] (1)抗原的制备

[0485] ASCT2或表达ASCT2作为抗原的细胞可通过将包含编码全长ASCT2或其部分长度的cDNA的表达载体导入大肠杆菌（Escherichiacoli）、酵母、昆虫细胞、动物细胞等中而得到。另外，ASCT2可从表达大量ASCT2的各种各样的人类肿瘤细胞系、人类组织等中提纯。可将该肿瘤细胞系和组织用作抗原。此外，具有ASCT2的部分序列的合成肽可通过化学合成方法例如Fmoc法或tBoc法制备并用作抗原。

[0486] 本发明所用的ASCT2可例如通过在宿主细胞中表达编码ASCT2 的DNA进行生产，利用在Molecular Cloning，A Laboratory Manual,Second Edition（分子克隆：实验室手册，第二版）、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989),Current Protocols in Molecular Biology（现代分子生物学技术）、John Wiley & Sons(1987-1997)等中记载的方法如下进行。

[0487] 首先，通过将包含ASCT2编码区的全长cDNA插入到适合的表达载体的启动子下游而制备重组载体。这时，如果需要，具有适当的长度、含有基于全长cDNA的多肽的编码区域的DNA片段，该DNA片段可以代替上述的全长cDNA使用。接下来，通过将重组载体导入适合表达载体的宿主细胞，可以获得产生ASCT2的转化体。

[0488] 表达载体可以是任何表达载体，只要它能够在供使用的宿主细胞中自主复制或者它能够整合到含有适当启动子的染色体中使得编码所述多肽的DNA能够被转录的位置即可。

[0489] 宿主细胞可以是任何细胞，只要它能够表达目的基因即可。例子包括属于大肠杆菌属的微生物、例如大肠杆菌，酵母，昆虫细胞，动物细胞等。

[0490] 当使用原核生物例如大肠杆菌作为宿主细胞时，优选本发明中使用的重组载体在原核生物中可以自主复制，并含有启动子、核糖体结合序列、编码ASCT2的DNA以及转录终止序列。重组载体不必需具有转录终止序列，但是转录终止序列优选设置在紧接结构基因之后。重组载体还可以含有调控启动子的基因。

[0491] 上述重组载体还优选是其中核糖体结合序列Shine-Dalgamo序列与起始密码子之间的间距调整到适当的距离(例如6至18个核苷酸)的质粒。

[0492] 此外，编码ASCT2的DNA的核苷酸序列可以用其它碱基取代，以便成为在宿主细胞中表达的适当密码子，从而改善目的ASCT2的生产率。

[0493] 任何表达载体都可以使用，只要它能够在所用的宿主细胞中发挥功能即可。表达载体的例子包括pBTrp2、pBTac1、pBTac2（都由Roche Diagnostics制造）、pKK233-2（Pharmacia制 造）、pSE280（Invitrogen制 造）、pGEMEX-1（Promega制 造）、pQE-8（QIAGEN制造）、pKYP10（特开昭58-110600）、pKYP200[Agricultural Biological Chemistry,48,669(1984)]、pLSA1[Agric.Biol.Chem.,53,277(1989)]、pGEL1[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,4306(1985)]、pBluescript II SK(-)（Stratagene 制 造）、pTrs30[从大肠杆菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)制备]、pTrs32[从大肠杆菌JM109/pTrS32(FERM BP-5408)制备]、pGHA2[从大肠杆菌IGHA2(FERM BP-400)制备，特开昭60-221091]、pGKA2[从大肠杆菌IGKA2(FERM BP-6798)制备，特开昭60-221091]、pTerm2（US4686191、US4939094、US5160735）、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pEG400[J.Bacteriol.,172,2392(1990)]、pGEX（Pharmacia 制 造）、pET 系 统（Novagen 制 造）、pME18SFL3，等等。

[0494] 任何启动子都可以使用，只要它能够在所使用的宿主细胞中起作用即可。例子包括源自于大肠杆菌、噬菌体等的启动子，例如trp启动子（Ptrp）、lac启动子、PL启动子、PR启动子和T7启动子。此外，人工设计和修饰的启动子也可以使用，例如其中两个Ptrp串联连接的启动子、tac启动子、lacT7启动子和letI启动子。

[0495] 宿主细胞的例子包括大肠杆菌XL1-Blue、大肠杆菌XL2-Blue、大肠杆菌DH1、大肠杆菌MC1000、大肠杆菌KY3276、大肠杆菌W1485、大肠杆菌JM109、大肠杆菌HB101、大肠杆菌No.49、大肠杆菌W3110、大肠杆菌NY49、大肠杆菌DH5α，等等。

[0496] 任何导入重组载体的方法都可以使用，只要它是将DNA导入到宿主细胞中的方法即可，例子包括在Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69,2110(1972)、Gene,17,107(1982)和Molecular & General Genetics,168,111(1979)中记载的使用钙离子的方法，等等。

[0497] 当动物细胞被用作宿主细胞时，可以使用任何表达载体，只要它能够在动物细胞中起作用即可。例子包括pcDNAI、pcDM8（Funakoshi制造）、pAGE107[特开 平 3-22979；Cytotechnology,3,133(1990)]、pAS3-3（特 开 平 2-227075）、pCDM8[Nature,329,840,(1987)]、pcDNAI/Amp（Invitrogen制造）、pcDNA3.1（Invitrogen制造）、pREP4（Invitrogen制造）、pAGE103[J.Biochemistry,101,1307(1987)]、pAGE210、pME18SFL3、pKANTEX93(WO 97/10354)，等等。

[0498] 任何启动子都可以使用，只要它能够在动物细胞中起作用即可。例子包括细胞肥大病毒（CMV）的立即早期（IE）基因的启动子、SV40早期启动子、逆转录病毒的启动子、金属硫蛋白启动子、热休克启动子、SRα启动子等、莫洛尼鼠白血病病毒启动子或增强子等。此外，人类CMV的IE基因的增强子可以与启动子一起使用。

[0499] 宿主细胞包括人类Namalwa细胞、猴COS细胞、中华仓鼠卵巢（CHO）细胞、HST5637（特开昭63-000299）等。

[0500] 任何导入重组载体的方法都可以使用，只要它是用于将DNA导入到动物细胞中的方法即可，例子包括电穿孔[Cytotechnology,3,133(1990)]、磷酸钙法（特开平2-227075）、脂质转染法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,7413(1987)]，等等。

[0501] 将来源于微生物、动物细胞等并具有包含ASCT2编码DNA的重组载体的转化体在培养基中培养，以在培养物中形成和累积ASCT2，并从培养物中回收ASCT2，从而能够生产ASCT2。在培养基中培养转 化体的方法根据用于宿主培养的一般方法执行。

[0502] 当在来源于真核生物的细胞中表达ASCT2时，能够得到结合了糖或糖链的ASCT2。

[0503] 当用含有诱导型启动子的重组载体转化的微生物进行培养时，如果需要，可以在培养基中加入诱导剂。例如，当对使用lac启动子的重组载体转化的微生物进行培养时，可以在培养基中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷等，或者当对使用trp启动子的重组载体转化的微生物进行培养时，可以在其中加入吲哚丙烯酸等。

[0504] 当使用动物细胞作为宿主细胞获得的转化体进行培养时，培养基包括常用的RPMI1640培养基[The Journal of the American Medical Association,199,519(1967)]、Eagle’s MEM 培 养 基 [Science,122,501(1952)]、Dulbecco 改 良 的 MEM 培 养 基[Virology,8,396(1959)]以及199培养基[Proceeding of the Society for the Biology Medicine,73,1(1950)]、Iscoove改良的Dulbecco培养基(IMDM)、添加了胎牛血清等的培养基，等等。培养一般在存在5%CO2的情况下，在pH6到至8和30至40℃下进行1到7天。
如果必要，在培养过程中可以向培养基添加抗生素例如卡那霉素或青霉素。

[0505] 对于ASCT2编码基因的表达方法来说，除了直接表达之外，还可以按照Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Second Edition（分子克隆：实验室手册，第二版）,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)中描述的方法进行分泌生产、融合蛋白表达等[0506] 生产ASCT2的方法包括在宿主细胞中进行细胞内表达的方法、从宿主细胞进行细胞外分泌的方法、在宿主细胞膜外被膜上生产的方法等。适合的方法可以通过改变所使用的宿主细胞和所产生的ASCT2的结构来选择。

[0507] 当在宿主细胞中或宿主细胞膜外被膜上生产ASCT2时，按照Paulson等的 方 法 [J.Biol.Chem.,264,17619(1989)]、Lowe 等 的 方 法 [Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,8227(1989),Genes Develop.,4,1288(1990)]、特开平05-336963和WO 94/23021中描述的方法等，可以将ASCT2主动分泌到细胞外。

[0508] 此外，按照特开平2-27075中描述的方法，利用使用二氢叶酸还原酶基因的基因扩增系统，能够增加ASCT2的生产量。

[0509] 所得的ASCT2可以例如如下进行分离和纯化。

[0510] 当ASCT2以溶解状态在细胞内表达时，细胞在培养后通过离心回收，悬浮在水性缓冲液中，然后使用超声波破碎器、French压力器、Manton Gaulin匀浆器、戴诺磨等进行破碎，以获得无细胞的提取液。将无细胞的提取液进行离心以获得上清液，并通过对上清液进行通用的蛋白分离和纯化技术来获得纯化的制备物，这些技术例如溶剂抽提，使用硫酸铵等进行盐析，脱盐，用有机溶剂沉淀，使用树脂例如二乙氨基乙基（DEAE）-琼脂糖凝胶、DIAION HPA-75（三菱化学社制造）进行阴离子交换层析，使用树脂例如S-琼脂糖凝胶FF（Pharmacia制造）进行阳离子交换层析，使用树脂例如丁基-琼脂糖凝胶或苯基-琼脂糖凝胶进行疏水层析，使用分子筛进行凝胶过滤，亲和层析，层析聚焦，电泳例如等电点聚焦，等等，它们可以单独或组合使用。

[0511] 当ASCT2通过形成包含体在细胞内表达时，将细胞以同样的方式回收、破碎和离心，ASCT2的包含体作为沉淀级分被回收。将回收的蛋白包含体用蛋白变性剂进行增溶。通过对增溶的溶液进行稀释或透析，使蛋白成为正常的三维结构，然后通过与上述相同的分离纯化方法获得ASCT2的纯化制品。

[0512] 当ASCT2或衍生物例如糖基化产物被分泌到细胞外时，可以从培 养上清液中回收ASCT2或衍生物例如糖基化产物。即，通过例如离心的方法、以与上述相同的方式来处理培养物，从培养上清液中通过与上述相同的分离纯化方法，可以获得ASCT2的纯化制品。

[0513] 此外，在本发明中使用的ASCT2可以通过化学合成法来生产，例如Fmoc法或tBoc法。此外，可以使用由Advanced ChemTech、Perkin-Elmer、Pharmacia、Protein Technology Instrument、Synthecell-Vega、PerSeptive、岛津制作所等制造的肽合成仪对其进行化学合成。

[0514] (2)动物的免疫和融合用抗体产生细胞的制备

[0515] 使用上面(1)中制备的抗原免疫3到20周龄的小鼠、大鼠或仓鼠，从动物的脾脏、淋巴结或外周血收集抗体产生细胞。此外，当在上述动物中发现由于免疫原性低而导致充分的滴度上升时，可以使用ASCT2敲除小鼠作为供免疫的动物。

[0516] 免疫通过给动物皮下、静脉内或腹膜内注射施用抗原连同适合的佐剂（例如完全弗氏佐剂，氢氧化铝凝胶与百日咳菌苗的组合等）来进行。当抗原是部分肽时，用载体蛋白例如BSA（牛血清白蛋白）、KLH（匙孔血蓝蛋白）等产生结合物，将其用作抗原。

[0517] 在第一次施用后，每一周或每两周一次施用抗原，进行5到10次。在每次施用后的第三到第七天，从眼底静脉丛采集血液样品，通过例如酶免疫分析[Antibodies-A Laboratory Manual(抗体-实验室手册),Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]等测试血清与抗原的反应性。在其血清中显示出针对免疫用抗原的充分抗体滴度的动物，被用作融合用抗体产生细胞的供应源。

[0518] 在最后施用抗原后的三到七天，从免疫动物摘出含有抗体产生细胞的组织例如脾脏，以收集抗体产生细胞。当使用脾脏细胞时，将脾 脏切下并打散，然后离心。除去红细胞得到融合用抗体产生细胞。

[0519] (3)骨髓瘤细胞的制备

[0520] 从小鼠获得的已建立的细胞系被用作骨髓瘤细胞。例子包括8-氮杂鸟嘌呤抗性小鼠（源自于BALB/c小鼠）的骨髓瘤细胞系P3-X63Ag8-U1(P3-U1)[Current Topics in Microbiology and Immunology, 18,1(1978)]、P3-NS1/1-Ag41(NS-1)[European J. Immunology,6,511(1976)]、SP2/0-Ag14(SP-2)[Nature,276,269(1978)]、P3-X63-Ag8653(653)[J.Immunology,123,1548(1979)]、P3-X63-Ag8(X63)
[Nature,256,495(1975)]，等等。

[0521] 所述骨髓瘤细胞在正常培养基中传代培养[在RPMI-1640培养基中添加谷氨酰胺、2-巯基乙醇、庆大霉素、FCS和8-氮杂鸟嘌呤的培养基]，并且在细胞融合之前将它们7
在正常培养基中传代培养3或4天，以确保在进行融合的当天细胞数量为2×10 个以上。

[0522] (4)细胞融合和制备生产单克隆抗体的杂交瘤

[0523] 将通过上述(2)得到的融合用抗体产生细胞和通过上述(3)得到的骨髓瘤细胞用最低必需培养基（MEM）或PBS（1.83g磷酸氢二钠，0.21g磷酸二氢钾，7.65g氯化钠，1升蒸馏水，pH7.2）进行充分清洗和混合，使抗体产生细胞:骨髓瘤细胞的比率=5-10:1，然后离心。然后丢弃上清液。将沉淀的细胞群充分打散。在打散沉淀的细胞后，在37℃、搅拌下向细胞中加入聚乙二醇-1000（PEG-1000）、MEM和二甲亚砜的混合物。另外，每隔1或2分钟加入1到2mL MEM培养基数次，并加入MEM使得总量为50mL。离心后，将上清液丢弃。轻轻地将细胞打散后，将细胞轻柔地悬浮在HAT培养基中[在正常培养基中添加了次黄嘌呤、胸腺嘧啶和氨基蝶呤的培养基]。将悬浮液在5%CO2的培养箱中在37℃培养7到14天。

[0524] 培养后，取部分培养上清液作为样品，通过下面描述的结合分析 法选择对含ASCT2抗原有反应性而对不含ASCT2抗原没有反应性的骨髓瘤。然后，通过有限稀释方法进行两次克隆[第一次使用HT培养基（除去了氨基蝶呤的HAT培养基），第二次使用正常培养基]，选择显示出稳定的高抗体滴度的杂交瘤作为生产单克隆抗体的杂交瘤。

[0525] (5)纯化的单克隆抗体的制备

[0526] 将在上面(4)中获得的产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，通过腹膜内注射施用于8到10周龄的降植烷处理过的小鼠或裸鼠中（2,6,10,14-四甲基十五烷（降植烷）腹膜内给药，然后饲养2周）。杂交瘤在10到21天内发展出腹水肿瘤。从小鼠收集腹水液，离心除去固形成分，用40至50%硫酸铵进行盐析，然后用辛酸沉淀，通过DEAE-琼脂糖凝胶柱、蛋白A柱或凝胶过滤柱，收集IgG或IgM级分作为纯化的单克隆抗体。

[0527] 此外，将通过上述(4)得到的生产单克隆抗体的杂交瘤在含有10%FBS等的RFMI1640培养基中培养，并离心除去上清液。将沉淀的细胞悬浮在含有5%DIGO GF21的杂交瘤SFM培养基中，培养3至7天。将得到的细胞悬液离心，继而将所得上清液用蛋白A柱或蛋白G柱纯化，收集IgG级分。

[0528] 抗体的亚类可以使用亚类分型试剂盒通过酶免疫分析法来确定。蛋白的量可以通过Lowry法或从280nm处的吸光度来测定。

[0529] (6)单克隆抗体的选择

[0530] 通过下面的结合分析法，利用酶免疫分析法和氨基酸细胞内摄取的抑制分析，进行单克隆抗体的选择。

[0531] (6-a)结合分析法

[0532] 将通过将(1)中得到的含有ASCT2编码cDNA的表达载体导入大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞等得到的基因导入细胞或重组蛋 白质，或从人类组织得到的纯化多肽或部分肽，用作抗原。当抗原是部分肽时，用载体蛋白例如BSA或KLH制备结合物并使用。

[0533] 在将这些抗原通过分配到96孔板中使之固相化之后，在其中分配杂交瘤的培养上清液或纯化的单克隆抗体作为第一抗体，并进行反应。在用PBS、PBS-Tween彻底清洗后，向其中分配用生物素、酶、化学发光物质、放射性化合物等标记的抗免疫球蛋白抗体作为第二抗体，并进行反应。在用PBS-Tween彻底清洗后，根据第二抗体中的标记物进行反应，以选择与所述抗原特异性反应的单克隆抗体。

[0534] (6-b)氨基酸细胞内摄取的抑制分析

[0535] 可以使用其中包含ASCT2编码cDNA的表达载体被导入上面(1)得到的细胞例如动物细胞中的基因导入细胞、或表达ASCT2的正常或癌细胞，作为分析细胞。

[0536] 本发明的单克隆抗体或其抗体片段抑制由ASCT2介导的细胞内摄取氨基酸的活性利用下面的方法来评价，包括：将单克隆抗体或其抗体片段与表达ASCT2的正常或癌细胞反应，然后利用活细胞计数试剂等评价谷氨酰胺依赖性增殖的抑制的方法[J, Surgical Research,90,149(2000)]；将单克隆抗体或其抗体片段与表达ASCT2的正常或癌细胞进行反应，然后利用适当的设备例如闪烁计数器评价氨基酸例如放射性物质标记的丙氨酸的摄取抑制的方法[J. Biol Chem.,271,14883(1996)]等。

[0537] 2.重组抗体的制备

[0538] 在下面显示的生产人嵌合抗体和人源化抗体的方法，作为重组抗体的生产实例。

[0539] (1)表达重组抗体的载体的构建

[0540] 表达重组抗体的载体是用于动物细胞的表达载体，其中插入了编 码人类抗体的CH和CL的DNA，所述载体通过将编码人类抗体的CH和CL的DNA克隆到动物细胞的表达载体中来构建。

