本发明涉及一种治疗中风后遗症的药物组合物制剂的制备方法，该方法包括挥发油提取及包合、乙醇提取、水提取、药材细粉粉碎、制剂成型等步骤。与传统制剂相比，病人的用药顺应性会明显提高；本发明的方法制备的药物制剂在保留原制剂药效的前提下，可实现吸收快，有效成分集中到达病灶部位，起效快，生物利用度高。本发明方法制备的药物制剂提高了疗效。
1.一种治疗中风后遗症的药物组合物制剂的制备方法，所述药物组合物的原料药重量份组成为：珍珠17.3份、天竺黄2.2份、西红花8.7份、丁香9.7份、肉豆蔻8.7份、豆蔻8.7份、草果6.5份、檀香8.7份、紫檀香21.6份、沉香17.3份、诃子28.1份、毛诃子17.3份、余甘子21.6份、木香21.6份、肉桂17.3份、荜苃8.7份、螃蟹10.8份、金礞石8.7份、香旱芹5.4份、人工牛黄2.2份、麝香2.2份、广枣6.5份、烈香杜鹃6.5份、塞北紫堇13.0份、短穗兔耳草43.3份、制铁粉4.3份、冬葵果17.3份、甘草13.0份、黑种草子5.4份；包括以下步骤：（1）按原料药组成配比取荜茇、丁香、肉豆蔻、豆蔻、草果、香旱芹、檀香、黑种草子、沉香、冬葵果、肉桂、木香、紫檀香、烈香杜鹃共14味药材混合，按14味药材总重量的4～8倍加水，采用水蒸汽蒸馏法，提取挥发油，提取3～6h，收集挥发油，得挥发油，药液滤过，得提取液A和药渣A；
将所得挥发油加入重量体积百分比3-4%的β环糊精饱和水溶液中，挥发油与β环糊精的体积重量比为1ml：3-5g，搅拌条件下，保持温度40℃-60℃，搅拌3～4h，-4℃-4℃冷藏过夜，抽滤，沉淀，40℃-60℃真空干燥，得挥发油包合物；
（2）按原料药组成配比取甘草、短穗兔耳草、广枣、塞北紫堇、诃子、余甘子、毛诃子共7味药材，与步骤（1）提取挥发油后的药渣A混合，加入体积浓度60～100%的乙醇溶液回流提取2-3次，每次加乙醇的量是所述7味药材与药渣A总重量的8-10倍，提取2-3h，滤过，合并药液得乙醇提取物液，减压浓缩，干燥，得乙醇提取物和药渣B；
（3）上述步骤（2）乙醇提取后的药渣B，加水提取2-3次，每次加水的重量是药渣B重量的8-10倍，提取2-3h，滤过，合并药液得提取液B；将该提取液B与步骤（1）提取挥发油后的提取液A合并，减压浓缩，浓缩至60℃条件下相对密度为1.12的流浸膏，干燥，得水提取物；
（4）按原料药组成配比取珍珠、天竺黄、螃蟹、金礞石、制铁粉、西红花、人工牛黄、麝香共8味药材，粉碎,得药材细粉；
（5）将上述步骤（1）至（4）制得的挥发油包合物、乙醇提取物、水提取物和药材细粉混匀，加入常规辅料，按照常规工艺制备成药学上可接受的任何一种剂型。
2.如权利要求1所述的一种治疗中风后遗症的药物组合物制剂的制备方法，所述药物组合物的原料药重量份组成为：珍珠17.3份、天竺黄2.2份、西红花8.7份、丁香9.7份、肉豆蔻8.7份、豆蔻8.7份、草果6.5份、檀香8.7份、紫檀香21.6份、沉香17.3份、诃子28.1份、毛诃子17.3份、余甘子21.6份、木香21.6份、肉桂17.3份、荜苃8.7份、螃蟹10.8份、金礞石8.7份、香旱芹5.4份、人工牛黄2.2份、麝香2.2份、广枣6.5份、烈香杜鹃6.5份、塞北紫堇13.0份、短穗兔耳草43.3份、制铁粉4.3份、冬葵果17.3份、甘草13.0份、黑种草子5.4份；包括以下步骤：（1）按原料药组成配比取荜茇、丁香、肉豆蔻、豆蔻、草果、香旱芹、檀香、黑种草子、沉香、冬葵果、肉桂、木香、紫檀香、烈香杜鹃共14味药材混合，按14味药材总重量的6倍加水，采用水蒸汽蒸馏法，提取挥发油，提取4h，收集挥发油，得挥发油，药液滤过，得提取液A和药渣A；
将所得挥发油加入重量体积百分比4%的β环糊精饱和水溶液中，挥发油与β环糊精的体积重量比为1ml：4g，搅拌条件下，保持温度60℃，搅拌4h，4℃冷藏过夜，抽滤，沉淀，
（2）按原料药组成配比取甘草、短穗兔耳草、广枣、塞北紫堇、诃子、余甘子、毛诃子共7味药材，与步骤（1）提取挥发油后的药渣A混合，加入体积浓度90%的乙醇水溶液回流提取
