一株太空环境下的褪色沙雷菌LCT-SM262菌株

摘要

本发明涉及一株太空环境下的褪色沙雷菌LCT-SM262菌株及其生物学特性、基因组DNA序列、转录组和差异蛋白组学，特别是同地面褪色沙雷菌比较分析鉴定出的功能序列和分子，本发明可获得全面、准确的太空环境褪色沙雷菌菌株突变的基因、差异表达基因和蛋白质分子，有助于研究太空环境对微生物的作用和机制，保障太空环境安全；有助于发现新的毒力和耐药靶点，为临床感染性疾病提供新的治疗靶点；其代谢产物灵菌红素具有抗肿瘤、免疫抑制作用，具有潜在的应用前景。

权利要求

1.一株太空环境下的褪色沙雷菌（Serratia marcescens）LCT-SM262菌株，其保藏号为：CGMCC NO：6529，其特征在于：革兰氏染色阴性，形态呈杆状，单个，无芽孢；同地面株相比，抗生素的敏感性无明显变化，无生长速度的差异；同地面株均无溶血反应；Biolog反应板生化特征结果显示与地面株相比较可以利用D-棉籽糖，不能利用α-D-葡萄糖。

说明书

一株太空环境下的褪色沙雷菌LCT-SM262菌株

技术领域

[0001] 本发明属于微生物及生物技术领域，涉及一种新的微生物菌株以及其生物学特性、基因组DNA序列、转录组和差异蛋白组学，利用生物信息学技术获得其比较基因组学信
息、转录组测序分析的差异表达基因以及差异蛋白组学鉴定的蛋白质分子。

背景技术

[0002] 随着我国神舟飞船和空间站等庞大航天计划的实施，载人航天的医学保障需求日益突出，空间医学的研究日益重要。微生物在自然界普遍存在，航天活动也不可避免，人体
及太空部件均会携带微生物至太空。既往在空间环境对微生物影响的研究中发现外太空环
境下，微生物的生长曲线迟滞期将缩短、生长与繁殖速度将增加、并具有增加次级代谢产物
产量的潜力。更为重要的是，病原微生物对药物抗性、毒力及其致病性也可能增强。研究发
现在模拟微重力作用下，大肠杆菌无论是在对数生长期还是平稳生长期，其耐高渗能力及
耐酸能力都显著增强。在模拟微重力条件下培养的鼠伤寒沙门氏菌对小鼠感染的毒力会增
强。美国航天局一些研究显示肺炎链球菌等机会致病菌在模拟微重力条件下毒力增强。因
此迫切需要研究太空环境对微生物尤其是条件致病菌的作用及其机制。

[0003] 褪色沙雷菌是一种兼性厌氧的革兰氏阴性杆菌，广泛存在于自然界，是水和土壤中的常居菌群。褪色沙雷菌也是临床常见的条件致病菌，近几年在临床的检出率增高，而且
因为广谱抗生素的广泛使用，多重耐药、泛耐药甚至全耐药的菌株显著增多，临床抗感染治
疗手段已十分有限。既往针对该菌生物学特性、致病性等研究均局限于地面。对空间环境
下褪色沙雷菌的研究尚未见报道。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种太空环境下的褪色沙雷菌LCT-SM262菌株，通过表型研究揭示其生物学特性及致病性变化，以基因组学法明确空间环境对细菌遗传性状的作用，
结合转录组学和蛋白组学，研究细菌对空间环境适应性变化的机制。

[0005] 本发明提供的菌株LCT-SM262，其保藏号为CGMCC NO.6529。

[0006] 所述的一株褪色沙雷菌，革兰氏染色阴性，形态呈杆状、单个、无芽孢；同地面株相比，抗生素的敏感性无明显变化；无生长速度的差异；同地面株均无溶血反应；Biolog反应
板生化特征结果显示与地面株比较LCT-SM262可以利用D-棉子糖，不能利用α-D-葡萄
糖。