[0541] 人类抗体的C区可以是任何人类抗体的CH和CL。例子包括属于γ1亚类的CH、属于κ类的CL等。对于编码人类抗体的CH和CL的DNA来说，通常可以使用cDNA并还可以使用含有外显子和内含子的染色体DNA。对于动物细胞的表达载体来说，可以使用任何表达载体，只要能够在其中插入并在其中表达编码人类抗体的C区的基因即可。例子包 括 pAGE107[Cytotechnol.,3,133(1990)]、pAGE103[J.Biochem., 101,1307(1987)]、pHSG274[Gene,27,223(1984)]、pKCR[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78,1527(1981)]、pSG1bd2-4[Cytotechnol.,4,173(1990)]、pSE1UK1Sed1-3[Cytotechnol,13,79(1993)]等等。用于动物细胞表达载体的启动子和增强子的例子包括SV40早期启动子
[J.Biochem.,101,1307(1987)]、莫洛尼小鼠白血病病毒LTR[Biochem.Biophys.Res.Commun.，149,960(1987)]、免疫球蛋白H链启动子[Cell, 41,479(1985)]和增强子[Cell,33,717(1983)]，等等。

[0542] 用于表达重组抗体的载体可以是编码抗体H链的基因和编码抗体L链的基因在分开的载体上的类型，或这两种基因在同一个载体上的类型（串联类型）。对于构建用于表达重组抗体的载体的容易度、导入动物细胞的容易度、以及动物细胞中抗体H链和L链的表达量之间的平衡来说，串联类型的表达重组抗体的载体是更优选的[J. Immunol.Methods,167,271(1994)]。串联类型的表达重组抗体的载体的例子包括pKANTEX93（WO97/10354）、pEE18[Hybridoma,17,559(1998)]，等等。

[0543] (2)非人类动物来源的抗体V区的编码cDNA的获得和氨基酸序列分析

[0544] 编码非人类动物抗体的VH和VL的cDNA和氨基酸序列分析可以按照下面的方式获得。

[0545] 从来源于非人类动物的抗体产生杂交瘤细胞提取mRNA用于合成cDNA。将合成的cDNA克隆到载体例如噬菌体或质粒中以制备cDNA文库。使用编码小鼠抗体的一部分C区和V区的DNA作为探针，从文库中分离各个含有编码VH或VL的cDNA的重组噬菌体或重组质粒。测定了重组噬菌体或重组质粒上目的小鼠抗体的VH和VL的全长核苷酸序列，并从该核苷酸序列分别推导出VH和VL的全长氨基酸序列。

[0546] 用来制备产生非人类抗体的杂交瘤细胞的非人类动物的实例包括小鼠、大鼠、仓鼠和兔子等。可以使用任何动物，只要能够从其制备杂交瘤细胞即可。

[0547] 从杂交瘤细胞制备总RNA的方法的实例包括利用试剂盒例如RNA简易试剂盒（Qiagen制造）等的硫氰酸胍-三氟乙酸铯法[Methods in Enzymology,154,3(1987)]。

[0548] 从总RNA制备mRNA的方法的例子包括：寡聚(dT)固定化的纤维素柱方法[[Molecular Cloning，A Laboratory Manual,Second Edition（分 子 克隆：实 验 室手册，第二版）,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]，利用试剂盒例如寡聚-dT30mRNA纯化试剂盒(Takara Bio制造)的方法等。用于从杂交瘤细胞制备mRNA的试剂盒的例子还包括Fast Track mRNA分离试剂盒（Invitrogen制造）和Quick Prep mRNA纯化试剂盒（Pharmacia制造）等。

[0549] 用于合成cDNA和制备cDNA文库的方法的例子包括已知的方法[Molecular Cloning，A Laboratory Manual（分子克隆：实验室手册）,Cold Spring Harbor Lab.Press(1989)；Current Protocols in Molecular Biology（现代分子生物学技术）,附录1,John Wiley & Sons(1987-1997)]；使用试剂盒例如用于cDNA合成和质粒克隆的Super Script质粒系统（GIBCO BRL制造）、ZAP-cDNA试剂盒（Stratagene 制造）等的方法；等等。

[0550] 插入了利用从杂交瘤细胞提取的mRNA作为模板合成的cDNA、供制备cDNA文库用的载体可以是任何载体，只要所述cDNA可以插入即可。例子包括
ZAP Express[Strategies,5,58(1992)]、pBluescript II SK(+)[Nucleic Acids Research,17,9494(1989)]、λzap II（Stratagene制造）、λgt10和λgt11[DNA Cloning:A Practical Approach（DNA克隆：实用方法）,I,49(1985)]、Lambda BlueMid（Clontech制造）、λExCell和pT7T3 18U（Pharmacia制造）、pcD2[Mol Cell.Biol,3,280(1983)]、pUC18[Gene,33,103(1985)]等。

[0551] 可以使用导入由噬菌体或质粒载体构建的cDNA文库的任何大肠杆菌，只要该cDNA文库可以被导入、表达和维持即可。例子包括XL1-Blue
MRF'[Strategies,5,81(1992)]、C600[Genetics,39,177(1954)]、Y1088 和
Y1090[Science,222,778(1983)]、NM522[J.Mol Biol,166,1(1983)]、K802[J.Mol Biol,16,118(1966)]、JM105[Gene 38,275(1985)]等。

[0552] 利用同位素或荧光标记的探针进行菌落杂交或噬斑杂交方法，可以用于从cDNA文库中挑选编码非人类动物抗体等的VH和VL的cDNA克隆[Molecular Cloning，A Laboratory Manual,Second Edition（分子克隆：实验室手册，第二版）,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]。也可以通过聚合酶链反应（在后文中称为“PCR”）[Molecular Cloning，A Laboratory Manual,Second Edition（分子克隆：实验室手册，第二版）,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；Current Protocols in Molecular Biology（现代分子生物学技术），附录1,John Wiley & Sons (1987-1997)]制备引物并使用从mRNA制备的cDNA或者cDNA文库作为模板，来制备编码VH和VL的cDNA。

[0553] cDNA的核苷酸序列可以如下确定：用适合的限制性酶等消化选出的cDNA，将片段克隆到质粒例如pBluescript SK(-)（Stratagene制造）中，在双脱氧法[[Proc.Natl Acad.ScL USA,74,5463(1977)]之后，通过常规使用的核苷酸分析法例如使用核苷酸序列自动分析仪例如A.L.F.DNA测序仪（Pharmaci制造）分析序列从而进行反应。

[0554] 从测定的核苷酸序列推导出VH和VL的全长氨基酸序列，并将它们与已知抗体的VH和VL的全长氨基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest（免疫重要的蛋白序列）,美国卫生与人类服务部（US Dept,Health and Human Services）(1991)]进行比较，由此可以证实获得的cDNA是否编码含有分泌信号序列的抗体的VH和VL的完整氨基酸序列。将含有分泌信号序列的抗体的VH和VL的全长氨基酸序列与已知抗体的VH和VL的全长氨基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest（免疫重要的蛋白序列）,美国卫生与人类服务部（US Dept,Health and Human Services）(1991)]进行比较，推导出分泌信号序列和N-末端氨基酸序列的长度，并且还可以知道它们所属的亚类。此外，VH和VL的每个CDR的氨基酸序列可以通过将所得的氨基酸序列与已知抗体的VH和VL的氨基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest（免疫重要的蛋白序列）,美国卫生与人类服务部（US Dept,Health and Human Services）(1991)]进行比较来发现。

[0555] 此外，通过使用得到的VH和VL的全长氨基酸序列，与任何数据库例如SWISS-PROT、PIR-Protein等中的序列进行同源性搜索，例如按照BLAST方法[J.Mol Biol,215,403(1990)]等，可以研究VH和VL的全长氨基酸序列的新颖性。

[0556] (3)人嵌合抗体表达载体的构建

[0557] 将编码非人类动物抗体的VH和VL的cDNA，分别克隆到上面(1)中所述的重组抗体表达载体中编码人类抗体的CH和CL的基因上游， 从而构建了人嵌合抗体的表达载体。例如，为了连接含有非人类动物抗体的VH和VL的3'-末端的核苷酸序列和人类抗体的CH和CL的5'-末端的核苷酸序列的cDNA，将每个编码非人类动物的抗体的VH和VL的cDNA制备成编码由连接部分的核苷酸序列编码的适当氨基酸并设计成具有限制性酶的适当识别序列。将得到的编码抗体的VH和VL的cDNA分别克隆，使得它们各自在上面(1)中所述的人源化抗体表达载体中编码人类抗体的CH和CL的基因上游以合适的形式表达，从而构建了人嵌合抗体的表达载体。

[0558] 另外，编码非人类动物的VH或VL的cDNA利用在两端具有适当的限制性酶识别序列的合成DNA，通过PCR进行扩增，它们各被克隆到上面(1)中得到的重组抗体表达载体中。

[0559] (4)编码人源化抗体V区的cDNA的构建

[0560] 编码人源化抗体的VH或VL的cDNA可以如下获得。首先，分别选择人类抗体的VH或VL中构架区（后文称为“FR”）的氨基酸序列，所述序列中移植了非人类动物来源的抗体的VH或VL中CDR的氨基酸序列。人类抗体的FR的任何氨基酸序列均可以使用，只要它们源自于人类即可。例子包括在数据库例如蛋白数据库（Protein Data Bank）等中登记的人类抗体的FR的氨基酸序列、人类抗体的FR亚类共有的氨基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest（免疫重要的蛋白序列）,美国卫生与人类服务部(1991)]，等等。为了抑制抗体结合活性降低，选择与原始抗体的VH或VL中FR的氨基酸序列具有高度同源性（至少60%以上）的氨基酸序列。

[0561] 然后，将原始抗体的CDR的氨基酸序列分别移植到人类抗体的VH或VL中FR的选定氨基酸序列中，以设计人源化抗体的VH或VL的每个氨基酸序列。通过考虑在抗体基因的核苷酸序列中发现的密码子使用频率[Sequences of Proteins of Immunological Interest（免疫重要的蛋白序列）,美国卫生与人类服务部(1991)]，将设计的氨基酸序列变 换成DNA序列，并设计编码人源化抗体的VH或VL的氨基酸序列的DNA序列。

[0562] 根据设计的核苷酸序列，合成几个长度大约100个核苷酸的合成DNA，使用它们进行PCR。在这种情况下，鉴于PCR反应的效率和可以合成的DNA的长度，优选对于H和L链各设计6个合成DNA。

[0563] 此外，通过在两端上存在的合成DNA的5’端导入适当的限制性酶的识别序列，可以将编码人源化抗体的VH或VL的cDNA容易地克隆到在(1)中构建的人源化抗体表达载体中。

[0564] 在PCR后，将扩增产物克隆到质粒例如pBluescript SK(-)（Stratagene制造）等中，按照与(2)中描述的方法相类似的方法测定核苷酸序列，获得了具有所需人源化抗体的VH或VL的氨基酸序列的编码DNA序列的质粒。

[0565] (5)人源化抗体的V区的氨基酸序列的修饰

[0566] 已经知道，当通过仅仅将非人类动物来源的抗体的VH和VL中的CDR简单地移植到人类抗体的VH和VL的FR中来生产人源化抗体时，它的抗原结合活性低于来自非人类动物的原始抗体[BIO/TECHNOLOGY,9,266(1991)]。在人源化抗体中，在人类抗体的VH和VL的FR的氨基酸序列当中，鉴定与抗原结合直接相关的氨基酸残基、与CDR中的氨基酸残基相互作用的氨基酸残基、和维持抗体的三维结构并间接地与结合抗原相关的氨基酸残基，并将其修饰成在非人类动物的原始抗体中发现的氨基酸残基，从而使已经降低的抗原结合活性增加。

[0567] 为了鉴定FR中与抗原结合活性有关的氨基酸残基，通过X-射线晶体学[J， Mol Biol,112,535(1977)]、计算机模拟[Protein Engineering,7,1501(1994)]等构建并分析抗体的三维结构。另外，现在必须需要进行 各种不同的尝试，例如，生产每种抗体的几种修饰的抗体，并检验各个修饰的抗体与其抗体结合活性之间的相关性。

[0568] 人类抗体的VH和VL中FR的氨基酸序列的修饰可以使用用于修饰的各种合成DNA，按照(4)中描述的PCR来进行。至于通过PCR获得的扩增产物，按照(2)中描述的方法测定核苷酸序列，以便确认是否已经发生目的修饰。

[0569] (6)人源化抗体表达载体的构建

[0570] 通过将构建的重组抗体的VH或VL的每个编码cDNA克隆到在(1)中描述的重组抗体表达载体中编码人类抗体的CH或CL的每个基因的上游中，可以构建人源化抗体的表达载体。

[0571] 例如，在(4)和(5)中构建人源化抗体的VH或VL使用的合成DNA当中，当两端位置的合成DNA的5’-末端中引入适当的限制性酶的识别序列时，克隆能够进行，以便它们能在上面(1)中描述的人源化抗体表达载体中，在编码人类抗体的CH或CL的每个基因的上游以适当的形式表达。

[0572] (7)重组抗体的一过性表达

[0573] 为了有效评估产生的各种人源化抗体的抗原结合活性，可以使用在(3)和(6)中描述的重组抗体表达载体或其修饰的表达载体一过性表达所述重组抗体。

[0574] 任何细胞都可以用作宿主细胞，只要该宿主细胞能够表达重组抗体即可。一般 来 说 使 用 COS-7 细 胞（ATCC CRL1651）[Methods in Nucleic Acids Res.,CRC Press,283(1991)]。将表达载体导入COS-7细胞的方法的例子包括DEAE-葡聚糖法[Methods in Nucleic Acids Res.,CRC Press,283(1991)]、脂转染法[Proc.Natl.Acad.Sci USA,84,7413(1987)]，等等。

[0575] 导入表达载体之后，在培养上清液中重组抗体的表达量和抗原结合活性可以通过酶免疫分析[Monoclonal Antibodies-Principles and practice,Third edition(单克隆抗体原理和实践，第三版),Academic Press(1996),Antibodies-A Laboratory Manual(抗体- 实 验 室 手 册）,Cold Spring Harbor Laboratory(1988),Monoclonal Antibody Experiment Manual(单克隆抗体试验手册),Kodansha Scientific(1987)]等来测定。

[0576] (8)获得稳定表达重组抗体的转化体和制备重组抗体

[0577] 将(3)和(6)中描述的重组抗体表达载体导入到适合的宿主细胞，可以获得稳定表达重组抗体的转化体。

[0578] 将表达载体导入宿主细胞的方法的例子包括电穿孔[特开平2-257891，Cytotechnology,3,133(1990)]等。

[0579] 至于导入重组抗体表达载体的宿主细胞，可以使用任何细胞，只要它是能够产生重组抗体的宿主细胞即可。例子包括小鼠SP2/0-Ag14细胞（ATCC CRL1581）、小鼠P3X63-Ag8.653细胞（ATCC CRL1580）、二氢叶酸还原酶基因（在后文中称为"dhfr"）缺陷的CHO细胞[Proc.Natl.Aca.Sci.U.S.A.,77,4216(1980)]、lection抗性获得Lec13[Somatic Cell and Molecular genetics,12,55(1986)]、α1,6-岩藻糖基转移酶基因缺陷的CHO细胞(WO 2005/35586,WO 02/31140)、大鼠YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20细胞（ATCC CRL1662）等。

[0580] 另外，还可以使用下列宿主细胞：其中所导入的诸如与合成细胞内糖核苷酸，GDP-岩藻糖有关的酶的蛋白、诸如与其中在复合型N-葡萄糖苷-连接的糖链中1-位岩藻糖与还原端的6-位N-乙酰葡糖胺通过α-键结合的糖链的修饰有关的酶的蛋白、或与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖运输到高尔基体有关的蛋白，它们的活性被降低或缺失的宿主细胞，优选WO 05/35586、WO 02/31140等所述的α1,6-岩藻糖基转移酶基因 缺陷的CHO细胞。

[0581] 在导入表达载体之后，通过在含有药剂例如G418硫酸盐（在后文中称为"G418"）等的用于动物细胞培养的培养基中进行培养，来选择稳定表达重组抗体的转化体（特开平2-57891）。

[0582] 培养动物细胞的培养基的例子包括RPMI1640培养基（Invitrogen 制造）、GIT培养基（日本制药社制造）、EX-CELL301培养基（JRH制造）、IMDM培养基（Invitrogen制造）、杂交瘤-SFM培养基（Invitrogen制造）、在这些培养基中加入各种添加剂例如胎牛血清（后文称为“FCS”）而获得的培养基等。通过将选出的转化体在培养基中进行培养，可以在培养上清液中产生并累积重组抗体。培养上清液中重组抗体的表达量和抗原结合活性可以通过ELISA等测量。此外，在转化体中，可以按照特开平2-57891中公开的方法，通过使用DHFR扩增系统等来增加重组抗体的表达量。

[0583] 通过使用蛋白A柱，可以从转化体的培养上清液中纯化重组抗体[Monoclonal Antibodies-Principles and practice,Third edition（单克隆抗体-原理和实践，第三版）.Academic Press(1996),Antibodies-A Laboratory Manual(抗体-实验室手册),Cold Spring Harbor Laboratory (1988)]。例如，可以通过凝胶过滤、离子交换层析、超滤等的组合来纯化重组抗体。纯化的重组抗体的H链或L链或完整抗体分子的分子量通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（在后文中称为"SDS-PAGE"）[Nature,227,680(1970)]、Western印迹法[Monoclonal Antibodies-Principles and practice,Third edition（单克隆抗体-原理和实践，第三版）,Academic Press(1996),Antibodies-A Laboratory Manual(抗体-实验室手册),Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]等来测定。

[0584] 3.单克隆抗体或抗体片段活性的评价

[0585] 本发明的纯化的单克隆抗体或抗体片段的活性可以下面的方式进 行评价。

[0586] 与ASCT2-表达细胞的结合活性通过上面1(6a)记载的结合分析来评价。此外，它可以通过荧光抗体技术[Cancer Immunol.Immunother.,36,373(1993)]、利用诸如BIAcore系统的表面等离子体共振法等来测量。

[0587] ASCT对细胞内摄取氨基酸的抑制活性可以通过上面1-(6b)记载的方法来评价。

[0588] 另外，对抗原阳性细胞系的CDC活性或ADCC活性通过已知的方法评价[Cancer Immunol Immunother.,36,373(1993)]。