2次，第一次加乙醇的量是所述7味药材与药渣A总重量的10倍，提取2h，第二次加乙醇的量是所述7味药材与药渣A总重量的8倍，提取2h，滤过，合并药液得乙醇提取物液，减压浓缩，干燥，得乙醇提取物和药渣B；
（3）上述步骤（2）乙醇提取后的药渣B，加水提取2次，第一次加水的重量是药渣B重量的10倍，提取2h，第二次加水的重量是药渣B重量的8倍，提取2h，滤过，合并药液得提取液B，将该提取液B与步骤（1）提取挥发油后的提取液A合并，减压浓缩，浓缩至60℃条件下相对密度为1.12的流浸膏，干燥，得水提取物；
（4）按原料药组成配比取珍珠、天竺黄、螃蟹、金礞石、制铁粉、西红花、人工牛黄、麝香共8味药材，粉碎,得药材细粉；
（5）将上述步骤（1）至（4）制得的挥发油包合物、乙醇提取物、水提取物和药材细粉混匀，加入适量淀粉，制粒，干燥，装入胶囊，即得。
3.如权利要求1所述的一种治疗中风后遗症的药物组合物制剂的制备方法，颗粒剂的制备包括以下步骤：
（1）按原料药组成配比取荜茇435g，丁香485g，肉豆蔻435g，豆蔻435g，草果325g，香旱芹270g，檀香435g，黑种草子270g，沉香865g，冬葵果865g，肉桂865g，木香1080g，紫檀香1080g，烈香杜鹃325g，共14味药材混合，按14味药材总重量的4倍加水，采用水蒸汽蒸馏法，提取挥发油，提取3h，收集挥发油，得挥发油19ml，药液滤过，得提取液A和药渣A；
将所得挥发油加入重量体积百分比3%的β环糊精饱和水溶液中，挥发油与β环糊精的体积重量比为1ml：5g，搅拌条件下，保持温度60℃，搅拌4h，-4℃冷藏过夜，抽滤，沉淀，
（2）按原料药组成配比取甘草650g，短穗兔耳草2165g，广枣325g、塞北紫堇650g，诃子
1405g，余甘子1080g，毛诃子865g，共7味药材，与步骤（1）提取挥发油后的药渣A混合，加入体积比浓度60%乙醇水溶液回流提取2次，第一次加乙醇的量是所述7味药材与药渣A总重量的8倍，提取2h，第二次加乙醇的量是所述7味药材与药渣A总重量的8倍重量，提取2h，滤过，合并药液得乙醇提取物液，减压浓缩，干燥，得乙醇提取物和药渣B；
（3）上述步骤（2）乙醇提取后的药渣B，加水提取2次，第一次加水的重量是药渣B重量的8倍，提取2h，第二次加水的重量是药渣B重量的9倍，提取2h，滤过，合并药液得提取液B，将该提取液B与步骤（1）提取挥发油后的提取液A合并，减压浓缩，浓缩至60℃条件下相对密度为1.12的流浸膏，干燥，得水提取物；
（4）按上述原料药比例取珍珠865g、天竺黄110g、西红花435g、螃蟹540g、金礞石435g、制铁粉215g、人工牛黄110g、麝香110g，共8味药材，粉碎，得药材细粉；
（5）将上述步骤（1）至（4）得到的挥发油包合物、乙醇提取物、水提取物和药材细粉混匀，得珍龙醒脑提取物，按照常规工艺，加入珍龙醒脑提取物5倍重量份的糖粉及2%-5%羟丙基甲基纤维素(HPMC)，混匀，用体积浓度80%乙醇制粒，干燥，每袋装2g，即得。
4.一种治疗中风后遗症的药物组合物制剂的制备方法，片剂的制备包括以下步骤：
（1）按原料药组成配比取荜茇435g，丁香485g，肉豆蔻435g，豆蔻435g，草果325g，香旱芹270g，檀香435g，黑种草子270g，沉香865g，冬葵果865g，肉桂865g，木香1080g，紫檀香1080g，烈香杜鹃325g，共14味药材混合，按14味药材总重量的8倍加水，采用水蒸汽蒸馏法，提取挥发油，提取6h，收集挥发油，得挥发油22ml，药液滤过，得提取液A和药渣A；
将所得挥发油加入重量体积百分比4%的β环糊精饱和水溶液中，挥发油与β环糊精的体积重量比为1ml：3g，搅拌条件下，保持温度40℃，搅拌6h，0℃冷藏过夜，抽滤，沉淀，
（2）在上述步骤（1）提取挥发油后的药渣A中按上述原料药比例加入甘草650g，短穗兔耳草2165g，广枣325g、塞北紫堇650g，诃子1405g，余甘子1080g，毛诃子865g，共7味药材，加体积百分比浓度80%乙醇水溶液回流提取2次，第一次加乙醇的量是所述7味药材与药渣A总重量的10倍，提取3h，第二次加乙醇的量是所述7味药材与药渣A总重量的8倍，提取2h，滤过，合并药液得乙醇提取物液，减压浓缩，干燥，得乙醇提取物和药渣B；