[0007] 所述的LCT-SM262菌株，通过全基因组测序方法获得太空环境下的该菌株的突变基因包括：

[0008] (1)、质粒差异分析显示LCT-SM262比对上粪肠球菌RE25plasmidpRE25上的二个片段：1996-3019bp和46311-48346bp。说明这段序列在菌株屎肠球菌LCT-EF301(与
LCT-SM262和同属于上天的菌株)上也存在，则说明：LCT-SM262与屎肠球菌发生基因交流
获得了这段序列。这段序列为四环素耐药基因上的转座子。

[0009] (2)、耐药基因分析提示LCT-SM262缺失tet41基因，该耐药基因编码蛋白的功能为四环素的外排泵。

[0010] (3)、毒力基因分析结果显示LCT-SM262发生了毒力基因flil和flgl的缺失。flil是鞭毛特异性ATP合成酶，flgl是鞭毛P-环蛋白前体。鞭毛同细菌的运动和粘附能
力有关，表明该菌对宿主的粘附功能下降。

[0011] (4)、SNP差异分析显示杂合SNP位点有58个，其中有意义的有13个。

[0012] 所述的LCT-SM262菌株，利用转录组测序鉴定获得该菌株的差异表达基因有20个发生上调，5个发生下调。

[0013] 所述的LCT-SM262菌株，采用差异蛋白组学方法鉴定得到该菌株的差异表达蛋白分子，其中上调的有32个，下调的35个，其中变化超过两倍以上的有12个上调，15个下
调的蛋白质分子。GO功能富集分析提示这些差异表达蛋白主要与氧化还原酶活性有关，
Pathway富集分析显示这些差异蛋白主要集中在淀粉和蔗糖的代谢通路。

[0014] 所述的LCT-SM262菌株，存在灵菌红素合成基因(pigB-pigP)，其编码的代谢产物灵菌红素是一类含甲氧基吡咯骨架结构的天然色素，具有免疫抑制、抗细菌、抗真菌和抗疟
疾等多种生物活性。此外有研究发现灵菌红素具有很强的抗肿瘤及免疫抑制活性具有抗肿
瘤、免疫抑制作用。

附图说明

[0015] 图1为褪色沙雷菌LCT-SM262菌株革兰氏染色

[0016] 图2为褪色沙雷菌LCT-SM262菌株Biolog生化特征

[0017] 图3为褪色沙雷菌LCT-SM262菌株生长曲线

[0018] 图4为褪色沙雷菌LCT-SM262质粒鉴定图

[0019] 图5为褪色沙雷菌LCT-SM262的GC含量与Depth关联分析图

[0020] 图6为褪色沙雷菌LCT-SM262的15-mer分析图

[0021] 图7为褪色沙雷菌LCT-SM262的转录组基因覆盖度

[0022] 图8为褪色沙雷菌LCT-SM262的转录组差异表达基因

[0023] 图9为褪色沙雷菌LCT-SM262的蛋白质组差异表达蛋白

具体实施方式

[0024] 下述实施实例中所用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

[0025] 下述实施实例中所用的材料、试剂，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

[0026] 本项目研究人员采用自制的样本管搭载细菌，依据：HYK-GF15《航天员系统载人运输飞船/目标飞行器舱载产品环境试验技术条件》，该样本管通过了冲击、快速减压、震动
实验。褪色沙雷菌接种至样本管中，培养基为 LB琼脂半固体培养基。然后封装入代号为
20111001的样品包(材料为蓝色美塔斯阻燃布料)。经过神舟八号搭载，获得太空环境下
的褪色沙雷菌LCT-SM262菌株。

[0027] 具体实施实例一、LCT-SM262的表型特征分析：

[0028] 1.形态特征：取50ul样品离心，弃上清，加入无菌水50ul，吸取20ul于载玻片上进行固定；初染，吸取革兰氏染色I(结晶紫)2滴于载玻片样品上进行初染1min，然后
用自来水冲洗染液；媒染，吸取革兰氏染色II(碘液)2滴覆盖涂面染约1min，然后用自来
水冲洗染液，用吸水纸吸取涂面上的水分；脱色，吸取革兰氏染色III(酒精)2滴滴在涂
面上约30s，用水冲洗载玻片，用吸水纸吸取涂面上的水分；复染，吸取革兰氏染色IV(番
红)2滴滴在涂面上约1min，用水冲洗载玻片，用吸水纸吸取涂面上的水分；观察，先用显
微镜低倍镜找到目标视野，然后再用油镜(100×)进行观察，判定并记录结果、拍照，见图
1。