[0589] 4.利用本发明的抗ASCT2单克隆抗体或抗体片段治疗疾病的方法

[0590] 本发明的特异性识别ASCT2的细胞外区域的天然三维结构并与该细胞外区域结合的单克隆抗体或其抗体片段，可以用于治疗与ASCT2有关的疾病。

[0591] 包含本发明的单克隆抗体或抗体片段或其衍生物的治疗药可以只将该抗体或抗体片段或其衍生物作为活性成分，并优选提供为通过制药学技术领域中公知的适当方法，将其与一种或多种药物可接受的载体混合而制造的药物制剂。

[0592] 给药途径的例子包括经口给药和肠胃外给药，例如经颊、气管、直肠、皮下、肌肉内或静脉内给药。剂型的例子包括喷雾剂、胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、乳剂、栓剂、注射剂、软膏、带剂等。

[0593] 适合于经口给药的药物制剂包括乳剂、糖浆剂、胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂等。

[0594] 液体制剂例如乳剂和糖浆剂可以使用下述作为添加剂来生产：水，糖例如蔗糖、山梨糖醇和果糖，二醇例如聚乙二醇和丙二醇，油例如芝麻油、橄榄油和大豆油，防腐剂例如对羟基苯甲酸酯，香料例如草莓香料和胡椒薄荷，等等。

[0595] 胶囊、片剂、散剂、颗粒剂等可以使用下述作为添加剂来生产：赋形剂例如乳糖、葡萄糖、蔗糖和甘露糖醇，崩解剂例如淀粉和藻酸钠，润滑剂例如硬脂酸镁和滑石粉，粘合剂例如聚乙烯醇、羟丙基纤维素和明胶，表面活性剂例如脂肪酸酯，增塑剂例如甘油，等等。

[0596] 适合肠胃外给药的药物制剂包括注射剂、栓剂、喷雾剂等。

[0597] 注射剂可以使用载体例如盐溶液、葡萄糖溶液或其二者的混合物来制备。

[0598] 栓剂可以使用载体例如可可脂、氢化脂肪或羧酸来制备。

[0599] 喷雾剂可以使用抗体或抗体片段本身、或将其与不刺激患者的口腔或气道粘膜并能通过将化合物分散成细小粒子而促进其吸收的载体一起使用来制备。载体包括乳糖、甘油等。可以生产药物制剂例如气溶胶或干粉。

[0600] 此外，经口制剂的添加剂所例举的成分，也可以添加到肠胃外制剂中。

[0601] 5.利用本发明的抗ASCT2单克隆抗体或抗体片段诊断疾病的方法

[0602] 与ASCT2有关的疾病可以通过利用本发明的单克隆抗体或抗体片段来检测或测定ASCT2或表达ASCT2的细胞进行诊断。

[0603] 癌是与ASCT2有关的疾病之一，其诊断可以通过例如如下的检测或测量ASCT2来进行。

[0604] 首先，从两个以上健康人生物体采集活体样品，利用本发明的单克隆抗体或抗体片段或其衍生物，通过以下免疫学手段进行ASCT2的检测或测量，来确认健康人活体样品中ASCT2的表达量。通过以同样方式也检查待测人活体样品中ASCT2的量，将该量与健康人的量相比较。当待测人的多肽量与健康人相比增加时，可以诊断癌症阳性。

[0605] 免疫学方法是利用标记抗原或抗体检测或测定抗体量或抗原量的方法。免疫学方法的例子包括放射性物质标记免疫抗体法、酶免疫分析、荧光免疫分析、发光免疫分析、Western印迹法、物理-化学方法等。

[0606] 放射性物质标记免疫抗体法的例子包括这样的方法：使本发明的抗体或抗体片段与抗原或表达抗原的细胞反应，然后将抗免疫球蛋白抗体进行放射性标记，使其结合片段等等与其反应，继而利用闪烁计数器等测定。

[0607] 酶免疫分析的例子包括这样的方法：使本发明的抗体或抗体片段与抗原或表达抗原的细胞等反应，然后使进行过抗体标记的抗免疫球蛋白抗体或其结合片段与其反应，通过分光光度计测量发色的色素；并且可以使用例如夹心ELISA。至于酶免疫分析中使用的标记物，可以使用任何已知的酶标记物[酵素免疫测定法，医学书院(1987)］。实例包括碱性磷酸酶标记、过氧化物酶标记、荧光素酶标记、生物素标记等。

[0608] 夹心ELISA是抗体与固相结合起来的方法，待检测或测量的抗原被俘获，用另一种抗体与被俘获的抗原反应。在该ELISA中，制备两种识别待检测或测量的抗原的抗体或其抗体片段，但它们的抗原识别位点不同，一种抗体或抗体片段被预先吸附在板(例如96-孔板)上，而 另一种抗体或抗体片段用荧光物质例如FITC、酶例如过氧化物酶或生物素标记。使吸附了上述抗体的板与从活体分离的细胞或其细胞破碎悬液、组织或其破碎液、培养细胞、血清、胸膜积液、腹水、眼液等反应，然后使其与标记的单克隆抗体或抗体片段反应，并进行该标记物质的相应检测反应。当通过该方法测量待测样品中的抗原浓度时，可以从通过逐步稀释已知浓度的抗原制备的校准曲线来计算待测样品中的抗原浓度。至于夹心ELISA使用的抗体，可以使用任何多克隆抗体和单克隆抗体，或者可以使用抗体片段例如Fab、Fab'和F(ab)2。至于夹心ELISA中使用的两种抗体的组合，可以使用识别不同表位的单克隆抗体或抗体片段的组合，或者可以使用多克隆抗体与单克隆抗体或抗体片段的组合。

[0609] 荧 光 免 疫 分 析 包 括 记 载 在 下 面 文 献 中 的 方 法 等 [Monoclonal Antibodies-Principles and practice,Third Edition（单克隆抗体–原理和实践，第三版）,单克隆抗体试验手册,Kodansha Scientific(1987)]。至于荧光免疫分析的标记物，可以使用已经记载的任何已知的荧光标记物(荧光抗体法,Soft Science,(1983))。例子包括FITC、RITC等。

[0610] 可以利用在文献[生物发光和化学发光，临床检查42，广川书店(1998)］等中记载的方法，进行发光免疫分析。至于发光免疫分析使用的标记物，可以包括任何已知的发光标记物。可以使用的例子包括吖啶酯、洛芬碱等。

[0611] Western印迹法是被抗原或表达抗原的细胞通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分级的方法[Antibodies-A Laboratory Manual(抗体-实验室手册)(Cold Spring Harbor Laboratory,1988)]，该凝胶被点在PVDF膜或硝化纤维素膜上，使该膜与识别抗原的抗体或抗体片段反应，进一步使其与用荧光物质例如FITC、酶标记物例如过氧化物酶、生物素标记等标记的抗小鼠IgG抗体或抗体片段反应，使该标记物可视化来确认反应。其例子描述如下。将表达具有SEQ ID NO:2表示的氨基酸 序列的多肽的细胞或组织溶解在溶液中，在还原条件下将每道0.1至30μg的蛋白量通过SDS-PAGE法进行电泳。电泳过的蛋白转移到PVDF膜，使其与含有1至10%BSA的PBS(以下称为“BSA-PBS”)在室温下反应30分钟，进行封阻。此时，使本发明的单克隆抗体与其反应，用含有0.05至0.1%Tween20的PBS(以下称为“Tween-PBS”)洗涤，并使得与用过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG在室温下反应2小时。用Tween-PBS洗涤并利用ECL Western印迹检测试剂(Amersham制造)等检测单克隆抗体结合条带，从而检测具有SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列的多肽。至于Western印迹法中供检测所用的抗体，使用的是能够与不具有天然型三维结构的多肽结合的抗体。

[0612] 物理化学方法具体通过将ASCT2作为抗原与本发明的抗体或抗体片段反应以形成凝集体，并检测该凝集体进行。物理化学方法的其它例子包括毛细管法、一维免疫扩散法、免疫比浊法、乳胶免疫比浊法[临床检查法提要，金原出版(1988)］等。例如，在乳胶免疫扩散法中，可以使用载体，例如粒径约0.1至1μm用抗体或抗原致敏的聚苯乙烯乳胶，并且当利用该相应的抗原或抗体进行抗原抗体反应时，反应溶液中的散射光增加而透射光减少。当作为吸光度或积分球浊度检测到这样的改变时，就可以在待测样品中测量抗原浓度等。

[0613] 另一方面，为了检测或测量表达ASCT2的细胞，可以使用已知的免疫学检测方法，优选使用免疫沉淀法、免疫细胞染色法、免疫组织染色法、荧光抗体染色法等。

[0614] 免测沉淀法是使表达ASCT2的细胞与本发明的单克隆抗体或抗体片段反应，然后添加与免疫球蛋白例如蛋白G-琼脂糖具有特异性结合能力的载体，以便抗原-抗体复合体沉淀的方法。也可以进行以下方法。本发明的单克隆抗体或抗体片段在用于ELISA的96-孔板上是固相化的，然后用BSA-PBS封阻。当抗体是未纯化的状态例如杂交瘤细胞的培养物上清液时，抗小鼠免疫球蛋白或大鼠免疫球蛋白或蛋白A或 G等预先吸附在用于ELISA的96-孔板上，并用BSA-PBS封阻，在其中分配杂交瘤细胞的培养物上清液进行结合。在弃去BSA-PBS并用PBS充分洗涤残余物之后，用表达ASCT2的细胞或组织的溶解溶液进行反应。
从用SDS-PAGE用样品缓冲液充分洗涤的板提取免疫沉淀物，并通过上述Western印迹法检测。

[0615] 免疫细胞染色法和免疫组织染色法是这样的方法：将表达抗原的细胞或组织在有必要的情况下用表面活性剂、甲醇等处理，使得抗体容易的透入细胞或组织，然后使本发明的单克隆抗体与其反应，然后进一步使其与受过荧光标记例如FITC、酶标记例如过氧化物酶或生物素标记的抗免疫球蛋白抗体或其结合片段反应，并使标记物可视化和在显微镜下观察。检测也可以通过荧光抗体染色法进行[Monoclonal Antibodies-Principles and practice,Third Edition（单 克隆 抗体– 原理 和实 践，第 三版）,Academic Press(1996),Manual for Experiments of Monoclonal Antibodies(单克隆抗体试验手册),Kodansha Scientific(1987)]，其中使细胞与荧光标记抗体反应并通过流式细胞仪分析。特别是，因为本发明的单克隆抗体或抗体片段与ASCT2的细胞外区域结合，所以它可以优选被用来通过荧光抗体染色法检测表达保持天然型三维结构的这种多肽的细胞。

[0616] 另外，在荧光抗体染色法中使用FMAT8100HTS系统(Applied Biosystems制造)等的情况下，不用将形成的抗体-抗原复合体与未参与形成抗体-抗原复合体的游离抗体或抗原分离，就可以测量抗原量或抗体量。

[0617] 下面通过实施例描述本发明；但是，本发明不局限于以下实施例。

[0618] 实施例1：各种细胞系、异种移植物和正常组织中ASCT2基因表达的分析

[0619] (1)SCID小鼠皮下移植癌细胞系来构建异种移植物和制备肿瘤块

[0620] 依照以下方法，在SCID小鼠中皮下移植人类癌细胞系，从而构建异种移植物。从所产生的异种移植物摘出和制备肿瘤块

[0621] 来 源 于 人 类 胰 腺 癌 细 胞 系 的 细 胞[ASPC-1(ATCC 编 号：CRL-1682)、CaPan-1(ATCC编号：HTB-79)、PANC-1(ATCC编号：CRL-1469)]、和人类结肠直肠癌细胞系[Colo205(Riken(理研院)细胞库编号：RCB2127)、HT-29(ATCC编号：HTB-38)、LS180(ATCC编号：CCL-187)、SW1116(ATCC编号：CCL-233)和WiDr(ATCC编号：CCL-218)]以细胞密度约8
1x10 细胞/mL悬浮在PBS中。在每组4只Fox CHASE C.B-17/Icr-scidJcl小鼠(雄性，
5周龄，购自日本CLEA社)的腹侧皮下移植各细胞悬液100μL/动物。

[0622] 各种细胞CO2培养箱中37°C下在含有10%失活的胎牛血清(Invitrogen制造)的RPMI1640培养基(Invitrogen制造)中悬浮和传代培养，用于移植。

[0623] 得到的异种移植物分别命名为xASPCl、xCaPanl、xPANCl、xColo205、xHT29、xLS180、xSW1116和xWiDr。

[0624] 肿瘤移植之后，肿瘤块的直径天天使用游标卡尺测量。肿瘤的主轴达到大约1cm的动物依次在麻醉下放血处死，然后摘出每个肿瘤块。每个肿瘤块切成4份，用液氮迅速冷冻，然后储存在-80℃的冷冻器中。

[0625] (2)总RNA的提取和poly A(+)RNA的纯化

[0626] 从细胞系和上面(1)制备的异种移植物的肿瘤块中，依照以下程序提取总RNA和纯化poly A(+)RNA。

[0627] 至于细胞系，使用血液癌来源的细胞系{KG-1(ATCC编号：CCL-246)，THP-1(ATCC编号：TIB-202)，HL-60(ATCC编号：CCL-240)[以上均为急性骨髓性白血病(AML)来源的细胞系]；CCRF-CEM(ATCC 编号：CCL-119)，CCRF-SB(ATCC编号：CCL-120)，Jurkat(ATCC编号：TIB-152)，HSB-2(ATCC编号：CCL-120)，HPB-ALL(理研院细胞库编号：RCB1935)[以上均为急性淋巴细胞性白血病(ALL)来源的细胞系]；K-562(ATCC编号：CCL-243)，KU812(ATCC编号：CRL-2099)[以上均为慢性粒细胞性白血病(CML)来源的细胞系]；KMS-11(HSRRB编号：JCRB1179)，ARH-77(ATCC编号：CRL-1621)，IM-9(ATCC编号：CCL-159)，RPMI8226(HSRRB编号：JCRB0034)，U266B1(ATCC编号：TIB-196)，MC/CAR(ATCC编号：CRL-8083)[以上均为多发性骨髓瘤(MM)来源的细胞系]；HS-Sultan(ATCC编号：CRL-1484)，Daudi(ATCC编号：CCL-213)，Raji(ATCC编 号：CCL-86)，Ramos(ATCC编 号：CRL-1596)[ 以上 均为Burkitt淋巴瘤(BL)来源的细胞系]；U-937(ATCC编号：CRL-1593.2)，ML-1(DSMZ编号：
ACC464)[均为组织细胞淋巴瘤(HS)来源的细胞系]}；肺癌来源的细胞系[PC-14理研院细胞库编号：RCB0446)，PC-7(免疫生物研究所社，产品编号：37011)，PC-9(免疫生物研究所社，产品编号：37012)，PC-1(免疫生物研究所社，产品编号：37008)(以上均为非小细胞肺癌)；Lu-139(理研院细胞库编号：RCB0469)，NCI-H69(ATCC编号：HTB-119)，RERF-LC-MA(HSRRB编号：JCRBQ812)，SBC-5(HSRRB编号：JCRB0819)(以上均为小细胞肺癌)]；胃癌来源的细胞系[Kato III(理研院细胞库编号：RCB2088)，MKN-74(HSRRB编号：
JCRBG255)，NUGC-4(理研院细胞库编号：RCB1939)，AZ-521(HSRRB编号：JCRB0061)]；结肠直肠癌来源的细胞系{Colo205(理研院细胞库编号：RCB2127)、HT-29(ATCC编号：HTB-38)、LSl74T[European Collection of Cell Cultures（欧洲细胞培养物保藏中心）(ECACC)编号：87060401]，LS180(ATCC编号：CCL187)，SW1116(ATCC编号：CCL-233)}；胰腺癌来源的细胞系[ASPC-1(ATCC编号：CRL-1682)，BXPC-3(ATCC编号：CRL-1687)，CaPan-1(ATCC编号：HTB-79)]；恶性黑色素瘤（黑色素瘤）来源的细胞系[G-361(ATCC编号：CRL-1424)，HMV-1(理研院细胞库编号：RCB0004)，SK-MEL-28(ATCC编号：HTB-72)]；和正常人类肺成纤维细胞[MRC-5(ATCC编号：CCL-171)]。

[0628] 从细胞系提取总RNA如下进行。在粘着细胞系的情况下，培养之后使用抽吸器除去培养基，用适量的PBS洗涤，并使用有机硅制成的刮片回收细胞。将细胞充分悬浮并通过2
每种细胞对应于10cm 培养面积添加1mL TRIzol试剂(Invitrogen制造)进行裂解。另外，得到的细胞裂解液10次通过18-号注射针头，将基因组DNA断裂成片。在漂浮细胞系的情况下，使用冷冻离心机（日立工机社制造，Himac CF15R，转头：T11A21)，将细胞培养物以1,500rpm离心5分钟，通过倾析除去培养基，将细胞悬浮在PBS中。细胞悬浮液再次用冷冻离心机（日立工机社制造，Himac CF15R，转头：T11A21)以1500rpm离心5分钟，并回收
7
细胞。向1x10 个回收细胞中，添加1mL TRIzol试剂(Invitrogen制造)，并充分悬浮使得细胞裂解。将细胞裂解液10次通过18-号注射针头，将基因组DNA断裂成片。

[0629] 如下进行(1)中制备的异种移植物肿瘤块的裂解和总RNA的提取。将冻结的肿瘤块投入10mL TRIzol试剂(Invitrogen制造)中，并立即使用Polytron匀浆器(PT 2100，Kinematica制造)以30,000rpm裂解15秒，得到细胞裂解液。每个细胞裂解液使用冷冻离心机(日立工机社制造，Himac CF15R，转头：T11A21)以11,000rpm离心10分钟，并将各上清液小心转移到新鲜试管，免得带出沉淀物。向上清液添加2mL氯仿并剧烈搅拌15秒，混合物在室温下静置2至3分钟，并使用冷冻离心机(日立工机社制造，Himac CF7D2，转头：RT3S3)在4℃下以3,000rpm离心90分钟。将各上清液转移至新鲜的试管，向其添加5mL异丙醇，然后轻柔混合。将混合物在室温下静置10分钟，并使用冷冻离心机(日立工机社制造，Himac CF15R，转头：T11A21)以11,000rpm离心10分钟去除上清液之后，向其中添加10mL 75%乙醇水溶液，然后使用冷冻离心机(日立工机社制造，Himac CF15R，转头：
T11A21)以11,000rpm混合和离心5分钟，得到沉淀物。沉淀物溶解在适量的无RNase的水中，以制备总RNA样品。总RNA样品的浓度通过吸光光度计测量，并确认A260/A280的比率是1.7以上。当A260/A280的比率小于1.7 时，使用RNeasy试剂盒(Qiagen制造)进行进一步纯化。