（3）上述步骤（2）乙醇提取后的药渣B，加水提取2次，第一次加水的重量是药渣B重量的10倍，提取2h，第二次加水的重量是药渣B重量的8倍，提取2h，滤过，合并药液得提取液B，将该提取液B与步骤（1）提取挥发油后的提取液A合并，减压浓缩，浓缩至60℃条件下相对密度为1.12的流浸膏，干燥，得水提取物；
（4）按原料药组成配比取珍珠865g、天竺黄110g、西红花435g、螃蟹540g、金礞石435g、制铁粉215g、人工牛黄110g、麝香110g，共8味药材，粉碎至细粉，得药材细粉；
（5）将上述步骤（1）至（4）得到的挥发油包合物、乙醇提取物、水提取物和药材细粉混匀，得珍龙醒脑提取物，按照常规工艺，加入适量的淀粉、微晶纤维素、硬脂酸镁，混匀，用体积百分比80%乙醇水溶液制粒，干燥，压片，每片0.30g，包糖衣或薄膜衣，即得。
一种治疗中风后遗症的药物组合物制剂的制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于中药制剂领域，涉及一种治疗中风后遗症的药物组合物制剂的制备方法，特别涉及珍龙醒脑药物制剂的制备方法。
背景技术
[0002] 中风后遗症多由急性脑血管病所致，急性脑血管病是常见的严重危害人类健康的疾病，临床上又称中风。它发病急，恢复却很慢，常遗留有不同程度的功能障碍。常伴有半身不遂、肢体麻木、疼痛拘挛、头晕目眩、口眼歪斜、言语不清，死亡率高，致残率高。
[0003] 珍龙醒脑胶囊收载于中成药地方标准上升国家药品标准部分(内科脑系经络肢体分册)；标准编号：WS-10708(ZD-0708)-2002。珍龙醒脑胶囊由珍珠17.3g、天竺黄2.2g、西红花8.7g、丁香9.7g、肉豆蔻8.7g、豆蔻8.7g、草果6.5g、檀香8.7g、紫檀香21.6g、沉香17.3g、诃子28.1g、毛诃子17.3g、余甘子21.6g、木香21.6g、肉桂17.3g、荜茇8.7g、螃蟹10.8g、金礞石8.7g、香旱芹5.4g、人工牛黄2.2g、麝香2.2g、广枣6.5g、烈香杜鹃6.5g、塞北紫堇13.0g、短穗兔耳草43.3g、铁粉(制)4.3g、冬葵果17.3g、甘草13.0g、黑种草子5.4g组成。具有开窍醒神，清热通络的功效。用于痰瘀阻络所致的中风，语言蹇涩，半身不遂，口眼歪斜。由于效果良好，经临床验证，疗效显著，在临床上备受患者青睐。珍龙醒脑胶囊传统制备方法为：取人工牛黄、麝香、西红花研成细粉，其余珍珠等二十六味粉碎成细粉，过筛，与上述细粉配研，混匀，装入胶囊，即得。CN1827155A(CN200510119871.6)也公开了一种珍龙醒脑颗粒，原料药为珍珠，天竺黄，西红花等29种药材；制作方法是按原料药按比例配料，再粉碎成细粉，把细粉混匀后制成颗粒产品。
[0004] 现有技术关于珍龙醒脑药物的制备方法均采用原料药材粉碎、混合的简单物理处理，原料药的有效成分释放缓慢，严重影响到药物有效成分的吸收利用。
发明内容
[0005] 本发明针对现有技术的不足，提供一种治疗中风后遗症的药物组合物制剂的制备方法。
[0006] 本发明的技术方案如下：
[0007] 一种治疗中风后遗症的药物组合物制剂的制备方法，所述药物组合物的原料药重量份组成为：珍珠17.3份、天竺黄2.2份、西红花8.7份、丁香9.7份、肉豆蔻8.7份、豆蔻8.7份、草果6.5份、檀香8.7份、紫檀香21.6份、沉香17.3份、诃子28.1份、毛诃子17.3份、余甘子21.6份、木香21.6份、肉桂17.3份、荜茇8.7份、螃蟹10.8份、金礞石8.7份、香旱芹5.4份、人工牛黄2.2份、麝香2.2份、广枣6.5份、烈香杜鹃6.5份、塞北紫堇13.0份、短穗兔耳草43.3份、铁粉(制)4.3份、冬葵果17.3份、甘草13.0份、黑种草子5.4份；
包括以下步骤：