[0029] 2.菌株的16s rDNA鉴定：16S rDNA是16S rRNA序列的基因，长约1.5kb。将已分纯的单菌直接经菌液PCR扩增16S rDNA，部分通过菌液PCR较难扩增的单菌经扩大培养
后提取基因组后扩增，扩增所用引物序列如下：

[0030] SgF：AGAGTTTGATCATGGCTCAG

[0031] SgR：TAGGGTTACCTTGTTACGACTT

[0032] 16S rDNA PCR产物用96孔millpore纯化系统纯化后准确定量，经ABl3730xl全自动序列分析仪测序，测序结果使用Sequence scanner、Seqman等序列分析软件，将两向测
序结果去掉首尾不可信序列后拼接，余下的约1350bp(双向测序)即用于同源性分析。所
得16S rDNA序列在Eztaxon server2.1数据库中进行比对，确定菌株大致的分类地位。所
有单菌16S序列全部导入seqman，输出single file(fasta)后，经Mega5.0软件clusterW
多重比对，输出meg文件重新导入构建Neighbor-Joining tree。其中，phylogeny test
method为bootstrap参数 设置为1000。16s rDNA鉴定结果为该菌株属于褪色沙雷菌。

[0033] 3.耐药性检测：经过16s rDNA测序分析后，取出这些单菌的斜面，用灭菌的竹签从斜面上蘸取适量菌种于1.5ml离心管中，混匀，调菌浓度约107～108。吸取备好的菌悬
液100ul进行涂布，尽可能地涂布均匀，每株单菌涂6个平板，每涂完一株菌，就进行下一步
(粘贴药敏片)。粘贴药敏片，选择的抗生素为青霉素G、氨苄青霉素、头孢唑林、复达欣(头
孢他啶)(头孢噻甲羧肟)、菌必治(头孢三嗪)、阿奇霉素(泰力特)、环丙沙星(奔克)
(悉复欢)(丙氟哌酸)、洁霉素(林可霉素)、万古霉素、复方新诺明、氯霉素、舒普深(先锋
必/舒巴坦)、丁胺卡那(阿米卡星)、链霉素、美满霉素(二甲胺四环素)(米诺环素)、美
罗培南、哌拉西林/他唑巴坦(特治星)。将平板放置在37℃下培养18～24h培养24h后
观察抑菌圈大小。结果示LCT-SM262较地面株耐药性无明显变化。

[0034] 4.溶血试验：采用点种法，将太空株和地面株点种于同一血琼脂培养基上，培养温度37℃，培养24-48h后观察结果。结果显示其无溶血反应。

[0035] 5.生化代谢(Biolog)实验：菌悬液制备，取出菌株的斜面，用灭菌竹签蘸取菌种接种在LB液体培养基中(4ml体系)，培养24h。然后取2ml菌液6000r/s离心5min，弃上清
培养基，留下离心的菌体，然后用灭菌的生理盐水洗涤菌体，6000r/s离心5min，再次弃去
7
上清，再用Biolog接种液进行悬浮菌体，最后再转至15ml的接种液中。调至浓度约10～
8
10；接种，将以上菌悬液倒至接种皿中，震荡均匀，用12道(或8道)排枪进行加样，每个
Biolog板孔加样100ul，共96孔，加完样后，盖上Biolog板盖，放置在37℃下培养，24h和
48h进行观察，并记录结果，结果见表1，图2。