[0630] 从上面制备的400μg总RNA样品中，使用Micro Poly(A)纯化试剂盒(Ambion制造)，按照其中附带的说明书，纯化poly A(+)RNA。

[0631] (3)cDNA的合成

[0632] 使用供RT-PCR用的Superscript第一链合成系统(Invitrogen制造)，从(2)中得到的poly A(+)RNA或市售的组织来源的mRNA合成cDNA。

[0633] 至于来源于人类正常组织(肝脏、肺、全脑、心脏、胃、脾、脊髓、小肠、骨骼肌、子宫、呼吸道、甲状腺、胸腺、精巢、唾液腺、前列腺、胎盘、淋巴结、胰腺、大肠、血液或肾脏)的mRNA，使用市售的mRNA(Clontech制造)。来源于人类临床癌组织(肺癌、胃癌、直肠结肠癌、肾癌、肝癌、子宫癌、乳腺癌或食道癌)的mRNA，也使用市售的RNA(BioChain制造)。

[0634] 向(2)中得到的1μg poly A(+)RNA或市售的组织来源的mRNA中，添加1μL10mmol/L dNTP和1μL0.5μg/μL Oligo(dT)12-18，然后向其中添加DEPC水至总量7μL。
将反应溶液在65℃加热5分钟变性，在冰上骤冷，并使其静置1分钟以上。向mRNA溶液中，添加10x RT缓冲液(2μL)、氯化镁(4μL,25mmol/L)、0.1mol/LDTT(2μL)和RNase OUT重组核糖核酸酶抑制剂(1μL)，并将温度保持在42℃2分钟。向其中再加入SuperscriptII RT(1μL)以在42℃进行逆转录反应50分钟。在70℃加热15分钟使酶失活。然后，向反应溶液中加入1μL大肠杆菌RNase H并在37℃反应20分钟。向所得到的溶液中添加DEPC水，以达到总量1mL。

[0635] 以下，是采用以上制备的溶液的五倍稀释液10μL进行实时PCR的反应体系。

[0636] (4)通过实时PCR法(定量PCR法或Q-PCR法)定量测定细胞系、异种移植物肿瘤块和正常组织中ASCT2基因的mRNA的表达水平

[0637] 向(3)中制备的各cDNA 10μL(对应于2ng的poly A(+)RNA)中，加入用于检测ASCT2基因的cDNA的正向引物(Fw#1)和用于检测ASCT2基因的cDNA的反向引物(Rv#1)，达到它们各自300nmol/L的终浓度，其中正向引物包含从SEQ ID NO:1设计的SEQ ID NO:3表示的核苷酸序列，反向引物包含SEQ ID NO:4表示的核苷酸序列(均由Proligo制造)。2+
此外，向得到的溶液中，加入10x R-PCR缓冲液(无Mg ，Takara Bio制造，2μL)、250mmol/
2+
L Mg 溶液(0.2μL)、dNTPs(10mmol/L，0.6μL)、Ex Taq R-PCR(Takara Bio制造，0.2μL)和SYBR Green I(BMA制造；产品原液稀释2,500倍，1μL)。向其中添加DEPC水，至总量
20μL。

[0638] PCR在以下反应条件下进行：最初在94℃激活Taq DNA聚合酶和变性模板DNA5分钟，然后进行45个循环，每个由三个过程组成：94℃变性30秒、65℃退火30秒和72℃DNA延长30秒。由插入到扩增产物的SYBR Green I产生的荧光强度通过PRISM 7700(Applied Biosystems制造)测量，数据根据仪器PRISM 7700附带的软件Sequence Detector 1.7a版进行分析。以上实时PCR得到的信号是否是目的扩增片段，通过在反应完成之后将反应溶液进行琼脂糖凝胶电泳得到的主要扩增片段的大小来判断。以上实时PCR使用96-孔PCR板进行。除了以上含有cDNA的反应溶液以外，阴性对照(无菌水)和使用通过Qiagen质粒Midi试剂盒(Qiagen制造)纯化的编码ASCT2的部分片段的质粒HCHON2001712(人类cDNAFLJ43232 fis，日本DNA数据库(DDBJ)编号：AK125222)制备的用于制作校准曲线6
(1x10至1x10 拷贝/孔)的样品，以PCR板的每个孔中一种样品进行安排，并进行PCR。

[0639] 图1(1)至1(4)显示作为ASCT2的标准序列的NM_005628的全长序列(SEQID NO:1，GenBank编号：NM_005628)的比对，和用作模板用于制作校准曲线的质粒HCHON2001712的全长序列的比对。在 NM_005628和HCHON2001712的全长序列之间有不一样的位点。因此，供检测包含SEQ ID NO:3表示的核苷酸序列的cDNA用的正向引物(Fw#1)和供检测包含SEQ ID NO:4表示的核苷酸序列的cDNA用的反向引物(Rv#1)，二者用于测量ASCT2表达水平，它们使用在NM_005628和HCHON2001712序列之间完全同样的区域来设计。

[0640] 在每个这样得到的细胞系、异种移植物肿瘤块和正常组织中ASCT2基因的mRNA的表达水平的结果显示在图2(1)至2(2)中。mRNA表达水平显示为每2ng的poly A(+)RNA表达的ASCT2分子数与规定为1的显示出正常组织最高表达的气道中ASCT2基因表达水平的相对比。与正常气道相比较，发现了表达水平提高，亦即，下列细胞系的表达提高了10-倍以上：血液癌来源的细胞系KG-1(AML-来源的细胞系)，HSB-2(ALL-来源的细胞系)，K-562(CML-来源的细胞系)，和KMS-11和ARH-77(二者均为MM-来源的细胞系)；下列细胞系的表达提高了5-倍以上：Jurkat(ALL-来源的细胞系)，IM-9，RPMI 8226(二者均为MM-来源的细胞系)，HS-Sultan(BL-来源的细胞系)和ML-1(HL-来源的细胞系)；下列细胞系的表达提高了2-倍以上：THP-1(AML-来源的细胞系)，CCRF-CEM(ALL-来源的细胞系)，KU812(CML-来源的细胞系)，Raji(BL-来源的细胞系)，U-937(HS-来源的细胞系)，胃癌组织和食道癌组织。

[0641] 实施例2：导入人类ASCT2-myc/His基因的CHO细胞系的构建

[0642] 按照以下方法，得到包含SEQ ID NO:5表示的核苷酸序列和SEQ ID NO:6表示的氨基酸序列的质粒pCR4-SLCl A5-myc/His。使用这种质粒，得到了导入人类ASCT2-myc/His基因的CHO细胞系。

[0643] 向包含SEQ ID NO:7-10的各个核苷酸序列的相应引物（10μmol/μL，各1L)中，加入10x Ex Taq缓冲液(10μL)、dNTP(2mmol/L，10μL)和Ex Taq聚合酶(1μL，以上均由Takara Bio制造)，并向其中进一步加入无菌水至总量100μL。以类似于实施例1(3)中记载的 方法，在以下反应条件下进行PCR：在96°C反应2分钟，然后进行35个循环，每个由三个过程组成：96°C反应1分钟、60°C反应1分钟和72°C反应1分钟。结果，当人类ASCT2基因翻译起始点的核苷酸被定为1位时，合成了对应于1至370位核苷酸序列的核苷酸序列(以下称为“N-SLC1A5”)。反应产物通过琼脂糖凝胶电泳分离。所得到的大约0.4-kb的扩增片段使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen制造)进行提取，然后使用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen制造)克隆到pCR4 TOPO载体中(以下，所得到的质粒称为“pCR4-N-SLC1A5”)。

[0644] 接下来，向10ng包含人类ASCT2基因作为模板的质粒HCHON2001712(DDBJ编号：AK125222)中，加入包含SEQ ID NOs:11和12表示的核苷酸序列的各个引物(10μmol/L，各
1μL)、10x Ex Taq缓冲液(10μL)、dNTP(2mmol/L，10μL)和Ex Taq聚合酶(1μL，以上均由Takara Bio制造)，并向其中进一步加入无菌水至总量100μL。在与上面描述的相同反应条件下，进行PCR以合成编码融合蛋白的核苷酸序列(以下称为“C-SLClA5-myc/His”)，所述融合蛋白在对应于人类ASCT2基因365至1623位核苷酸序列的核苷酸序列的C-端附加了myc/His。反应产物通过琼脂糖凝胶电泳分离。所得到的大约1.2-kb扩增片段使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen制造)进行提取。向所得到的作为模板的提取片段中，加入包含SEQ ID NOs:11和13表示的核苷酸序列的各个引物(10μmol/L，各1μL)、10x Ex Taq缓冲液(10μL)、dNTP(2mmol/L，10μL)和Ex Taq聚合酶(1μL，以上均由Takara Bio制造)，并向其中进一步加入无菌水至总量100μL。在与上面描述的相同反应条件下，进行PCR以向C-SLClA5-myc/His的C端添加Notl和Spel限制酶位点。所得到的反应产物通过琼脂糖凝胶电泳分离。所得到的大约1.2-kb的扩增片段使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen制造)进行提取，然后使用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen制造)克隆到pCR4TOPO载体中(以下，将所得到的质粒称为“pCR4-C-SLClA5-myc/His”)。尽管当SEQ ID NO:1表示的序列的翻译起始点处的核苷酸被规定为1位时，1455位的T被C取代，但所得到的基因序列没有显示出氨基酸 变异。

[0645] 得到的pCR4-N-SLClA5用BssHII(Takara Bio制造)和SpeI(Takara Bio制造)消化，并通过琼脂糖凝胶电泳分离。得到的大约4.4-kb的基因片段使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen制造)进行提取。同样地，得到的pCR4-C-SLC1A5-myc/His用BssHII(Takara Bio制造)和SpeI(Takara Bio制造)消化，并提取大约1.4-kb的基因片段。每个提取片段使用Ligation high(东洋纺织社制造)连接，然后按照Cohen等的方法[Proc Natl Acad-Sci.USA,69,2110(1972)]，用得到的载体转化大肠杆菌DH5α(东洋纺织社制造)。使用自动化质粒分离系统PI-50(Kurabo制造)，从得到的转化体提取质粒，得到包含SEQ ID NO:5表示的核苷酸序列和SEQ ID NO:6表示的氨基酸序列的质粒pCR4-SLC1A5myc/His。

[0646] 将得到的pCR4-SLC1A5myc/His用EcoRI(Takara Bio制造)和KpnI(Takara Bio制造)消化，并以上面同样的方式，提取基因片段，得到包含编码融合蛋白的核苷酸序列(以下称为“SLC1A5-myc/His”)的片段，所述融合蛋白在人类ASCT2基因的C-端添加了myc/His。

[0647] 将得到的含有SLC1A5-myc/His的片段连接到预先用EcoRI(Takara Bio制造)和KpnI(Takara Bio制造)消化的pKANTEX93载体中(WO97/10354)。用与上述同样的方式，用连接产物转化大肠杆菌DH5α(东洋纺织社制造)。得到转化体之后，使用质粒分离试剂盒(Qiagen制造)得到表达质粒pKANTEX-SLC1A5-myc/His。

[0648] 依照电穿孔法[Cytotechnology,3,133(1990)]，将pKANTEX-SLC1A5-myc/His以下述方式导入CHO/DG44细胞[Somatic Cell and Molecular Genetics,12,555(1986)]。在此使用的细胞是在含有10%FBS(Life Technologies制造)和庆大霉素(50μg/mL，Nacalai Tesque制造)的IMDM(Invitrogen制造)中添加1xHT补充剂(Invitrogen制造)的培养基(以下称为“A3培养基”)中传代培养的细胞。CHO/DG44细胞悬 浮在含有氯化钾(137nmol/L)、氯化钠(2.7nmol/L)、磷酸氢二钠(8.1mmol/L)、磷酸二氢钠(1.5nmol/L)
6
和氯化镁(4mmol/L)的缓冲液(以下称为“K-PBS”)中，至细胞密度为8x10 细胞/mL，并
6
将得到的细胞悬液(200μL，细胞计数为1.6x10 细胞)与表达质粒pKANTEX-SLClA5-myc/His(10μg)混合。将混合物转移到小池(电极间距：2mm)中，使用GenePulser II(Bio-Rad制造)在0.35kV的脉冲电压和250μF的电容下进行基因导入。将小池在冰上静置后，将小池中的细胞悬液悬浮在含有A3培养基的细胞培养容器中，在5%CO2培养箱中37℃下培养。
培养四天之后，用含有G418的A3培养基(Nacalai Tesque制造；0.5mg/mL)更换培养基，继续细胞培养。在细胞培养期间进行培养基更换和传代培养，在基因导入之后大约两周，得到对G418有抗性的转化细胞。

[0649] 将得到的G418-抗性转化细胞在含有0.5mg/L G418的A3培养基中(Nacalai Tesque制造)稀释到细胞密度为5个细胞/10mL，并将稀释的细胞悬液以100μL/孔分配到96-孔板中，然后在逐步增加的氨甲喋呤浓度中生长。以这种方式，选择显示出ASCT2-myc/His的高表达水平的克隆，然后从中得到导入了人类ASCT2-myc/His基因的CHO细胞系。

[0650] 得到的人类ASCT2-myc/His基因导入的CHO细胞(1x105-5x105cells)悬浮在70%6 6
乙醇-PBS(1mL)中并在冰温下固定30分钟。在以1x10 至5x10 细胞/孔分配到96-孔U形底板并随后在1,500rpm离心5分钟之后，弃去上清液，然后用1%BSA-PBS在冰温下封阻30分钟。离心除去上清液后，抗-myc抗体PL14(医学生物学研究所制造)、抗-His抗体(Qiagen制造)和小鼠IgG1同种型对照(Dako制造)作为第一抗体分别用1%BSA-PBS稀释至终浓度为1.0、0.1和0.1μg/mL，并以100μL/孔分配，在冰温下反应60分钟。在板用1%BSA-PBS洗涤一次之后，添加100μL/孔用1%BSA-PBS稀释50倍的FITC-标记的抗小鼠免疫球蛋白G(H+L)(DAKO制造)作为第二抗体，并在遮光和冰温下反应30分钟。在用
1%BSA-PBS再次洗涤一次之后，将细胞悬浮在PBS中， 并通过流式细胞仪Cytomics FC500 MPL，Beckman Coulter制造)测量荧光强度。结果显示在图3中。根据检测到抗-myc抗体和抗-His抗体高反应性的事实，确认构建了导入人类ASCT2-myc/His基因的目的CHO细胞系。

[0651] 实施例3：对抗ASCT2的N-端部分肽的单克隆抗体的构建

[0652] (1)制备免疫原

[0653] 为了与载体蛋白结合，使用自动化合成机（PSSM-8，岛津制作所社制造）合成SEQ ID NO:14表示的C-端附加了Cys的人类ASCT2基因的N-端部分肽(从N-端起2至16位氨基酸残基)。

[0654] 为了提高免疫原性，如下制备与KLH(和光纯药社制造）的结合物，并用作免疫原。亦即，将KLH溶解在PBS中至浓度为10mg/mL，然后将1/10体积的N-(间-马来酰亚胺苯甲酰氧基)琥珀酰亚胺(MBS，Nacalai Tesque制造，25mg/mL)逐滴添加到其中，然后在搅拌下反应30分钟。反应溶液通过预先用PBS平衡的凝胶过滤柱(Sephadex G-25柱，GE Healthcare制造)，除去未反应的MBS，得到KLH-MBS。附加了Cys的人类ASCT2的N-端部分肽(1mg)溶解在磷酸钠缓冲液(0.1mol/L，pH7.0)中，向其中添加2.5mg KLH-MBS，然后在搅拌下于室温中反应3小时。反应完成之后，反应溶液对PBS透析，从而获得人类ASCT2N端肽-KLH结合物作为免疫原。

[0655] (2)动物的免疫和抗体产生细胞的制备

[0656] 将上面(1)得到的人类ASCT2N端肽-KLH结合物(100μg)与2mg铝凝胶和1x109细胞的百日咳疫苗(千叶县血清研究所制造)一起施用至4-周龄雌性SD大鼠(日本SLC出产)。第一次给药之后两周，将结合物(100μg)每周一次再施用于所述大鼠，总计四次。从大鼠的尾静脉收集血液，其与人类ASCT2部分肽的反应性通过以下的酶免疫分析调查。
最后免疫的三天之后，从显示出足够抗体滴度的大鼠摘出脾脏。

[0657] 脾脏在MEM(日水制药社制造)中细细切碎，用镊子分散，在1,200rpm下离心5分钟(CR5B，日立制作所制造)。向得到的沉淀级分中添加Tris-氯化铵缓冲液(pH7.65)，反应1至2分钟，以除去红血球。作为沉淀级分得到的细胞级分用MEM洗三次，从而制备抗体产生细胞。

[0658] (3)酶免疫分析

[0659] 根据以下方法，将SEQ ID NO:14表示的人类ASCT2的附加Cys的N-端部分肽制备成与甲状腺球蛋白(以下称为“THY”)的结合物的形式。结合物的构建方法与(1)相同，但是使用4-(N-马来酰亚胺甲基］-环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯代替MBS。

[0660] 得到的人类ASCT2 N端肽-THY结合物(10μg/mL，50μL/孔)分配到96-孔EIA板(Greiner制造)中，在4°C静置过夜以便吸附。洗掉未吸附的结合物之后，向板添加1%BSA-PBS(100μL/孔)，然后在室温反应1小时，封阻剩余的活性基团。洗掉未反应的BSA-PBS之后，将50μL/孔的被测物质例如抗血清或培养上清液作为第一抗体分配到板中，然后反应2小时。将板用0.05% Tween-PBS洗涤，并将50μL/孔稀释的过氧化物酶标记的抗大鼠免疫球蛋白(Dako制造)作为第二抗体加到板中，然后在室温反应1小时。在板用0.05% Tween-PBS洗涤之后，在孔中添加2,2-连氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)铵(ABTS)底物溶液[ABTS(和光纯药社制造，1mmol/L)，柠檬酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH4.2)，和H2O2(0.1%)］，然后显色。在样品波长415nm和参考波长490nm下的吸光度(OD415-OD490)使用读板器(Emax微板读板器，Molecular Devices)测量。