[0008] (1)按原料药组成配比取荜茇、丁香、肉豆蔻、豆蔻、草果、香旱芹、檀香、黑种草子、沉香、冬葵果、肉桂、木香、紫檀香、烈香杜鹃共14味药材混合，按14味药材总重量的4～8倍加水，采用水蒸汽蒸馏法，提取挥发油，提取3～6h，收集挥发油，得挥发油，药液滤过，得提取液A和药渣A；
[0009] 将所得挥发油加入重量体积百分比3-4％的β环糊精饱和水溶液中，挥发油与β环糊精的体积重量比为1ml∶3-5g，搅拌条件下，保持温度40℃-60℃，搅拌3～4h，-4℃-4℃冷藏过夜，抽滤，沉淀，40℃-60℃真空干燥，得挥发油包合物；
[0010] (2)按原料药组成配比取甘草、短穗兔耳草、广枣、塞北紫堇、诃子、余甘子、毛诃子共7味药材，与步骤(1)提取挥发油后的药渣A混合，加入体积浓度60～100％的乙醇溶液回流提取2-3次，每次加乙醇的量是所述7味药材与药渣A总重量的8-10倍，提取2-3h，滤过，合并药液得乙醇提取物液，减压浓缩，干燥，得乙醇提取物和药渣B；
[0011] (3)上述步骤(2)乙醇提取后的药渣B，加水提取2-3次，每次加水的重量是药渣B重量的8-10倍，提取2-3h，滤过，合并药液得提取液B；将该提取液B与步骤(1)提取挥发油后的提取液A合并，减压浓缩，浓缩至60℃条件下相对密度为1.12的流浸膏，干燥，得水提取物；
[0012] (4)按原料药组成配比取珍珠、天竺黄、螃蟹、金礞石、铁粉(制)、西红花、人工牛黄、麝香共8味药材，粉碎，得药材细粉；
[0013] (5)将上述步骤(1)至(4)制得的挥发油包合物、乙醇提取物、水提取物和药材细粉混匀，加入常规辅料，按照常规工艺制备成药学上可接受的任何一种剂型。
[0014] 优选的，本发明治疗中风后遗症的药物组合物胶囊的制备方法，所述药物组合物的原料药重量份组成为：珍珠17.3份、天竺黄2.2份、西红花8.7份、丁香9.7份、肉豆蔻8.7份、豆蔻8.7份、草果6.5份、檀香8.7份、紫檀香21.6份、沉香17.3份、诃子28.1份、毛诃子17.3份、余甘子21.6份、木香21.6份、肉桂17.3份、荜茇8.7份、螃蟹10.8份、金礞石8.7份、香旱芹5.4份、人工牛黄2.2份、麝香2.2份、广枣6.5份、烈香杜鹃6.5份、塞北紫堇13.0份、短穗兔耳草43.3份、铁粉(制)4.3份、冬葵果17.3份、甘草13.0份、黑种草子5.4份；包括以下步骤：
[0015] (1)按原料药组成配比取荜茇、丁香、肉豆蔻、豆蔻、草果、香旱芹、檀香、黑种草子、沉香、冬葵果、肉桂、木香、紫檀香、烈香杜鹃共14味药材混合，按14味药材总重量的6倍加水，采用水蒸汽蒸馏法，提取挥发油，提取4h，收集挥发油，得挥发油，药液滤过，得提取液A和药渣A；
[0016] 将所得挥发油加入重量体积百分比4％的β环糊精饱和水溶液中，挥发油与β环糊精的体积重量比为1ml∶4g，搅拌条件下，保持温度60℃，搅拌4h，4℃冷藏过夜，抽滤，沉淀，50℃真空干燥，得挥发油包合物；
[0017] (2)按原料药组成配比取甘草、短穗兔耳草、广枣、塞北紫堇、诃子、余甘子、毛诃子共7味药材，与步骤(1)提取挥发油后的药渣A混合，加入体积浓度90％的乙醇水溶液回流提取2次，第一次加乙醇的量是所述7味药材与药渣A总重量的10倍，提取2h，第二次加乙醇的量是所述7味药材与药渣A总重量的8倍，提取2h，滤过，合并药液得乙醇提取物液，减压浓缩，干燥，得乙醇提取物和药渣B；
[0018] (3)上述步骤(2)乙醇提取后的药渣B，加水提取2次，第一次加水的重量是药渣B重量的10倍份，提取2h，第二次加水的重量是药渣B重量的8倍，提取2h，滤过，合并药液得提取液B，将该提取液B与步骤(1)提取挥发油后的提取液A合并，减压浓缩，浓缩至60℃条件下相对密度为1.12的流浸膏，干燥，得水提取物；
[0019] (4)按原料药组成配比取珍珠、天竺黄、螃蟹、金礞石、铁粉(制)、西红花、人工牛黄、麝香共8味药材，粉碎，得药材细粉；
[0020] (5)将上述步骤(1)至(4)制得的挥发油包合物、乙醇提取物、水提取物和药材细粉混匀，加入适量淀粉，制粒，干燥，装入胶囊，即得。
[0021] 本发明重量份和体积份的关系为g/ml或kg/l。