[0036] 表1褪色沙雷菌LCT-SM262Biolog反应板生化特征

[0037]LCT-S M262 LCT-SM213

[0038]糊精 +(棕) +(紫)
D-麦芽糖 +(棕) +(紫)
PH＝6 +(黄) +(紫)
D-棉子糖 + -
α-D-乳糖 +(棕) +(紫)
N-乙酰神经氨酸 + +/-
1％NaCl +(黄) +(紫)
α-D-葡萄糖 - +
D-半乳糖 +(棕) +(紫)
肌苷 +(棕) +(紫)
1％乳酸钠 +(黄) +(紫)
D-甘露醇 + +/-

[0039] 6.生长曲线测定：菌株活化后接种至100孔蜂窝板中，在Bioscreen中进行生长曲线的测定，测定24h，读取数据。将所得到的OD值进行平均值的计算，然后绘制曲线，见
图3。LCT-SM262无生长速度的差异。具体实施实例二、LCT-SM262的基因组及比较基因组
学：

[0040] 培养褪色沙雷菌并提取基因组DNA，首先采用超声法将检测合格的DNA样品随机打断，得到一系列DNA片段，经T4DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶和T4多聚核苷酸
激酶等处理后，回收目的片段，得到测序文库，利用Illumina的Genome Analyzer II
测序；测序结束后得到的reads，经过滤处理后进行组装和分析；采用Glimmer3.0软件
注释基因并分析SNP、Indel、基因重排和结构变异等。LCT-SM262的基因测序质控见图
5、图6。质粒差异分析见图4。耐药分析提示LCT-SM262缺失tet41基因，该耐药基因
编码蛋白的功能为四环素的外排泵。毒力基因分析结果见表2，SNP差异分析显示杂合
SNP位点有58个，其中有意义的有13个，见表3，Indel分析未发现明显变化。该菌株
耐药、毒力基因的变化为临床感染性疾病提供了潜在的治疗靶点。此外太空环境下的
LCT-SM262存灵菌红素合成基因(pigB -pigP)，其编码的代谢产物灵菌红素是一类含
甲氧基吡咯骨架结构的天然色素，具有免疫抑制、抗细菌、抗真菌和抗疟疾等多种生物
活性。有研究发现灵菌红素具有很强的抗肿瘤及免疫抑制活性。因此该菌在生物工程
方面具有潜在的应用前景。

[0041] 表2褪色沙雷菌LCT-SM262毒力基因分析结果

[0042]毒力基因编号 名称 定义 LCT-SM213(地面株) LCT-S M262
VFG2331 flil 鞭毛特异性ATP合成酶 UUSGL000753_90.25
VFG2344 flgl 鞭毛P-环蛋白前体 UUSGL000739_90.40 -

[0043] 表3褪色沙雷菌LCT-SM262的SNP位点对应基因功能注释

[0044]ID
注释库 gi|290508598|ref|ZP_06547969.1| gi|333928609|ref|YP_004502188.1| gi|157371693|ref|YP_001479682.1| gi|157371606|ref|YP_001479595.1| gi|270262353|ref|ZP_06190625.1| gi|157368519|ref|YP_001476508.1| gi|157368518|ref|YP_001476507.1| gi|270265363|ref|ZP_06193624.1| gi|293394701|ref|ZP_06638993.1| gi|157369676|ref|YP_001477665.1| gi|270264573|ref|ZP_06192839.1| gi|157372208|ref|YP_001480197.1|
(aa)
基因长度 171 972 840 2022 183 540 2994 1203 711 2190 258 1155
ID
基因 UUSGL000001 UUSGL000004 UUSGL000125 UUSGL000221 UUSGL000785 UUSGL003376 UUSGL003778 UUSGL003925 UUSGL003980 UUSGL004715 UUSGL004778 UUSGL004785