[0661] (4)小鼠骨髓瘤细胞的制备

[0662] 8-氮杂鸟嘌呤-抗性小鼠骨髓瘤细胞系P3-U1[P3X63Ag8U.l,ATCC编号：CRL-1597,European Journal of Immunology,6,511(1976)]培养在于RPMI1640培养基-5
(Invitrogen制造)中添加了谷氨酰胺(1.5mmol/L)、 2-巯基乙醇(5xl0 mol/L)、庆大霉素(10μ.g/mL)和FBS(10%)的培养基(以下称为“正常培养基”)中以确保细胞融合必要
7
的2x10 个以上的细胞计数，并在细胞融合中作为亲本细胞提供。

[0663] (5)杂交瘤的制备

[0664] 在(2)中得到的抗体产生细胞和(4)中得到的骨髓瘤细胞以10:1的比例混合，并将得到的细胞以1,200rpm离心5分钟(CR5B，日立制作所制造)。弃去上清液并充8
分分散沉淀的细胞。在37°C和搅拌下，每1x10 个抗体产生细胞加入PEG 1000(1g)、MEM(Invitrogen制造，1mL)和二甲基亚砜(0.35mL)的混合物0.5mL，并数次每隔1至2分钟向悬液添加MEM(1mL)，然后添加MEM至总量为50mL。900rpm下离心5分钟之后(CR5B，日立制作所制造)，弃去上清液并缓慢打散沉淀的细胞。然后，通过轻柔地上下吹吸，将细胞悬浮在100mL添加了HAT培养基补充剂(Invitrogen制造)的正常培养基(以下称为“HAT培养基”)中。

[0665] 在96-孔培养板中，分配200uL/孔得到的悬液，并在5%CO2培养箱中37℃培养10至14天。

[0666] 培养之后，培养上清液通过(3)中记载的酶免疫分析进行检查，选择特异性与人类ASCT2的N-端部分肽反应的孔。选择的孔中包含的细胞通过有限稀释法克隆两次，得到产生对抗ASCT2的N端部分肽的单克隆抗体的杂交瘤KM3842。使用亚类分型试剂盒(ABT Sarotech制造)，KM3842的抗体亚类被确定为是大鼠IgG2a(图4)。

[0667] (6)获得纯化的单克隆抗体

[0668] (5)中得到的杂交瘤(5x106-20x106细胞/动物)腹膜内注射到降植烷处理的8周龄雌性裸鼠(Balb/c，日本SLC出产)中。10至21天之后，杂交瘤变成腹水癌。从产生腹水的小鼠收集腹水(1-8mL/动物)。然后，将腹水以3,000rpm离心5分钟(CR5B，日立制作所制造)，以除去固形 成分。得到的溶液通过辛酸沉淀法[Antibodies-A Laboratory Manual(抗体-实验室手册),Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]纯化，获得纯化的KM3842抗体。

[0669] 实施例4:ASCT2的N端部分肽与纯化的单克隆抗体的反应性调查

[0670] 根据实施例3(3)中记载的酶免疫分析法，考察单克隆抗体KM3842与ASCT2的N端部分肽的反应性。实施例3(6)中得到的纯化的抗体KM3842用1%BSA-PBS分别稀释至10、1、0.1、0.01、0.001和0.0001μg/mL的浓度，并用作一级抗体。测量结果如图4所示，抗体KM3842显示出与ASCT2的N端部分肽的特异反应性。

[0671] 实施例5：对抗ASCT2的细胞外区域的单克隆抗体的构建

[0672] (1)制备免疫原

[0673] 实施例2得到的导入人类ASCT2-myc/His基因的CHO细胞系培养在含有10%FBS的IMDM(Invitrogen制造)中2至3天，并使用0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)溶液(Nacalai6 7
Tesque制造)剥离。细胞悬浮在PBS中，达到每个免疫动物为6x10-1x10 个细胞的细胞计数。

[0674] (2)动物的免疫和抗体产生细胞的制备

[0675] (1)中得到的细胞悬液与1x109个细胞的百日咳疫苗(千叶县血清血清研究所制造)一起，施用于6-周龄雄性BXSB小鼠(n=3/组，日本SLC出产)或4-周龄雌性SD大鼠(n=3/组，日本SLC出产)。给药一周之后，所述细胞悬液每周一次施用于所述动物，总计四次。此后，从小鼠的眼底或大鼠的尾静脉收集血液。血液中其抗体滴度使用以下细胞基分析系统(ABI 8200细胞检测系统，Applied Biosystems制造)或流式细胞仪(Cytomics FC500 MPL，Beckman Coulter制造)，通过荧光细胞染色法测量。最后免疫的三天之后，从显示出足够抗体滴度的小鼠或大鼠摘出脾脏。

[0676] 用和实施例3(2)一样的方法，从得到的脾脏制备抗体产生细胞。

[0677] (3)荧光细胞染色法-1(细胞基分析系统)

[0678] 实施例2中得到的导入ASCT2-myc/His基因的CHO细胞系和导入载体的CHO细胞用作分析细胞。每种细胞在含有10%FBS的IMDM(Invitrogen制造)中培养2至3天，并用悬4
浮在相同培养基中的胰蛋白酶-EDTA溶液(Invitrogen制造)剥离，以1x10 细胞/100μL培养基/孔的细胞密度接种在ABI8200黑色96-孔板中，并培养过夜。将被测物质例如抗血清或培养上清液(10μL/孔)分配至板中作为第一抗体，然后添加100μL/孔的ALEXA
647-标记的抗小鼠免疫球蛋白G(H+L)或ALEXA647-标记的抗大鼠免疫球蛋白G(H+L)(以上均由Invitrogen制造)作为第二抗体，然后遮光下静置4小时。用激光器(633nm He/Ne)激发的650至685nm的荧光通过ABI8200细胞检测系统(Applied Biosystems制造)进行测量。

[0679] (4)荧光细胞染色法-2(流式细胞仪)

[0680] 实施例2得到的导入人类ASCT2-myc/His基因的CHO细胞系和导入载体的CHO细胞用作分析细胞。每种细胞在含有10% FBS的IMDM(Invitrogen制造)中培养2至3天并用0.02%EDTA溶液(Nacalai Tesque制造)剥离，将它们用PBS洗涤，并使用1%BSA-PBS在冰温
5
下封阻20分钟，以避免非特异性抗体吸附。得到的细胞以5x10 细胞/50μL/孔的细胞密度接种在96-孔U形底板中，然后以1,800rpm离心2分钟(05PR-22，日立工机社制造)，然后除去上清液。分配被测物质(50μL/孔)例如抗血清或培养上清液作为第一抗体，然后在冰温下反应30分钟。使用PBS通过离心法洗涤3次，并添加50μL/孔的ALEXA488标记的抗小鼠免疫球蛋白G(G+L)或ALEXA488标记的抗大鼠免疫球蛋白G(G+L)(均由Invitrogen制造)作为第二抗体，然后遮光下在冰温下反应30分钟。细胞再次使用PBS通过离心洗涤三次之后，将细胞悬浮在PBS中，用488nm Ar激光器激发的510至530nm的荧光通过流式细胞仪(Cytomics FC500 MPL，Beckman Coulter制造)测量。

[0681] (5)杂交瘤的构建

[0682] 用和实施例3(5)一样的方法，在(2)中得到的抗体产生细胞和实施例3(4)得到的骨髓瘤细胞之间进行细胞融合。

[0683] 接着，将细胞融合得到的细胞悬浮在HAT培养基中。将得到的细胞悬液以200uL/孔分配到96-孔培养板中，细胞在5%CO2培养箱中37℃培养8至10天。

[0684] 培养后的上清液的反应性通过上面(3)和(4)记载的荧光细胞染色法确认，并选择与导入人类ASCT2-myc/His基因的CHO细胞系起反应而不与导入载体的CHO细胞起反应的孔。然后，将选出的孔中包含的细胞通过有限稀释法克隆两次，以得到产生对抗ASCT2的细胞外区域的单克隆抗体的杂交瘤KM3998、KM4000、KM4001、KM4008、KM4012和KM4018。

[0685] 在得到的杂交瘤当中，按照以下方法测定小鼠单克隆抗体的亚类。

[0686] 将抗小鼠免疫球蛋白兔多克隆抗体(Dako制造，10μg/mL，50μL/孔)分配到96-孔EIA板(Greiner制造)中，并在4°C静置过夜进行吸附。洗掉未吸附的结合物之后，向板添加1% BSA-PBS 100μL/孔，然后在室温反应1小时，以封阻剩余的活性基团。
洗掉未反应的BSA-PBS之后，将50μL/孔的被测物质分配到板中，然后反应2小时。将板用0.05%Tween-PBS洗涤，并将稀释的亚类特异性过氧化物酶标记的抗小鼠免疫球蛋白(Invitrogen制造，50μL/孔)作为第二抗体加到板中，然后在室温反应1小时。将板用
0.05% Tween-PBS洗涤，并添加实施例3(3)使用的ABTS底物溶液进行显色。然后，在样品波长415nm和参考波长490nm下的吸光度(OD415-OD490)使用读板器(Emax微板读板器，Molecular Devices)测量。所属亚类不能通过以上提到的方法确定的小鼠单克隆抗体的亚类使用小鼠大鼠单克隆同种型分型试剂盒(大日本住友制药社制造)测定。此外，大鼠单克隆抗体的亚类使用大鼠单克隆同 种型分型试剂盒(大日本住友制药社制造)测定。

[0687] 表1示出动物物种和来源于各个杂交瘤的抗体一览表。

[0688] 表1

[0689]KM号 动物物种 抗体类别
KM3842 大鼠 IgG2a
KM4000 小鼠 IgG2b
KM4001 小鼠 IgG1
KM4008 小鼠 IgG2
KM4012 小鼠se IgG2b
KM4018 大鼠 IgG2a

[0690] (6)纯化的单克隆抗体-1的获得

[0691] 按照以下方法得到纯化的抗体KM3998。

[0692] (5)中得到的杂交瘤(5x106-20x106细胞/动物)腹膜内注射到降植烷处理的8-周龄雌性裸鼠(Balb/c，日本SLC出产)中。当杂交瘤在10至21天发展出腹水肿瘤时，从小鼠收集腹水(1-8mL/动物)。然后，将腹水进行过滤[5m，聚醚砜(PES)膜，Pall制造］以除去固形成分，然后用辛酸沉淀法纯化[Antibodies-A Laboratory Manual(抗体-实验室手册),Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]。

[0693] (7)纯化的单克隆抗体-2的获得

[0694] 按照以下方法，得到KM4000、KM4001、KM4008、KM4012和KM4018每个的纯化抗体。

[0695] 上面(5)得到的各个杂交瘤在含有10% FBS的RPMI1640中于5%CO2培养箱中37℃培养。在细胞计数为5x107个细胞时，以1,200rpm 离心5分钟(CR5B，日立制作所社制造)，弃去上清液。得到的细胞以1x105细胞/mL的细胞密度悬浮在包含5%Daigo's GF21(和光纯药社制造)的杂交瘤-SFM(Gibco制造)，至500mL的体积，然后在5% CO2培养箱中37℃培养三天。得到的细胞悬液以1,500rpm离心5分钟，并将得到的上清液通过瓶顶过滤器(0.2μm，PES膜，Corning制造)过滤。

[0696] KM4000、KM4001、KM4008和KM4012使用蛋白A结合树脂(Millipore制造)进行纯化，KM4018使用蛋白G结合树脂(Millipore制造)进行纯化。每种树脂填入1mL微柱中，并将10mL平衡缓冲液通过它以达到平衡。所用的平衡缓冲液对于蛋白A-结合树脂是甘氨酸(1mol/L)-氯化钠(0.15mol/L)(pH8.6)，对于蛋白G-结合树脂是甘氨酸(0.5mol/L)-PBS(pH7.4)。过滤处理后得到的培养上清液以大约100mL/h的流速过柱，然后用10mL所述平衡缓冲液洗柱。之后，吸附到柱上的抗体用柠檬酸缓冲液(0.1mol/L，pH3.0)洗脱。在预先装有80μLTris(2mol/L，pH8.0)的试管中，将洗脱的抗体以500μL/试管分份。然后，使用紫外可见光分光光度计(UV-1600，岛津制作所社制造)测量每个试管的吸光度(OD280nm)，并回收检测到蛋白的级分。在4°C下的PBS中过夜透析之后，将级分过滤(0.2μm，PES膜，Pall制造)，并从280nm处的吸光度(OD280nm)计算抗体浓度[OD280nm测量值(A)/1.4=蛋白浓度(mg/mL)］。

[0697] 实施例6：纯化的单克隆抗体与ASCT2的细胞外区域的反应性评价

[0698] (1)荧光细胞染色法(流式细胞仪)

[0699] 实施例2得到的导入人类ASCT2-myc/His基因的CHO细胞、导入载体的CHO细胞和多发性骨髓瘤细胞系KMS-11(HSRKB编号：JCRB1179)分别在5% CO2培养箱中37℃培养3至4天。导入人类ASCT2-myc/His基因的CHO细胞和导入载体的CHO细胞用0.02%的EDTA溶液(Nacalai Tesque制造)剥离，并用PBS、0.02%EDTA和0.05%叠氮化钠的混合溶液洗涤。
另外，为了避免抗体的非特异性吸附，将 细胞在冰温下封阻30分钟，导入人类ASCT2-myc/His基因的CHO细胞和导入载体的CHO细胞使用1%BSA-PBS封阻，KMS-11使用100μg/mL
5 5
人类IgG(Sigma制造)封阻。细胞接种在96-孔U形底板中，使得密度为1x10-5xl0 细胞/100μL/孔，并以1,500rpm离心5分钟(05PR-22，日立工机社制造)，然后除去上清液。
待测物质作为第一抗体、即纯化的抗体与大鼠IgG2a-UNLB(阴性对照，Beckman Coulter制造)或KM511{阴性对照，抗G-CSF衍生抗体[Agric.Biol Chem.,53，1095(1989)]，小鼠IgGl}在1% BSA-PBS、0.02% EDTA和0.05%叠氮化钠的混合溶液中稀释到终浓度10μg/mL（以下称为“稀释溶液A”），得到的溶液以100μL/孔的量添加，然后在冰温下反应60分钟。用稀释溶液A洗涤两次之后，加入用稀释溶液A稀释的ALEXA488-标记的抗小鼠免疫球蛋白G(G+L)(Invitrogen制造)100μL/孔或ALEXA488-标记的抗大鼠免疫球蛋白G(G+L)(Invitrogen制造)100μL/孔、或者FITC-标记的抗小鼠κ链抗体(Southern Biotech制造)或FITC-标记的抗大鼠κ链抗体(Southern Biotech制造)100μL/孔作为第二抗体，然后在遮光下在冰温下反应30分钟。再次用稀释溶液A洗涤三次，将细胞悬浮在PBS中，通过流式细胞仪(Cytomics FC500 MPL，Beckman Coulter制造)测量荧光强度。

[0700] 图5和6显示测量结果。

[0701] 如图5所示，KM3998显示出与导入人类ASCT2-myc/His基因的CHO细胞和表达ASCT2mRNA的KMS-11具有高度结合活性，但是与导入载体的CHO细胞没有结合活性。阴性对照抗体大鼠IgG2a-UNLB没有对任何种类的细胞显示出结合活性。这些结果证明，KM3998对于ASCT2-表达细胞具有特异性结合活性。

[0702] 另外，如图6所示，KM4000、KM4001、KM4008、KM4012和KM4018显示出与导入人类ASCT2-myc/His基因的CHO细胞和表达ASCT2-mRNA的KMS-11的强结合活性(平均荧光强度)，但是没有显 示出与导入载体的CHO细胞的结合活性。另外，阴性对照抗体，即大鼠IgG2a-UNLB和KM511没有对任何种类的细胞显示显示出结合活性。这些结果证明，KM4000、KM4001、KM4008、KM4012和KM4018与ASCT2-表达细胞具有特异性结合活性。

[0703] (2)蛋白质印迹法

[0704] 向实施例2得到的导入人类ASCT2-myc/His基因的CHO细胞、导入载体的CHO细胞、多发性骨髓瘤细胞系KMS-11(HSRRB编号：JCRB1179)和结肠直肠癌细胞系WiDr(ATCC7
编号：CCL-218)的每一种中，以每5x10 细胞1mL的量添加Tris-HCl(50mmol/L,pH7.2)、
1%Triton X-100、氯化钠(150mmol/L)、氯化镁(2mmol/L)、氯化钙(2mmol/L)、0.1%叠氮化钠、苯甲基磺酰氟(PMSF,5μmol/L)、N-乙基马来酰亚胺(50mmol/L)、亮肽素(1mg/mL)和二硫苏糖醇(0.1mmol/L)的混合溶液(以下称为“细胞溶解缓冲液A”)，并将所得溶液在4℃
4
静置2小时。离心溶液，得到上清液用作细胞裂解液。每种细胞裂解液5x10 细胞/道使用SDS-聚丙烯酰胺电泳(PAGEL，Atto制造)分级，并转移到PVDF膜(Millipore制造)。用
10%BSA-PBS封阻转移的PVDF膜之后，将作为第一抗体的每种被测物质，即纯化的抗体、实施例3得到的KM3842(阳性对照)、大鼠IgG2a-UNLB(阴性对照，Beckman Coulter制造)和KM511(阴性对照)，在1%BSA-PBS中稀释到10g/mL的浓度，然后在4℃反应过夜。将得到的PVDF膜用0.1%Tween-PBS(以下称为“PBST”)彻底洗涤，然后与第二抗体、即过氧化物酶标记的抗小鼠免疫球蛋白G(H+L)(Zymed制造)或过氧化物酶标记的抗大鼠免疫球蛋白G(H+L)(Dako制造)在室温中反应1小时。PVDF膜再次用PBST彻底洗涤，并使用ECLWestern印迹法检测试剂(Amersham Pharmacia制造)检测抗体结合条带。

[0705] KM3842可以检测到分子量75kDa左右的条带，该分子量对应于导入人类ASCT2-myc/His基因的CHO细胞、表达ASCT2 mRNA的KMS-11细胞和WiDr细胞中ASCT2的分子量，但是KM3998、KM4000、 KM4001、KM4008、KM4012和KM4018检测不到ASCT2。此外，没有发现针对导入载体的CHO细胞的任何抗体反应性。

[0706] 从以上流式细胞术和Western印迹法的结果认为，KM3998、KM4000、KM4001、KM4008、KM4012和KM4018每一种的结合活性因ASCT2的SDS变性而丧失，证明KM3998、KM4000、KM4001、KM4008、KM4012和KM4018是识别ASCT2的天然三维结构并与其结合的抗体。