[0022] 本发明的特点是以植化成分为物质基础，以药效活性为指导，充分考虑药物成分的性质、不同的临床病症需要，以及用药对象的顺应性和生理情况等，采用新的提取制备方法，制备珍龙醒脑药物制剂，与传统制剂相比，病人的用药顺应性会明显提高；本发明的方法制备的药物制剂在保留原制剂药效的前提下，可实现吸收快，有效成分集中到达病灶部位，起效快，生物利用度高。详细的实验数据将在具体实施方式中加以对比说明。本发明方法制备的药物制剂提高了疗效。同时，本发明对处方药材的挥发油成分，进行了提取，并采用β环糊精包合工艺。
具体实施方式
[0023] 下述实施例和实验例用于进一步说明但不限于本发明。实验例中所使用的珍龙醒脑新制剂即本发明方法制备的治疗中风后遗症的药物组合物。
[0024] 实施例1-4药物组合物的原料药重量份配比如下：
[0025] 珍珠17.3份、天竺黄2.2份、西红花8.7份、丁香9.7份、肉豆蔻8.7份、豆蔻8.7份、草果6.5份、檀香8.7份、紫檀香21.6份、沉香17.3份、诃子28.1份、毛诃子17.3份、余甘子21.6份、木香21.6份、肉桂17.3份、荜茇8.7份、螃蟹10.8份、金礞石8.7份、香旱芹5.4份、人工牛黄2.2份、麝香2.2份，广枣6.5份、烈香杜鹃6.5份、塞北紫堇13.0份、短穗兔耳草43.3份、铁粉(制)4.3份、冬葵果17.3份、甘草13.0份、黑种草子5.4份。
[0026] 作为对比用的原市售珍龙醒脑胶囊为青海金诃藏药药业股份有限公司产品，批号：20090908。
[0027] 实施例1、一种治疗中风后遗症的药物组合物胶囊的制备
[0028] (1)挥发油提取及包合：按原料药组成配比取荜茇435g、丁香485g、肉豆蔻435g、豆蔻435g、草果325g、香旱芹270g、檀香435g、黑种草子270g、沉香865g、冬葵果865g、肉桂865g、木香1080g、紫檀香1080g、烈香杜鹃325g共14味药材混合，按14味药材总重量的6倍加水，采用水蒸汽蒸馏法，提取挥发油，提取4h，收集挥发油，得挥发油，药液滤过，得提取液A和药渣A；
[0029] 将所得挥发油加入重量体积百分比4％的β环糊精饱和水溶液中，挥发油与β环糊精的体积重量比为1ml∶4g，搅拌条件下，保持温度60℃，搅拌4h，4℃冷藏过夜，抽滤，沉淀，50℃真空干燥，得挥发油包合物；
[0030] (2)乙醇提取：按原料药组成配比取甘草650g、短穗兔耳草2165g、广枣325g、塞北紫堇650g、诃子1405g、余甘子1080g、毛诃子865g共7味药材，与步骤(1)提取挥发油后的药渣A混合，加入体积浓度90％的乙醇水溶液回流提取2次，第一次加乙醇的量是所述7味药材与药渣A总重量的10倍，提取2h，第二次加乙醇的量是所述7味药材与药渣A总重量的8倍，提取2h，滤过，合并药液得乙醇提取物液，减压浓缩，干燥，得乙醇提取物和药渣B；
[0031] (3)水提取：上述步骤(2)乙醇提取后的药渣B，加水提取2次，第一次加水的重量是药渣B重量的10倍份，提取2h，第二次加水的重量是药渣B重量的8倍，提取2h，滤过，合并药液得提取液B，将该提取液B与步骤(1)提取挥发油后的提取液A合并，减压浓缩，浓缩至60℃条件下相对密度为1.12的流浸膏，干燥，得水提取物；
[0032] (4)药材细粉粉碎：按原料药组成配比取珍珠865g、天竺黄110g、螃蟹540g、金礞石435g、铁粉(制)215g、西红花435g、人工牛黄110g、麝香110g共8味药材，粉碎，得药材细粉；
[0033] (5)制剂成型：将上述步骤(1)至(4)得到的挥发油包合物、乙醇提取物、水提取物和药材细粉混匀，得珍龙醒脑提取物，按照常规工艺，加入适量淀粉，制粒，干燥，裝成0.3g/粒胶囊，即得。
[0034] 实验例1、将上述实施例1的新制剂与珍龙醒脑胶囊原有制剂及阳性对照药物一起进行神经细胞损伤保护作用对比实验
[0035] 一、实验材料：
[0036] 1、珍龙醒脑胶囊新制剂：实施例1的制剂珍龙醒脑胶囊；