[0045] 具体实施实例三、LCT-SM262菌株的转录组测序分析：

[0046] 提取LCT-SM262菌株总RNA后，用试剂盒去除rRNA后。加入 fragmentationbuffer将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物(random hexamers)合成
第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第二条cDNA
链，在经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱之后做末端修复、加polyA并连接
测序接头，然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，最后进行PCR扩增，建好的测序文库
用Illumina HiSeq 2000进行测序。将原始序列数据去除杂质数据后统计rRNA统计、评价
Reads在基因组上的分布基因覆盖度、统计基因表达量差异、分析差异表达基因、筛选差异
基因表达模式聚类分析、GO功能分析、KEGG Pathway分析和预测新转录本分析等。分布基
因覆盖度见图7。差异表达基因见图8，表4。

[0047] 表4褪色沙雷菌LCT-SM262的差异表达基因(FDR≤0.001和|log2Ratio|≥1)

[0048]

[0049]

[0050] 具体实施实例四、LCT-SM262菌株差异蛋白组学分析：

[0051] 从LCT-SM262菌株样品中提取蛋白；对提取后的蛋白样品进行还原烷基化处理，打开二硫键以便后续充分酶解蛋白；用GE公司的2D quant kit法进行蛋白质的浓度测
定；等体积进行SDS(十二烷基磺酸钠)电泳；酶解蛋白；用iTRAQ试剂标记肽段；将标记后
的肽段进行等量混合；对混合后的肽段使用强阳离子交换色谱(Strong Cation Exchange
Choematography，SCX)进行预分离；进行液相串联质谱(liquid chromatography coUpled
with tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)分析。对质谱下机的原始文件，进行峰识别，
得到峰列表；建立参考数据库，进行肽段及蛋白质的鉴定；最后比较各蛋白在各样品之间
的相对含量的关系，从而获得一些感兴趣的重要蛋白。对这些蛋白进行功能分析。最后比较
各蛋白在各样品之间的相对含量的关系，当满足蛋白丰度差异倍数1.2倍以上且统计检验
值P-value小于0.05时，从而获得差异表达的蛋白。对这些差异表达的基因进行GO功能
富集分析和pathway富集分析。差异表达蛋白分子见图9，其中差异超过2倍以上的见表
5。GO功能富集分析提示这些差异表达蛋白主要与氧化还原酶活性有关，Pathway富集分析
显示这些差异蛋白主要集中在淀粉和蔗糖的代谢通路。

[0052] 表5褪色沙雷菌LCT-SM262的差异蛋白质分子(蛋白丰度差异倍数超过2倍以上时；经统计检验其p-value值小于0.05；三次重复中至少两次重复中达到上述要求)

[0053]基因ID 基因长度(aa) 上调/下调 注释库ID
UUSGL003172 1665 +++ gi|270265101|ref|ZP_06193364.1|
UUSGL001692 1011 +++ gi|293396549|ref|ZP_06640825.1|
UUSGL004211 2664 ++ gi|333929041|ref|YP_004502620.1|
UUSGL002992 954 ++ gi|270263893|ref|ZP_06192161.1|
UUSGL003744 1509 ++ gi|333929717|ref|YP_004503296.1|
UUSGL004492 984 ++ gi|157372683|ref|YP_001480672.1|
UUSGL004305 1161 ++ gi|333929214|ref|YP_004502793.1|
UUSGL000686 483 ++ gi|293395545|ref|ZP_06639828.1|
UUSGL000940 657 ++ gi|270262197|ref|ZP_06190469.1|
UUSGL000630 978 ++ gi|270262470|ref|ZP_06190741.1|
UUSGL004066 645 ++ gi|33331085|gb|AAQ10778.1|
UUSGL000483 888 ++ gi|182679456|ref|YP_001833602.1|
UUSGL004116 2970 -- gi|270264927|ref|ZP_06193191.1|
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UUSGL002503 897 --- gi|157369457|ref|YP_001477446.1|

[0054] 关于保藏的LCT-SM262菌株的说明

[0055] A.菌种的保藏单位名称和地址

[0056] 名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

[0057] 地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所

[0058] B.交机构保藏的日期

[0059] 2012年9月5日

[0060] C.保藏机构给予的保藏号

[0061] CGMCC No.6529

[0062] D.分类命名

[0063] 粘质沙雷氏菌Serratia marcescens