[0707] (3)免测沉淀法

[0708] 向实施例2得到的导入人类ASCT2-myc/His基因的CHO细胞和导入载体的CHO7
细胞的每一种中，以每2x10 细胞1mL的量添加Tris-HCl(50mmoI/L,pH7.5)、1% Triton X-100、氯化钠(150mmol/L)、EDTA(5mmol/L)、0.1%SDS、0.5%脱氧胆酸钠、蛋白酶抑制剂混合物(Roche Diagnostics制造)和磷酸酶抑制剂混合物(Roche Diagnostics制造)的混合溶液(以下称为“细胞溶解缓冲液B”)，并将得到的溶液在4°C搅拌30分钟，然后离心(CF15D，日立工机社制造)。得到的上清液的蛋白浓度使用蛋白分析试剂(Bio-Rad制造)测量并用细胞溶解缓冲液B调整到5mg/mL，用作细胞裂解液。

[0709] 然后，2μg的每种被测物质，即纯化的抗体、实施例3得到的KM3842(阳性对照)、大鼠IgG2a-UNLB(阴性对照，Beckman Coulter制造)和KM511(阴性对照)，与1mg所得到的细胞裂解液在4℃混合1小时。

[0710] 用0.1% BSA-PBST(300uLl)，将蛋白G-琼脂糖珠(Amersham制造，30μL)或蛋白A-琼脂糖珠(Amersham制造，30μL)预处理30分钟以上，然后离心除去上清液，将珠子悬浮在Tris-HCl(50mmol/L,pH7.5)、1% Triton X-100、氯化钠(150mmol/L)、EDTA(5mmol/L)蛋白酶抑制剂混合物(Roche Diagnostics制造)的混合溶液(以下称为“珠洗涤缓冲 液”)(90μL)中。

[0711] 向珠子悬液中，添加抗体和细胞裂解液的混合溶液(100μL)并在4C混合2小时，然后通过离心回收珠子。将回收的珠子用珠子洗涤缓冲液洗涤三到五次，并溶解在2% SDS、Tris-HCl(62mmol/L,pH6.8)和10%甘油的混合溶液(以下称为“SDS-PAGE样品缓冲液”)中。得到的溶液通过下面的免疫印迹法分析。

[0712] 得到的溶液通过SDS-聚丙烯酰胺电泳分级并转移到PVDF膜(Millipore制造)。得到的PVDF膜用5%脱脂牛奶-PBST封阻，并与实施例3得到的3.5μg/mL KM3842(阳性对照)作为第一抗体在室温中反应2小时。将得到的PVDF膜用PBST彻底洗涤，并与过氧化物酶标记的抗大鼠免疫球蛋白G(H+L)(Dako制造)在室温中反应1小时。PVDF膜再次用PBST彻底洗涤，并使用ECLWestern印迹法检测试剂(Amersham Pharmacia制造)检测抗体结合条带。

[0713] KM4000、KM4001、KM4008、KM4012、KM4018和阳性对照抗体KM3842可以检测到分子量75kDa左右的条带。结果证明，KM4000、KM4001、KM4008、KM4012和KM4018是可以通过免测沉淀反应检测ASCT2并识别ASCT2的三维结构的抗体。

[0714] (4)对ASCT2介导的细胞内摄取氨基酸的抑制活性

[0715] 将人类结肠直肠癌细胞系WiDr(ATCC编号：CCL-218)在含有10%透析过的失活的胎牛血清(以下称为dFBS，Invitrogen制造)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM，4
Invitrogen制造)(以下称为“不含谷氨酰胺的培养基”)中调整到细胞密度2x10 细胞/mL，并将得到的悬液以100μL/孔接种到96-孔板中，然后在5% CO2的培养箱中37°C培养24小时。

[0716] 将每种被测物质，即纯化的抗体、大鼠IgG2a-UNLB(阴性对照， Beckman Coulter制造)、KM511(阴性对照)或谷氨酰胺-竞争性氨基酸混合物[AST混合物，丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸(均为Sigma制造)的混合物，各］，用PBS稀释到终浓度31.6-0.03μg/mL。之后，孔中加入得到的溶液20μL/孔，并加入20μL/孔在不含谷氨酰胺的培养基中制备成终浓度0.2mmol/L的的谷氨酰胺溶液(Invitrogen制造)。向对照的孔和空白板的孔中，添加PBS(20μL/孔)和上述谷氨酰胺溶液(20μL/孔)。添加抗体之后，除了空白板之外的板在5% CO2的培养箱中37°C培养72小时。

[0717] 此外，其中添加20uL/孔在不含谷氨酰胺的培养基中稀释到50%的{4-[3-(4-碘代苯基)-2-(4-硝基苯基)-2H-5-四氮唑］-1,3-苯二磺酸酯}(以下称为“WST-1试剂”，Roche Diagnostics制造)，然后另外在37°C培养2小时。

[0718] 使用微板分光光度计(Emax微板读数器，Molecular Devices制造)，测量450nm处的吸光度(对照波长650nm)。通过考虑未加抗体的对照孔的吸光度作为100%和空白板的孔的吸光度作为0%，计算添加抗体的孔的相对增殖率(%)。

[0719] 测量结果显示在图7和8中。

[0720] 如图7所示，KM3998显示出在高浓度下轻度抑制细胞增殖，但是它的抑制效果低于谷氨酰胺竞争性氨基酸混合物。因此发现，KM3998对ASCT2的中和活性低。

[0721] 另外，如图9所示，KM4000、KM4001、KM4008、KM4012和KM4018全都依赖抗体浓度强力抑制细胞增殖。结果证明，KM4000、KM4001、KM4008、KM4012和KM4018强力中和ASCT2对于细胞内摄取谷氨酰胺的功能并因而展现出对抗癌细胞增殖的显著抑制活性。

[0722] 实施例7：编码抗ASCT2单克隆抗体可变区的cDNA的分离和分析

[0723] (1)从抗-ASCT2单克隆抗体产生杂交瘤细胞制备mRNA

[0724] 从实施例5(5)中得到的各个杂交瘤KM4008、KM4012和KM4018的5x107细胞，使用RNeasy Maxi试剂盒(Qiagen制造)和Oligotex-dT30mRNA纯化试剂盒(Takara Bio制造)按照附带的说明书制备大约6μg的mRNA。

[0725] (2)抗ASCT2单克隆抗体的H链和L链可变区的基因克隆

[0726] 按照附带说明书使用BD SMART RACE cDNA扩增试剂盒(BD Biosciences制造)，从(1)中得到的KM4008、KM4012和KM4018的0.6μgmRNA中，得到各自在5'-端包含试剂盒附有的BD SMART IIA寡聚核苷酸的核苷酸序列的cDNA。

[0727] 得到的cDNA用作模板，使用试剂盒附带的通用引物A混合物和SEQ ID NO:15和16表示的小鼠Ig(γ)-特异性引物(mG3a2或mG2bal)或SEQ ID NO:43表示的大鼠Ig(γ)-特异性引物(rG2a)进行PCR，扩增VH的cDNA片段。使用SEQ ID NO:17表示的小鼠Ig(κ)-特异性引物(mKal)或SEQ ID NO:44表示的大鼠Ig(κ)-特异性引物(rKa2)代替Ig(γ)-特异性引物来进行另一个PCR，扩增VL的cDNA片段。

[0728] 对于大鼠Ig(κ)-特异性引物(rKa2)的PCR如下进行：94°C加热5分钟；40个循环，每个由在94°C反应15秒、68°C反应30秒和72°C反应3分钟组成；然后在72°C反应10分钟。另一种PCR如下进行：94°C加热5分钟；5个循环，每个由在94°C反应15秒和在72°C反应3分钟组成；5个循环，每个由在94°C反应15秒和72°C反
应3分30秒组成；和30个循环，每个由在94°C反应15秒、68°C反应30秒和72°C反
应3分钟组成，然后在72°C反应10分钟。PCR使用PTC-200DNA Engine(Bio-Rad制造)进行。得到的PCR产物的H链和L链的尺寸是H链和L链分别大约700bp和大约800bp。

[0729] 为了测定得到的PCR产物的核苷酸序列，PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳分离和使用凝胶提取试剂盒(Qiagen制造)提取。得到的提取片段使用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen制造)连接到pCR4 TOPO中，并使用科恩等的方法[Proc.Natl Acad Set USA,69,2110(1972)]，用得到的载体转化大肠杆菌DH5α(东洋纺织社制造)。使用自动化质粒分离系统PI-50(Kurabo制造)，从得到的转化体提取质粒以获得质粒，然后使用Big Dye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction试剂盒(PE Biosystems制造)按照附带的说明书进行反应，然后使用DNA测序仪ABI PRISM 3700(PE Biosystems制造)分析核苷酸序列。

[0730] 结果，制备了包含KM4008的全长H链cDNA的质粒08H2b10、包含KM4008的全长L链cDNA的质粒08La4、包含KM4012的全长H链cDNA的质粒12Ha5、包含KM4012的全长L链cDNA的质粒12La4、包含KM4018的全长H链cDNA的质粒18rHal和包含KM4018的全长L链cDNA的质粒18Lb3，其中被推定为起始密码子的ATG序列存在于cDNA的5’-端。

[0731] 分别地，包含KM4008的H链cDNA的质粒08H2b10中所含的VH全长核苷酸序列由SEQ ID NO:18表示，包含从质粒08H2b10中所含的VH全长核苷酸序列推出的信号序列的分泌型VH全长氨基酸序列由SEQ ID NO:19表示；包含KM4008的L链cDNA的质粒08La4中所含的VL全长核苷酸序列由SEQ ID NO:20表示，包含从质粒08La4中所含的VL全长核苷酸序列推出的信号序列的分泌型VL全长氨基酸序列由SEQ ID NO:21表示；包含KM4012的H链cDNA的质粒12Ha5中所含的VH全长核苷酸序列由SEQ ID NO:22表示，包含从质粒12Ha5中所含的VH全长核苷酸序列推出的信号序列的分泌型VH全长氨基酸序列由SEQ ID NO:23表示；包含KM4012的L链cDNA的质粒12La4中所含的VL全长核苷酸序列由SEQ ID NO:24表示，包含从质粒12La4中所含的VL全长核苷酸序列推出的信号序列的分泌型VH全长氨基酸 序列由SEQ ID NO:25表示；包含KM4018的H链cDNA的质粒18rHal中所含的VH全长核苷酸序列由SEQ ID NO:45表示，包含从质粒18rHal中所含的VH全长核苷酸序列推出的信号序列的分泌型VH全长氨基酸序列由SEQ ID NO:46表示；包含KM4018的L链cDNA的质粒18Lb3中所含的VL全长核苷酸序列由SEQ ID NO:47表示，包含从质粒18Lb3中所含的VL全长核苷酸序列推出的信号序列的分泌型VL全长氨基酸序列由SEQ ID NO:48表示。

[0732] (3)抗ASCT2单克隆抗体V区的氨基酸序列分析

[0733] 实施例5(7)中得到的纯化的单克隆抗体KM4008、KM4012和KM4018中，H链和L轻链的N端氨基酸序列使用蛋白测序仪(PPSQ-10，岛津制作所社制造)分析，并确定大约20个残基。从所得到的分析结果与从(2)中得到的各抗体的核苷酸序列推出的氨基酸序列的比较中发现，各个序列和相应的序列一致，因此确认，(2)中得到的核苷酸序列是目的抗体的核苷酸序列。另外，从与已知的小鼠抗体或大鼠抗体的氨基酸序列数据[SEQUENCES of Proteins of Immunological Interest（免疫学重要的蛋白序列）,美国卫生与人类服务部（US Dept.Health and Human Services）(1991)]的比较中知道，分离的cDNA是编码包含分泌型信号序列的抗ASCT2单克隆抗体KM4008、KM4012和KM4018的全长cDNA；KM4008的H链和L链的分泌型信号序列分别是SEQ ID NO:19表示的氨基酸序列中1至1第9位的氨基酸序列和SEQ ID NO:21表示的氨基酸序列中1至第20位的氨基酸序列；KM4012的H链和L链的分泌型信号序列分别是SEQ ID NO:23表示的氨基酸序列中1至1第19位的氨基酸序列和SEQ ID NO:25表示的氨基酸序列中1至第20位的氨基酸序列；KM4018的H链和L链的分泌型信号序列分别是SEQ ID NO:46表示的氨基酸序列中1至第19位的氨基酸序列和SEQ ID NO:48表示的氨基酸序列中1至第20位的氨基酸序列。

[0734] 然后，使用抗ASCT2单克隆抗体的VH和VL的氨基酸序列，通过BLASTP方法[Nucleic Acid Res.25,3389(1997)]调查已知蛋白的氨 基酸序列数据库。结果，两者的VH和VL没有发现完全同样的氨基酸序列，确认抗ASCT2单克隆抗体KM4008、KM4012和KM4018的VH和VL具有新的氨基酸序列。

[0735] 另外，抗ASCT2单克隆抗体KM4008、KM4012和KM4018的VH和VL的CDR序列通过将它们与已知抗体的氨基酸序列进行比较加以鉴别。抗ASCT2单克隆抗体KM4008的VH的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别由SEQ ID NO:26、27和28表示，其VL的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别由SEQ ID NO:29、30和31表示；抗ASCT2单克隆抗体KM4012的VH的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别由SEQ ID NO:32、33和34表示，其VL的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别由SEQ ID NO:35、36和37表示；抗ASCT2单克隆抗体KM4018的VH的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别由SEQ ID NO:49、50和51表示，其VL的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别由SEQ ID NO:52、53和54表示。

[0736] 实施例8：抗ASCT2人嵌合抗体的构建

[0737] (1)抗ASCT2人嵌合抗体表达载体cKM4008_93的构建

[0738] 使用表达人源化抗体的载体pKANTEX93(WO97/10354)以及均在实施例7(2)中得到的包含KM4008的H链cDNA的质粒08H2b10和包含KM4008的L链cDNA的质粒08La4，如下构建抗ASCT2人嵌合抗体表达载体cKM4008_93。

[0739] PCR用和实施例2一样的方法进行。向作为模板的质粒08H2b10(100ng)中，加入具有SEQ ID NO:38和39表示的核苷酸序列的引物(10μmol/L，各1μL)、10×Ex Taq缓冲液(5μL)、dNTP(2.5mmol/L,4μL)和Ex Taq聚合物(1μL，均由Takara Bio制造)，然后加入无菌水至总量50μL。如下进行PCR：96℃变性2分钟；30个循环，每个由在94℃反应1分钟、55℃反应1分钟和72℃反应1分钟组成；然后在72℃反应5分钟。结果，扩增了编码KM4008的VH的基因片段，片段中加 入了用于插入pKANTEX93的限制性酶识别序列。

[0740] 另外，使用作为模板的质粒08La4(100ng)、具有SEQ ID NO:40和41表示的核苷酸序列的引物(10μmol/L，各1μL)、10×Ex Taq缓冲液(5μL)、dNTP(2.5mmol/L,4μL)和Ex Taq聚合物(1μL，均由Takara Bio制造)，按照与上面同样的方式进行PCR以扩增编码KM4008的VL的基因片段，片段中加入了用于插入pKANTEX93的限制性酶识别序列。

[0741] 每个得到的反应产物通过琼脂糖凝胶电泳分离，并使用凝胶提取试剂盒(Qiagen制造)提取大约0.5-kbp的扩增片段。按照实施例7(2)中同样的办法，得到的基因片段使用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen制造)连接到pCR4 TOPO载体中，并用连接的产物转化大肠杆菌DH5α(东洋纺织社制造)，从而获得包含KM4008的VH的编码核苷酸序列的质粒08VH3和包含KM4008的VL的编码核苷酸序列的质粒08VL6。

[0742] 得到的质粒08VH3用限制性酶Apal(Takara Bio制造)和Notl(Takara Bio制造)消化，质粒08VL6用限制性酶EcoRI(Takara Bio制造)和BsiWI(Takara Bio制造)消化，并通过质粒的琼脂糖凝胶电泳分离而分离。得到的大约0.5-kbp基因片段使用凝胶提取试剂盒(Qiagen制造)进行提取。

[0743] 得到的质粒08VL6的消化片段连接到用相同的限制性酶EcoRI(Takara Bio制造)和BsiWI(Takara Bio制造)消化的pKANTEX93载体中。采用和实施例7(2)相同的方式，用连接的产物转化大肠杆菌DH5α(东洋纺织社制造)，使用质粒分离试剂盒(Qiagen制造)得到插入了KM4008的VL的pKANTEX93载体。

[0744] 插入了KM4008的VL的pKANTEX93载体用ApaI(Takara Bio制造)和NotI(Takara Bio制造)消化，并连接到上面的质粒08VH3-消化的 片段中。然后，采用和实施例7(2)相同的方式，用连接的产物转化大肠杆菌DH5α(东洋纺织社制造)，使用质粒分离试剂盒(Qiagen制造)得到插入了KM4008的VH和VL的载体cKM4008_93。

[0745] (2)抗ASCT2人嵌合抗体表达载体cKM4012_93的构建

[0746] 用和(1)相同的方式，从表达人源化抗体的载体pKANTEX93(WO97/10354)、以及在实施例7(2)中得到的包含KM4012的H链cDNA的质粒12Ha5和包含KM4012的L链cDNA的质粒12La4，构建抗ASCT2人嵌合抗体表达载体cKM4012_93。

[0747] 使用质粒12Ha5和12La4作为模板、具有SEQ ID NO:38和42表示的核苷酸序列的VH的扩增引物和具有SEQ ID NO:40和41表示的核苷酸序列的VL的扩增引物，进行基因片段扩增。分离、提取每个得到的反应产物，并连接到pCR4TOPO载体中。用连接产物转化大肠杆菌DH5α(东洋纺织社制造)，从而得到包含KM4012的VH的编码核苷酸序列的质粒12VH1，和包含KM4012的VL的编码核苷酸序列的质粒12VL11。

[0748] 得到的质粒12VH1和12VL11分别用限制性酶消化，并分离和提取，得到质粒12VH1和质粒12VL11的片段。将每个得到的片段连接到限制性酶消化的pKANTEX93载体中。然后，用连接产物转化大肠杆菌DH5α(东洋纺织社制造)，得到插入了KM4012的VH和VL的抗ASCT2人嵌合抗体表达载体cKM4012_93。

[0749] (3)抗ASCT2人嵌合抗体表达载体cKM4018_93的构建

[0750] 用和(1)相同的方式，从表达人源化抗体的载体pKANTEX93(WO97/10354)、以及在实施例7(2)中得到的包含KM4018的H链cDNA的质粒18rHal和包含KM4018的L链cDNA的质粒18Lb3，构建抗ASCT2人嵌合抗体表达载体cKM4018_93。