[0037] 2、珍龙醒脑胶囊原制剂(以下简称原制剂)：市售珍龙醒脑胶囊(青海金诃藏药药业股份有限公司)，批号：20090908。
[0038] 3、阳性对照药物：复方丹参滴丸，天津天士力制药有限公司，批号：100413。
[0039] 4、细胞系：PC12细胞系(来源：Rattμs norvegicμs肾上腺嗜铬细胞瘤，南京凯基生物科技发展有限公司提供)。
[0040] 5、试剂：H-DMEM细胞培养基(Hyclone，赛默飞世尔生物化学制品北京有限公司)；胎牛血清(以色列Bioind)；胰酶细胞消化液(碧云天)，青霉素链霉素混合液双抗，注射用顺铂(齐鲁制药有限公司，1010041DC)，柠檬酸盐缓冲液(北京中杉金桥生物技术有限公司)，多聚甲醛(solarbio)，L-谷氨酸(Klonetech，Japan)。
[0041] 6、实验仪器
[0042] 立式压力蒸汽灭菌锅(LDZX-50FBS，上海申安)；双人单面净化工作台(SW-CJ-1C，苏州净化)；二氧化碳培养箱(BB16μV/BB5060μV，HERAEμS)；台式离心机(H3，Sigma)；酶标仪(Mμltiskan MK3，Thermo Scientific)；电热恒温鼓风干燥箱(101，上海鹏顺科学仪器有限公司)；倒置显微镜(XDS-1B，重庆光学仪器厂)；水浴恒温振荡器(SHZ-82，金坛市医疗仪器厂)；移液器(Gilson，Eppendorf)；培养瓶(Corning)；96孔板(Costar，μSA)[0043] 二、实验方法
[0044] 1.模型制备
[0045] 取低温冻存的PC12细胞复苏，接种于培养瓶中，以含10％胎牛血清的H-DMEM培养基培养。待PC12细胞生长至80％融合时，以0.25％的胰酶细胞消化液(含0.02％EDTA)4
进行消化，细胞计数，调整细胞密度，将适当密度的细胞接种96孔板中，1×10 个细胞/孔，调零孔不加细胞。置37℃、5％CO2培养箱进行培养。待96孔板中的细胞贴壁单层长满后，弃掉培养基，无菌PBS液清洗2遍，除调零组、正常对照组外，每孔加入终浓度为30mmol/l的谷氨酸(溶于不完全培养基中)于培养箱内继续培养24h，即造成PC12细胞损伤模型。
[0046] 2.实验分组
[0047] 将96孔板分为正常对照组、模型组、阳性药组、珍龙醒脑原制剂高、低剂量组，珍龙醒脑新制剂高、低剂量组，共7组，每组12孔。
[0048] 3.实验给药
[0049] 弃掉培养的谷氨酸损伤细胞培养液，用无菌PBS液清洗2遍，给药组每孔分别加入含筛选药物终浓度依次为10μg/ml、1μg/ml的DMEM培养基100μl。空白对照组加入等体积不含药物的DMEM培养基，阳性对照组加入终浓度为27mg/ml复方丹参滴丸无血清DMEM培养基100μl。每个浓度药物加12孔。将给药修复的细胞置37℃、5％CO2培养箱中继续培养24h。
[0050] 三、指标测定
[0051] 1.MTT法测定细胞活力
[0052] 细胞弃掉多余的培养液后，每孔加入100μl无血清DMEM培养基，加入5mg/mlMTT溶液20μl，于培养箱内避光反应4h。再弃掉培养液，加入二甲基亚砜(DMSO)100μl，混匀。用酶标仪于570nm测定光密度(OD)值，计算细胞存活率。计算公式：细胞存活率(％)＝(用药组或模型组A570/对照组A570)×100％。
[0053] 2.NO、LDH、SOD含量测定
[0054] 细胞损伤给药培养24小时后，用无菌管收集细胞上清液，离心20分钟(2000r/min)，仔细收集细胞上清液，按相应试剂盒说明书操作测定NO、LDH、SOD含量。
[0055] 四.实验结果
[0056] 1、珍龙醒脑胶囊对损伤的PC12细胞存活率的影响
[0057] 表1珍龙醒脑胶囊对损伤的PC12细胞存活率影响的结果( n＝12)
[0058]
[0059] 注：与模型组相比，*P＜0.05；与原制剂高剂量相比，#P＜0.05
[0060] 表1结果显示，与模型组相比，终浓度为1μg/ml，10μg/ml的新制剂及原制剂细胞存活率增加，P＜0.05，均有显著性差异；实施例1新制剂高剂量组与原制剂高剂量相比，存活率增加，P＜0.05，有显著性差异。提示新制剂在增强细胞活力方面优于原制剂。