[0751] 使用质粒18rHal和18Lb3作为模板、具有SEQ ID NO:55和56表示的核苷酸序列的VH的扩增引物和具有SEQ ID NO:57和58表示的核苷酸序列的VL的扩增引物，进行PCR扩增基因片段。分离、提取每个得到的反应产物，并连接到pCR4 TOPO载体中，并用连接产物转化大肠杆菌DH5α(东洋纺织社制造)，从而得到包含KM4018的VH的编码核苷酸序列的质粒18VH5，和包含KM4018的VL的编码核苷酸序列的质粒18V2L1。

[0752] 得到的质粒18VH5和18V2L1分别用限制性酶消化，并分离和提取，得到质粒18VH5和质粒18V2L1的片段。将每个得到的片段连接到限制性酶消化的pKANTEX93载体中。然后，用连接产物转化大肠杆菌DH5α(东洋纺织社制造)，得到导入了KM4018的VH和VL的抗ASCT2人嵌合抗体表达载体cKM4018_93。

[0753] (4)动物细胞中抗ASCT2人嵌合抗体的表达

[0754] 使用上面(1)得到的抗ASCT2人嵌合抗体表达载体cKM4008_93，在动物细胞中通过常规方法表达抗ASCT2人嵌合抗体[Antibody Engineering，A Practical Guide(抗体工程，实践指南),W.H.Freeman和Company(1992)]。类似的，使用抗ASCT2人嵌合抗体表达载体cKM4012_93，或抗ASCT2人嵌合抗体表达载体cKM4018_93，在动物细胞中表达各抗ASCT2人嵌合抗体。以此方式，得到产生抗ASCT2人嵌合抗体的转化体。

[0755] (5)获得纯化的抗体

[0756] 在上面(4)得到的每种转化体通过常规的培养方法培养之后，收集细胞悬液，在4℃下以3000rpm离心15分钟，回收上清液。培养上清液使用0.22-μm Millex GV过滤器(Millipore制造)进行过滤除菌。使用蛋白A高容量树脂(Millipore制造)柱，按照附带的说明书，从得到的培养上清液纯化抗ASCT2人嵌合抗体cKM4008、cKM4012和cKM4018(以下分别称为cKM4008、cKM4012和cKM4018)。

[0757] 使用梯度凝胶(目录号：E-T520L，Atto制造)，依照附带的说明书，通过SDS-PAGE验证得到的cKM4008、cKM4012和cKM4018的纯化制品的纯度和表达的分子大小。关于纯化的抗ASCT2人嵌合抗体的泳动图案，在非还原条件下发现150至200千道尔顿(以下称为“kDa”)左右分子量的一个条带，在还原条件下发现大约50kDa和大约25kDa的两个条带[Antibodies-A Laboratory Manual(抗体-实验室手册),Cold Spring Harbor Laboratory，14章(1988).Monoclonal Antibodies-Principles and Practice（单克隆抗体–原理和实践）,Academic Press Limited(1996)]。那些泳动与在相同的条件下通过SDS-PAGE得到的IgG类别的抗体结果一致。因此确认，抗ASCT2人嵌合抗体cKM4008、cKM4012和cKM4018被表达为结构正确的抗体分子。

[0758] 实施例9：抗ASCT2人嵌合抗体反应性的研究

[0759] (1)荧光细胞染色法(流式细胞仪)

[0760] 实施例2得到的导入了人类ASCT2-myc/His基因的CHO细胞和多发性骨髓瘤细胞系OPM-2(DSMZ编号：ACC50)均在5% CO2培养箱中37℃培养3至4天。导入人类ASCT2-myc/His基因的CHO细胞系用0.02%的EDTA溶液(Nacalai Tesque制造)剥离，并且为了避免抗体的非特异性吸附，所述细胞使用1% BSA-PBS在冰温下封阻30分钟。细胞接种在5 5
96-孔U形底板中，使得密度为1x10-5x10 细胞/100μL/孔。将板以1,500rpm离心5分钟(05PR-22，日立工机社制造)，然后除去上清液。纯化抗体是被测物质，作为第一抗体在
1% BSA-PBS中稀释至终浓度0.01μg/mL-10μg/mL，并以100μL/孔分配到板中，然后在冰温下反应60分钟。用1%BSA-PBS洗涤细胞之后，添加用1%BSA-PBS稀释的FITC-标记的抗人免疫球蛋白G(H+L)(Jackson Laboratories制造)作为第二抗体，然后在遮光下于冰温下反应30分钟。细胞用1% BSA-PBS洗涤并悬浮在PBS中。细胞的荧光强度由流式细胞仪(Cytomics FC500MPL，Beckman Coulter制造)测量。

[0761] 图9给出了测量结果。如图9所示，抗ASCT2人嵌合抗体cKM4008、cKM4012和cKM4018每一种都显示出对导入人类ASCT2-myc/His基因的CHO细胞的强结合活性。另外发现，嵌合抗体cKM4008、cKM4012和cKM4018显示出与多发性骨髓瘤细胞系OPM-2的强反应性。

[0762] (2)ADCC活性

[0763] 多发性骨髓瘤细胞系KMS-11(HSRRB编号：JCRB 1179)用作靶细胞。使用含有5%FBS(Invitrogen制造)和不含酚红的RPMI1640培养基(Invitrogen制造)(以下称为
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“ADCC活性分析培养基”)，将细胞调整至细胞密度2x10 细胞/mL，用作靶细胞溶液。将Lymphoprep(Nycomed制造)用于制备效应细胞溶液，按照附带说明书，从健康人外周血液分离外周血单核细胞(PBMC)级分。将分离的PBMC级分在ADCC活性分析培养基中通过离
6
心洗涤两次，调整至细胞密度2x10 细胞/mL，然后用作效应细胞溶液。

[0764] 在96-孔U形底板(Falcon制造)中，分配靶细胞溶液50μL(1x104细胞/孔)，然后添加50μL效应细胞溶液(效应细胞:靶细胞的比例=10:1)。另外，抗ASCT2人嵌合抗体cKM4008、cKM4012和cKM4018在ADCC活性分析培养基中稀释。将稀释的抗体加到板中，达到总量150uL，终浓度0.01ng/mL-1000ng/mL，然后在37℃反应4小时。反应完成之后，将板离心并通过使用LDH-Cytotoxic Test(和光纯药社制造），按照附带的说明书测量吸光度，检测上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活性。使用ADCC活性分析培养基代替效应细胞溶液和抗体溶液，得到靶细胞自然游离的吸光度，使用ADCC活性分析培养基代替靶细胞溶液和抗体溶液，得到效应细胞自然游离的吸光度，然后进行同上的操作。使用ADCC活性分析培养基代替抗体溶液和效应细胞溶液，在反应完成前45分钟添加20μL的9%Triton X-100溶液并进行同上的操作，得到靶细胞的全游离吸光度。ADCC活性通过下式计算。

[0765] (式)

[0766] ADCC活性(%)=[(样品吸光度)-(效应细胞/靶细胞自然游离吸光度)]/(靶细胞全游离吸光度)-(靶细胞自然游离吸光度)]x100

[0767] 图10显示测量结果。如图10所示，证明抗ASCT2人嵌合抗体cKM4008、cKM4012和cKM4018显示出抗体浓度依赖性地对抗表达ASCT2的细胞的ADCC活性。

[0768] (3)CDC活性

[0769] 实施例2中得到的导入人类ASCT2-myc/His基因的CHO细胞和结肠直肠癌细胞系Colo205(ATCC编号：CCL-222)作为靶细胞，使用0.02%-EDTA溶液(Nacalai Tesque制造)剥离，在含有1.4%BSA(Invitrogen制造)和50μg/mL庆大霉素(Nacalai Tesque制造)的RPMI1640培养基(Invitrogen制造)中洗涤，制备该RPMI1640培养基作为CDC分析培5
养基，然后以2x10 细胞/mL的细胞密度悬浮在相同的培养基中。得到的悬液用作靶细胞溶液。

[0770] 人类补体血清(S2257-5ML，Sigma制造)溶解在5mL去离子水中，通过添加等量的CDC分析培养基两倍稀释。得到的稀释液用作人类补体溶液。

[0771] 在96-孔平底板(住友Bakelite制造)中，分配50μL/孔的所述补体溶液。然后，向孔中添加50μL靶细胞溶液。然后，还加入用CDC分析培养基稀释的每一种抗体溶液50μL达到总量150μL，在5% CO2存在下，37℃反应2小时。向孔中添加WST-1试剂(Roche Diagnostics制造)15μL/孔。得到的溶液用板混合器搅拌，然后在5% CO2存在下，37℃反应2小时。使用微板分光光度计(Emax微板读数器，Molecular Devices制造)，测量450nm处的吸光度(对照波长650nm)。测量添加了50μL补体溶液和100μL CDC培养基的孔的吸光度，作为空白。测量添加了 50μL靶细胞、50μL补体溶液和50μLCDC分析培养基的孔的吸光度。CDC活性通过下式计算。

[0772] (式)

[0773] CDC活性(%)={1-[(添加抗体的样品的吸光度)-(空白的吸光度)]/[(未添加抗体的样品的吸光度)-(空白的吸光度)]x100}

[0774] 图11显示测量结果。如图11所示，发现抗ASCT2人嵌合抗体cKM4008、cKM4012和cKM4018显示出抗体浓度依赖性地对抗表达ASCT2的细胞的CDC活性。另外还发现抗ASCT2人嵌合抗体cKM4008、cKM4012和cKM4018具有对抗结肠直肠癌细胞系Colo205的CDC活性。

[0775] (4)对ASCT2介导的细胞内摄取氨基酸的抑制活性

[0776] 在96-孔板中，人类结肠直肠癌细胞系WiDr(ATCC编号：CCL-218)在含有10%dFBS(Invitrogen制造)的DMEM(Invitrogen制造)(以下称为“不含谷氨酰胺的培养
4
基”)中调节至细胞密度1x10 细胞/mL，将其以100μL/孔接种，并在5%CO2培养箱中37℃培养24小时。

[0777] 每种被测物质20μL/孔，即抗ASCT2人嵌合抗体、KM511(阴性对照)或谷氨酰胺竞争性氨基酸混合物[AST混合物，丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸(均为Sigma制造)的混合物，各3.3mmol/L)］，将其用PBS稀释至终浓度10-0.01μg/mL，添加到孔中，然后另外添加20μL/孔在不含谷氨酰胺的培养基中制备成终浓度0.2mmol/L的谷氨酰胺溶液(Invitrogen制造)。向对照的孔和空白板的孔中，添加20μL/孔的PBS和20μL/孔的上述谷氨酰胺溶液。添加抗体之后，除了空白板之外的板在5% CO2培养箱中37℃培养72小时。

[0778] 然后，向其中添加在不含谷氨酰胺的培养基中稀释至50%的WST-1试剂(Roche Diagnostics制造)20uL/孔，再在37℃培养2小时。

[0779] 使用微板分光光度计(Emax微板读数器，Molecular Devices制造)，测量450nm处的吸光度(对照波长650nm)。通过考虑未加抗体的对照孔的吸光度作为100%和空白板的孔的吸光度作为0%，计算添加抗体的孔的相对增殖率(%)。

[0780] 图12显示测量结果。如图12所示，抗ASCT2人嵌合抗体cKM4008、cKM4012和cKM4018全部以抗体浓度依赖性方式显著抑制细胞增殖。结果证明，cKM4008、cKM4012和cKM4018强力中和ASCT2细胞内摄取谷氨酰胺的功能，并因而展现出对癌细胞增殖的显著抑制活性。

[0781] 实施例10：导入小鼠ASCT2-myc/His基因的细胞系(以下，称为“小鼠ASCT2/CHO”)

[0782] 依照下面的方法，得到包含SEQ ID NO:59表示的核苷酸序列和SEQ ID NO:60表示的氨基酸序列的质粒pBluescript II SK(-)-Mouse_ASCT2-myc/His，并使用这种质粒得到导入小鼠ASCT2-myc/His基因的CHO细胞系。

[0783] 在50mL含有氨苄西林的LB培养基中，接种10μL包含小鼠ASCT2基因克隆(克隆ID：4192790，Open Biosystems制造)的大肠杆菌液，在搅拌下培养过夜，然后离心(CR2DGII，日立工机社制造，6,000rpm，10分钟)，以回收细菌。使用质粒分离试剂盒(Qiagen制造)，从得到的细菌中制备包含小鼠ASCT2基因的质粒。制备含有获得的质粒
100ng作为模板、10x KOD缓冲液I(10μL)、dNTP(2mmol/L,5μL)、MgCl2(25mmol/L,4μL)、具有SEQ ID NO:61和62表示的核苷酸序列的引物(10μumol/L,各1μL)、KOD聚合酶(1μL,东洋纺织社制造)和二甲亚砜（5μL）的溶液共100μL，如下进行PCR：在96℃反应
3分钟；35个循环，每个由95℃反应1分钟、50℃反应1分钟和72℃反应1.5分钟组成，然后在72℃反应7分钟。反应产物通过琼脂糖凝胶电泳分离，得到的大约1.7-kb扩增片段使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen制 造)进行提取。得到的提取片段用EcoRI(Takara Bio制造)和KpnI(Takara Bio制造)消化，然后使用QIAquick凝胶提取试剂盒重新提取。
提取的片段使用Ligation high(东洋纺织社制造)，连接到用EcoRI(Takara Bio制造)和KpnI(Takara Bio制造)消化的pBluescript II SK(-)载体中，然后依照Cohen等的方法[Proc Natl,Acad-Sci.USA.69,2110(1972)]，用连接产物转化大肠杆菌DH5α(东洋纺织社制造)。使用自动化质粒分离系统PI-50(Kurabo制造)，从得到的转化体提取质粒，得到包含SEQ ID NO:59表示的核苷酸序列和SEQ ID NO:60表示的氨基酸序列的质粒pBluescript II SK(-)-小鼠_ASCT2-myc/His。

[0784] 得到的pBluescript II SK(-)-小鼠_ASCT2-myc/His用EcoRI(Takara Bio制造)和KpnI(Takara Bio制造)消化，基因片段用和上述一样的方法提取并连接到预先用EcoRI和KpnI消化的pKANTEX93载体(WO97/10354)中。然后，用和上述一样的方法，用连接产物转化大肠杆菌DH5α(东洋纺织社制造)，从而获得转化体。使用质粒分离试剂盒(Qiagen制造)，从转化体得到质粒pKANTEx-小鼠_ASCT2-myc/His。

[0785] 依 照 下 面 的 方 法，将pKANTEX- 小 鼠 _ASCT2-myc/His通 过 电 穿 孔 法[Cytotechnology,3,133(1990)]导 入 CHO/DG44 细 胞 [Somatic cell and Molecular Genetics,.12,555(1986)]。这里使用的细胞是在向含有10%dFBS(Invitrogen制造)和庆大霉素(Nacalai Tesque制造，50μg/mL)的IMDM(Invitrogen制造)中添加1xHT补充剂(Invitrogen制造)的培养基(以下称为“A4培养基”)中传代培养的细胞。CHO/DG44细胞悬浮在含有氯化钾(137nmol/L)、氯化钠(2.7nmol/L)、磷酸氢二钠(8.1mmol/L)、磷酸二氢钠(1.5nmol/L)和氯化镁(4mmol/L)的缓冲液(以下称为“K-PBS”)中，至细胞密度6 6
为8x10 细胞/mL，并将得到的细胞悬液(200μL，细胞计数为1.6x10 细胞)与表达质粒pKANTEX-小鼠_ASCT2-myc/His(10μg)混合。将混合物转移到小池(电极间距：2mm)中，使用GenePulser II(Bio-Rad制造)在0.35kV的脉冲电压和250μF的电容下进行基因导入。将小池静置在冰上之后，小池中的细胞悬液悬浮在含有A4培养基 的细胞培养容器中，在5%CO2培养箱中37℃培养。培养四天之后，将培养基用含有0.5mg/mL的G418(Nacalai Tesque制造)的A4培养基更换，并继续培养细胞。在细胞培养期间进行培养基更换和传代培养，在基因导入之后大约两周，得到对G418有抗性的转化细胞系。

[0786] 将得到的G418-抗性转化细胞在含有0.5mg/L G418(Nacalai Tesque制造)的A4培养基中稀释到细胞密度为5个细胞/10mL，并将稀释的细胞悬液以100μL/孔分配到96-孔板中，并用浓度逐步增加的氨甲蝶呤处理。以此方式，选择高度表达小鼠ASCT2-myc/His的克隆，从而获得小鼠ASCT2/CHO。

[0787] 实施例11：导入小鼠/人类嵌合ASCT2-myc/His基因的细胞系(以下称为“小鼠/人类嵌合ASCT2/CHO”)的构建

[0788] 图13显示人类和小鼠ASCT2蛋白的模式图。在图13的小鼠ASCT2蛋白的模式图中，黑色部分(在小鼠ASCT2的细胞外区域中，人类ASCT2的74、79、84、87、90、154、159、160、163至171、173、174、177、188、204、205、207、210至212、214至223、287、293、296、297、
300、301和367位所对应的氨基酸)表示人类和小鼠ASCT2之间不同的氨基酸。在ASCT2的细胞外区域，人类和小鼠ASCT2之间不同氨基酸的数量在EL1中是5个，EL2中非常多，EL3中是6个和EL4中是1个。关于EL1、EL2和EL3，为了在位于结构域附近的限制酶位点处切开包含各区域的结构域、然后通过重组获得小鼠替换形式，使用QuickChange位点定向诱变试剂盒(Stratagene制造)导入沉默突变，从而得到在EL3的后部区域失去NcoI位点和引入BamIII位点的人类ASCT2基因，和在EL2中失去NcoI位点的小鼠ASCT2基因。
至于在氨基酸序列中有一个差别的EL4，通过导入突变将人类ASCT2基因转变为小鼠类型。
如下构建将myc/His标签融合到各变体的C端的蛋白的核苷酸序列，然后导入CHO细胞中。