[0061] 2、珍龙醒脑胶囊对PC12细胞的NO含量的影响
[0062] 表2珍龙醒脑胶囊对PC12细胞的NO含量的影响( n＝12)
[0063]
[0064] 注：与模型组相比，*P＜0.05
[0065] 表2结果显示，与模型组比较，新制剂高低剂量组NO含量降低，有显著性差异。原制剂高低剂量组NO含量无显著性差异。提示新制剂能够降低PC12细胞NO含量，且优于原制剂。
[0066] 3、珍龙醒脑胶囊对体外培养的PC12细胞LDH含量的影响
[0067] 表3珍龙醒脑胶囊对PC12细胞LDH影响( n＝12)
[0068]
[0069] 注：与模型组相比，*P＜0.05；与原制剂等剂量组相比，#P＜0.05。其中，IU/L是国际单位/升。
[0070] 表3结果显示，与模型组相比，新制剂及原制剂高剂量能降低体外培养的PC12细胞LDH含量，P＜0.05，均有显著性差异；实施例1新制剂高剂量组与原制剂高剂量组相比，LDH含量更低，P＜0.05，具有显著性差异。提示在降低LDH水平方面，新制剂优于原制剂。
[0071] 4、珍龙醒脑胶囊对体外培养的PC12细胞SOD含量的影响
[0072] 表4珍龙醒脑胶囊对PC12细胞SOD含量的影响( n＝12)
[0073]
[0074] 注：与模型组相比，*P＜0.05
[0075] 表4结果显示，与模型组相比，新制剂高、低剂量均能降低体外培养的PC12细胞SOD含量，P＜0.05，均有显著性差异，原制剂无显著性差异；提示在升高SOD水平方面，新制剂优于原制剂。
[0076] 五、实验结论
[0077] 1.MTT法细胞活性筛选结果证实：珍龙醒脑胶囊新制剂及原制剂，在适合浓度下均能增强由谷氨酸损伤的PC12细胞存活率，且新制剂优于原制剂。
[0078] 2.与原制剂相比，新制剂可显著降低培养液中LDH和NO含量，升高SOD水平，提示实施例1的制剂可降低神经细胞损伤程度，对谷氨酸损伤的神经细胞具有一定的保护作用，且作用优于原制剂。
[0079] 实验例2、对乙醇致小鼠学习记忆再现缺失的影响实验
[0080] 一、实验材料：
[0081] 1、珍龙醒脑胶囊新制剂：实施例1的制剂珍龙醒脑胶囊；
[0082] 2、珍龙醒脑胶囊原制剂(以下简称原制剂)：市售珍龙醒脑胶囊(青海金诃藏药药业股份有限公司)，批号：20090908。
[0083] 3、阳性对照药物：吡拉西坦，江西金钥药业有限公司，批号：100612。
[0084] 4、乙醇：天津市广成化学试剂有限公司，生产批号：20110915。
[0085] 5、DJ-200跳台自动测试仪：成都泰盟科技有限公司生产。
[0086] 二、实验方法
[0087] 取健康小鼠50只，雌雄各半，体重18～22g，随机分为5组，分别为空白组、体积百分比40％乙醇模型组、吡垃西坦0.8g/kg组、珍龙醒脑新制剂0.5g/kg和原制剂0.5g/kg组。各组灌胃(ig)给药，每天1次，共10天，空白组和模型组灌胃(ig)同体积蒸馏水，第9天给药后2h将小鼠放入跳台仪内训练5min；次日再灌胃(ig)给药1次，1.5h后灌胃(ig)体积百分比40％的乙醇10ml/kg，空白组灌胃(ig)同体积蒸馏水，30min后分批平行将小鼠放于跳台仪内的铜栅上，通电5min(电压控制在24V)并记录小鼠双脚触网次数，即为跳下次数。试验结果以 表示，采用单因素方差分析及LSD多组均数两两比较。P＜0.05为有统计学差异，结果见表5。
[0088] 三、实验结果
[0089] 表5对乙醇所致小鼠记忆获得障碍的作用(跳台法)( n＝10)
[0090]
[0091] 注：与空白组比较，**P＜0.01；与模型组比较，ΔP＜0.05
[0092] 表5结果表明：珍龙醒脑原制剂0.5g/kg和新制剂0.50g/kg能明显减少由乙醇造成的错误次数增多，提示该药对乙醇所致小鼠记忆再现缺失有良好的改善作用，且新制剂优于原制剂。
[0093] 实验例3、对樟柳碱所致小鼠记忆获得障碍的影响实验