[0789] (1)变异的人类ASCT2基因的构建

[0790] 向含有在实施例2中构建的pCR4-SLClA5-myc/His作为模板、包含SEQ ID NO:63和64的核苷酸序列的引物(0.1μg/mL，2.5μL)、QuikChange位点定向诱变试剂盒附带的10×反应缓冲液(5μL)和dNTP(1μL)溶液50μL中，加入PfuTubo DNA聚合酶(1μL)，并如下进行PCR：95℃反应30秒；18个循环，每个由三个过程组成：95℃反应30秒，55℃反应1分钟和68℃反应5分钟；反应完成之后添加1μLDnpI在37℃反应1小时。用2μL反应产物转化QuickChange位点定向诱变试剂盒附带的大肠杆菌XL1-Blue(Stratagene制造)。使用自动化质粒分离系统PI-50(Kurabo制造)，从得到的转化体提取质粒，得到质粒pCR4-hNcolKO_ASCT2-myc/His。使用该质粒作为模板，和分别包含SEQ ID NO:65和66的核苷酸序列的引物(0.1μg/mL,2.5μL)，以和上面相同的方式得到质粒pCR4-hBam3KI_ASCT2-myc/His。得到的质粒用EcoKI(Takara Bio制造)和KpnI(Takara Bio制造)消化，使用QIAquick凝胶提取试剂盒提取，并使用Ligation high(东洋纺织社制造)连接到已经预先用EcoRI和KpnI消化的pBluescriptII SK(-)载体(Stratagene制造)中。然后根据Cohen等的方法[Proc.Natl Acad.Sci.USA,69,2110(1972)]，用连接产物转化大肠杆菌DH5α(东洋纺织社制造)，以和上面相同的方式得到质粒pBluescript II SK(-)hBam3KI_ASCT2~myc/His。

[0791] (2)变异的小鼠ASCT2基因的构建

[0792] 使用实施例10构建的pBluescript II SK(-)-小鼠-ASCT2-myc/His作为模板，和分别包含SEQ ID NO:67和68的核苷酸序列的引物，以和实施例11(1)相同的方式得到质粒pBluescript II SK(-)-mNcoKO_ASCT2-myc/His。

[0793] (3)小鼠/人类嵌合ASCT2/CHO的构建

[0794] 通过用(1)和(2)中得到的质粒再度转化dam-大肠杆菌(目录号：C2925，New England Biolabs制造)得到的质粒用EcoRI(Takara Bio制造)和BclI(同FbaI，Takara Bio制造)，并使用小鼠ASCT2基因作为插入片段，连接到作为载体的包含人类ASCT2基因的质粒中。然后用连接 产物转化大肠杆菌DH5α(东洋纺织社制造)，得到用小鼠类型EL1替换EL1的质粒pBluescript II SK(-)-mELl_ASCT2-myc/His。同样地，通过在BclI和NcoI位点用小鼠类型EL2替换EL2以及在NcoI和BamIII位点用小鼠类型EL3替换EL3，分别得到质粒pBluescript II SK(-)-mEL2_ASCT2-myc/His和质粒pBluescript II SK(-)-mEL3_ASCT2-myc/His。

[0795] 使用(1)中得到的pBluescript II SK(-)hBam3KI_ASCT2-myc/His作为模板，和具有SEQ ID NO:69和70的核苷酸序列的引物，以和实施例11(1)相同的方式得到质粒pBluescript II SK(-)-mEL4_ASCT2-myc/His，其中EL4被小鼠类型EL4替换。

[0796] 得 到 的 pBluescript II SK(-)-mELl_ASCT2-myc/His、pBluescriptIISK(-)-mEL2_ASCT2-myc/His、pBluescript II SK(-)-mEL3_ASCT2-myc/His 和
pBluescript II SK(-)-mEL4_ASCT2-myc/His用EcoRI(Takara Bio制造)和KpnI(Takara Bio制造)消化，用和上述一样的方法提取各基因片段，和连接到已经预先用EcoRI和KpnI消化的pKANTEX93载体(WO97/10354)中。然后用连接产物转化大肠杆菌DH5α(东洋纺织社制造)，得到转化体。然后，使用质粒分离试剂盒（Qiagen制造），从相应的转化体得到表达质粒pKANTEX-mELl_ASCT2-myc/His、pKANTEX-mEL2_ASCT2-myc/His、pKANTEX-mEL3_ASCT2-myc/His和pKANTEX-mEL4_ASCT2-myc/His。

[0797] 按照电穿孔方法，将pKANTEX-mELl-ASCT2-myc/His、pKANTEX-mEL2_ASCT2-myc/His、pKANTEX-mEL3_ASCT2_myc/His和pKANTEX-mEL4ASCT2-myc/His用和实施例10相同的方式分别导入CHO/DG44细胞中，从而分别得到导入小鼠EL1型ASCT2-myc/His基因的CHO细胞系(以下称为"mELl/CHO")、导入小鼠EL2型ASCT2-myc/His基因的CHO细胞系(以下称为"mEL2/CHO")、导入小 鼠EL3型ASCT2-myc/His基因的CHO细胞系(以下称为"mEL3/CHO")和导入小鼠EL4型ASCT2-myc/His基因的CHO细胞系(以下称为"mEL4/CHO")。

[0798] 实施例12：抗ASCT2单克隆抗体与小鼠ASCT2/CHO和小鼠/人类嵌合ASCT2/CHO的反应性

[0799] 使用实施例10和11中构建的小鼠ASCT2/CHO和小鼠/人类嵌合ASCT2/CHO细胞，和FITC-标记的抗小鼠免疫球蛋白G(H+L)(Dako制造)或ALEXA 488-标记的抗大鼠免疫球蛋白G(G+L)(Invitrogen制造)作为第二抗体，用和实施例9(1)一样的方法测量抗ASCT2单克隆抗体KM4008、KM4012和KM4018的反应性。

[0800] 测量结果显示在表2中。在表2中，符号"+"、"-"和"±"分别表示存在反应性，缺乏反应性和反应性低下。如表2所示，抗ASCT2单克隆抗体KM4008、KM4012和KM4018全部显示出与ASCT2没有反应性。另外，KM4008和KM4012表现出与mEL2/CHO的反应性低下。另一方面，KM4018表现出与mEL2/CHO没有反应性，以及与mEL1/CHO和mEL3/CHO的反应性低下。

[0801] 从上面的结果证实，抗ASCT2单克隆抗KM4008和KM4012识别并结合EL2，而抗ASCT2单克隆抗KM4018识别并结合包括EL1、EL2和EL3的三维结构。

[0802] 表2

[0803]

[0804] 实施例13：抗ASCT2人源化抗体的制备

[0805] (1)抗ASCT2人源化抗体的VH和VL的氨基酸序列的设计

[0806] 抗ASCT2人源化抗体的VH的氨基酸序列如下设计。

[0807] 首先，选择人类VH的FR的氨基酸序列，以便移植由实施例7(3)中得到的SEQ ID NO:26至28分别表示的KM4008VH的CDR1至CDR3的氨基酸序列。使用GCG软件包(Genetics Computer Group制造)作为序列分析系统，基于现有蛋白的氨基酸序列数据库，通过BLASTP方法[Nucleic Acids Res.,25,3389(1997)]，搜索与KM4008具有高度同源性的人类抗体。当同源性分数与现有的氨基酸序列SWISSPROT数据库编号：BAC01342比较时，免疫球蛋白重链VHDJ区域(以下称为“BAC01342”)显示出77.0%的同源性，并且它是具有最高同源性的人类抗体，因此选择该抗体的FR的氨基酸序列。

[0808] 将SEQ ID NO:26至28表示的KM4008的VH的CDR的氨基酸序列，移植到这样确定的人类抗体的FR的氨基酸序列的适当位置中。用这种方式，设计了SEQ ID NO:71表示的抗ASCT2人源化抗体的VH的氨基酸序列HV0。

[0809] 其次，如下设计了抗ASCT2人源化抗体的VL的氨基酸序列。

[0810] 选择人类抗体的VL的FR的氨基酸序列，以便移植通过实施例7(3)中得到的SEQ ID NO:29至31分别表示的KM4008VL的CDR1至CDR3的氨基酸序列。Kabat等已将传统已知的各种人类抗体的VL根据它们氨基酸序列的同源性和各亚组的共有序列分成四个亚组(HSG I至IV)[Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学重要的蛋白序列),US Dept.Health and Human Services（美国卫生与人类服务部）(1991)]。因此，检查人类抗体的VL的亚组I至IV中共有序列的FR的氨基酸序列与KM4008的VL的FR的氨基酸序列之间的同源性。

[0811] 同源性分析的结果是，HSG I、HSG II、HSG III和HSG IV的同 源性分别是77.5%、60.0%、63.8%和68.8%。因此，KM4008的FR的氨基酸序列与亚组I的同源性最高。

[0812] 基于这些结果，将KM4008的VL的CDR的氨基酸序列移植到人类抗体的VL的亚组I的共有序列中FR的氨基酸序列的适当位置中。但是，因为SEQ ID NO:21表示的KM4008的VL的氨基酸序列中第124位的Leu不是在Kabat援引的人类抗体FR的氨基酸序列对应的区域中使用频率最高的氨基酸残基，而是使用频率比较高的氨基酸残基，所以使用在KM4008的氨基酸序列中识别的上述氨基酸残基。用这种方式，设计了SEQ ID NO:72表示的抗ASCT2人源化抗体的VL的的氨基酸序列LV0。

[0813] 上面设计的抗ASCT2人源化抗体的VH的氨基酸序列HV0和VL的氨基酸序列LV0，是只有抗ASCT2小鼠单克隆抗体KM4008的CDR的氨基酸序列被移植到人类抗体的FR的选定氨基酸序列中的序列。但是，已知当通过只将小鼠抗体CDRs简单移植到人类抗体的FR中而产生人源化抗体时，它的抗原结合活性低于原始的小鼠抗体。因为这些原因，为了避免结合活性降低，在FR中人类抗体和小鼠抗体之间不同的氨基酸残基当中，被认为对结合活性有影响的氨基酸残基通常在移植CDR的氨基酸序列的同时进行修饰。因此，在本实施例中，如下鉴别被认为影响结合活性的FR的氨基酸残基。

[0814] 首先，使用计算机模拟技术，构建以上设计的包含抗ASCT2人源化抗体的VH的氨基酸序列HV0和VL的氨基酸序列LV0的抗体(以下称为“HV0LV0”)的V区的三维结构。使用Discovery Studio(Accelrys制造)，按照其中附带的说明书制作和显示三维结构。另外，也以同样方式构建抗ASCT2小鼠单克隆抗体KM4008的V区的三维结构的计算机模型。
此外，在HV0LV0的VH和VL的FR的氨基酸序列中，选择与KM4008不同的氨基酸残基并用KM4008的相应氨基酸残基替换，并基于得到的氨基酸序列以同样方式构建三维结构模式。
通过比较所 构建的KM4008、HV0LV0和修饰产物的V区的三维结构，来鉴别预计影响抗体结合活性的氨基酸残基。

[0815] 结果，分别选出HV0序列中的第2位Val、第9位Ser、第20位Val、第30位Ser、第38位Arg、第46位Glu、第86位Leu、第93位Val、第95位Tyr和第116位Val，和LV0序列中第8位Pro、第15位Val、第38位Gln、第43位Ala、第44位Pro、第71位Phe、和第87位Tyr，作为HV0LV0的FR氨基酸残基当中被认为改变抗原结合区域的三维结构并因此影响抗体结合活性的氨基酸残基。

[0816] 通过将这些选择的氨基酸残基的至少一个或多个氨基酸序列修饰成存在于KM4008的相同位置处的氨基酸残基，设计了具有各种各样修饰的人源化抗体的VH和VL。

[0817] 具体地，对于VH而言，在SEQ ID NO:71表示的氨基酸序列中导入Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸修饰中的至少一个修饰。另外，对于VL而言，在SEQ ID NO:72表示的氨基酸序列中导入Thr取代第8位Pro、Leu取代第15位Val、Arg取代第38位Gln、Thr取代第43位Ala、Val取代第44位Pro、Tyr取代第71位Phe、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸修饰中的至少一个修饰。

[0818] 结 果，HV0LV3、HV2LV0、HV2LV3、HV4LV0、HV4LV3、HV7LV0、HV7LV3、HV10LV0 和HV10LV3分别被设计为抗ASCT2人源化抗体的具有存在于HV0LV0的FR中的至少一个氨基酸残基修饰的抗体V区。H链可变区HV2、HV4、HV7和HV10以及L链可变区LV3的氨基酸序列分别由SEQ ID NO:76、78、80、82和84表示。

[0819] (2)抗ASCT2人源化抗体的制备

[0820] 当使用作为KM4008的VH或VL的氨基酸序列的编码DNA使用的密码子进行氨基酸修饰时，在哺乳动物细胞中使用高频率使用的密码子制备抗ASCT2人源化抗体的可变区的氨基酸序列的编码DNA。编码抗ASCT2人源化抗体的HV0和LV0的氨基酸序列的核苷酸序列分别地SEQ ID NO:73和74表示，而其中进行了氨基酸修饰的可变区HV2、HV4、HV7、HV10和LV3的氨基酸序列的编码核苷酸序列分别由SEQ ID NO:75、77、79、81和83表示。

[0821] 使用这些核苷酸序列，构建了人源化抗体表达载体，并用和实施例8一样的方式分别表达人源化抗体。

[0822] 工业实用性

[0823] 本发明可提供单克隆抗体或其抗体片段，所述单克隆抗体特异性识别系统ASC氨基酸转运蛋白2(以下称为“ASCT2”)的细胞外区域的天然三维结构并与该细胞外区域结合；产生所述抗体的杂交瘤；编码所述抗体的DNA；包含所述DNA的载体；可通过导入所述载体获得的转化体；利用所述杂交瘤或转化体产生抗体或其抗体片段的方法；和利用所述抗体或其抗体片段的治疗药，以及利用所述抗体或其抗体片段的诊断试剂。

[0824] 序列表自由文本

[0825] SEQ ID NO:3-人造序列的说明：ASCT2引物(Fw#l)

[0826] SEQ ID NO:4-人造序列的说明：ASCT2引物(Rv#l)

[0827] SEQ ID NO:5-人造序列的说明：ASCT2-myc/His序列

[0828] SEQ ID NO:6-人造序列的说明：ASCT2-myc/His序列

[0829] SEQ ID NO:7-人造序列的说明：N-ASCT2引物(#1)序列

[0830] SEQ ID NO:8-人造序列的说明：N-ASCT2引物(#2)序列

[0831] SEQ ID NO:9-人造序列的说明：N-ASCT2引物(#3)序列

[0832] SEQ ID NO:10-人造序列的说明：N-ASCT2引物(#4)序列

[0833] SEQ ID NO:11-人造序列的说明：C-ASCT2-myc/His引物(Fw#2)序列

[0834] SEQ ID NO:12-人造序列的说明：C-ASCT2-myc/His引物(Rv#2)序列

[0835] SEQ ID NO:13-人造序列的说明：C-ASCT2-myc/His引物(Rv#3)序列

[0836] SEQ ID NO:14-人造序列的说明：ASCT2肽(2-16,Cys)序列

[0837] SEQ ID NO:15-人造序列的说明：引物(mG3a2)序列

[0838] SEQ ID NO:16-人造序列的说明：引物(mG2bal)序列

[0839] SEQ ID NO:17-人造序列的说明：引物(mKal)序列

[0840] SEQ ID NO:38-人造序列的说明：cKM4008VH/cKW4012VH引物(Fw)序列

[0841] SEQ ID NO:39-人造序列的说明：cKM4008VH引物(Rv)序列

[0842] SEQ ID NO:40-人造序列的说明：cKM4008VL/cKM4012VL引物(Fw)序列

[0843] SEQ ID NO:41-人造序列的说明：cKM4008VL/cKM4012VL引物(Rv)序列

[0844] SEQ ID NO:42-人造序列的说明：cKM4012VH引物(Rv)序列

[0845] SEQ ID NO:43-人造序列的说明：引物(rG2a)序列

[0846] SEQ ID NO:44-人造序列的说明：引物(rKa2)序列

[0847] SEQ ID NO:55-人造序列的说明：cKM4018VH引物(Fw)序列

[0848] SEQ ID NO:56-人造序列的说明：cKM4018VH引物(Rv)序列

[0849] SEQ ID NO:57-人造序列的说明：cKM4018VL引物(Fw)序列

[0850] SEQ ID NO:58-人造序列的说明：cKM4018VL引物(Rv)序列

[0851] SEQ ID NO:59-人造序列的说明：小鼠ASCT2-myc/His序列

[0852] SEQ ID NO:60-人造序列的说明：小鼠ASCT2-myc/His序列

[0853] SEQ ID NO:61-人造序列的说明：小鼠ASCT2-myc/His引物(Fw)序列

[0854] SEQ ID NO:62-人造序列的说明：小鼠ASCT2-myc/His引物(Rv)序列

[0855] SEQ ID NO:63-人造序列的说明：用于导入人类ASCT2NcoI位点突变的引物(Fw)序列

[0856] SEQ ID NO:64-人造序列的说明：用于导入人类ASCT2NcoI位点突变的引物(Rv)序列

[0857] SEQ ID NO:65-人造序列的说明：用于导入人类ASCT2BamIII位点突变的引物(Fw)序列

[0858] SEQ ID NO:66-人造序列的说明：用于导入人类ASCT2BamIII位点突变的引物(Rv)序列

[0859] SEQ ID NO:67-人造序列的说明：用于导入小鼠ASCT2NcoI位点突变的引物(Fw)序列

[0860] SEQ ID NO:68-人造序列的说明：用于导入小鼠ASCT2NcoI位点突变的引物(Rv)序列

[0861] SEQ ID NO:69-人造序列的说明：用于以小鼠类型ASCT2EL4替换人类ASCT2EL4的引物(Fw)序列

[0862] SEQ ID NO:70-人造序列的说明：用于以小鼠类型ASCT2EL4替换人类ASCT2EL4的引物(Rv)序列

[0863] SEQ ID NO:71-人造序列的说明：KM4008HV0序列

[0864] SEQ ID NO:72-人造序列的说明：KM4008LV0序列

[0865] SEQ ID NO:73-人造序列的说明：KM4008HV0序列

[0866] SEQ ID NO:74-人造序列的说明：KM4008LV0序列

[0867] SEQ ID NO:75-人造序列的说明：HV2序列

[0868] SEQ ID NO:76-人造序列的说明：HV2序列

[0869] SEQ ID NO:77-人造序列的说明：HV4序列

[0870] SEQ ID NO:78-人造序列的说明：HV4序列

[0871] SEQ ID NO:79-人造序列的说明：HV7序列

[0872] SEQ ID NO:80-人造序列的说明：HV7序列

[0873] SEQ ID NO:81-人造序列的说明：HV10序列

[0874] SEQ ID NO:82-人造序列的说明：HV10序列

[0875] SEQ ID NO:83-人造序列的说明：LV3序列

[0876] SEQ ID NO:84-人造序列的说明：LV3序列。