[0094] 一、实验材料：
[0095] 1、珍龙醒脑胶囊新制剂：实施例1的制剂珍龙醒脑胶囊；
[0096] 2、珍龙醒脑胶囊原制剂(以下简称原制剂)：市售珍龙醒脑胶囊(青海金诃藏药药业股份有限公司)，批号：20090908。
[0097] 3、阳性对照药物：吡拉西坦：江西金钥药业有限公司，批号：100612。
[0098] 4、樟柳碱：由Sigma chemical CO.提供。
[0099] 5、DJ-200跳台自动测试仪：成都泰盟科技有限公司生产。
[0100] 二、实验方法
[0101] 取健康小鼠50只，雌雄各半，体重18～22g，随机分为5组，分别为空白组、樟柳碱模型组、吡垃西坦0.8g/kg组、珍龙醒脑原制剂0.5g/kg和新制剂0.5g/kg组。各组灌胃(ig)给药，每天1次，共10天，空白组和模型组灌胃(ig)同体积蒸馏水。第9天给药后2h除空白组外各组腹腔注射(ip)樟柳碱水溶液5mg/kg，10min后将小鼠放入跳台仪内适应3min，然后将小鼠放在铜栅上，通电5min，进行电击记忆训练。次日再灌胃(ig)给药1次，
2h后将小鼠放于跳台仪内的铜栅上，通电5min(电压控制在24V)，记录5min内小鼠双脚触网次数，即为跳下次数，试验结果以 表示，采用单因素方差分析及LSD多组均数两两比较。P＜0.05为有统计学差异，结果见表6。
[0102] 三、实验结果
[0103] 表6对樟柳碱所致小鼠记忆获得障碍的作用(跳台法)( n＝10)
[0104]
[0105] 注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，ΔP＜0.05
[0106] 表6结果表明：珍龙醒脑新制剂组0.50g/kg能明显减少5min内小鼠错误次数增多，表明其对樟柳碱造成的小鼠脑记忆获得性障碍具有明显的改善作用，提示珍龙醒脑具有明显的增强学习、记忆能力的作用，且新制剂优于原制剂。
[0107] 实施例2、一种治疗中风后遗症的药物组合物颗粒剂的制备
[0108] (1)挥发油提取及包合：按原料药组成配比取荜茇435g，丁香485g，肉豆蔻435g，豆蔻435g，草果325g，香旱芹270g，檀香435g，黑种草子270g，沉香865g，冬葵果865g，肉桂865g，木香1080g，紫檀香1080g，烈香杜鹃325g，共14味药材混合，按14味药材总重量的4倍加水，采用水蒸汽蒸馏法，提取挥发油，提取3h，收集挥发油，得挥发油19ml，药液滤过，得提取液A和药渣A；
[0109] 将所得挥发油加入重量体积百分比3％的β环糊精饱和水溶液中，挥发油与β环糊精的体积重量比为1ml∶5g，搅拌条件下，保持温度60℃，搅拌4h，-4℃冷藏过夜，抽滤，沉淀，50℃真空干燥，得挥发油包合物；
[0110] (2)乙醇提取：按原料药组成配比取甘草650g，短穗兔耳草2165g，广枣325g、塞北紫堇650g，诃子1405g，余甘子1080g，毛诃子(去核)865g，共7味药材，与步骤(1)提取挥发油后的药渣A混合，加入体积比浓度60％乙醇水溶液回流提取2次，第一次加乙醇的量是所述7味药材与药渣A总重量的8倍，提取2h，第二次加乙醇的量是所述7味药材与药渣A总重量的8倍重量份，提取2h，滤过，合并药液得乙醇提取物液，减压浓缩，干燥，得乙醇提取物和药渣B；
[0111] (3)水提取：上述步骤(2)乙醇提取后的药渣B，加水提取2次，第一次加水的重量是药渣B重量的8倍，提取2h，第二次加水的重量是药渣B重量的9倍，提取2h，滤过，合并药液得提取液B，将该提取液B与步骤(1)提取挥发油后的提取液A合并，减压浓缩，浓缩至60℃条件下相对密度为1.12的流浸膏，干燥，得水提取物；
[0112] (4)药材细粉粉碎：按上述原料药比例取珍珠865g、天竺黄110g、西红花435g、螃蟹540g、金礞石435g、铁粉(制)215g、人工牛黄110g、麝香110g，共8味药材，粉碎，得药材细粉；
[0113] (5)制剂成型：将上述步骤(1)至(4)得到的挥发油包合物、乙醇提取物、水提取物和药材细粉混匀，得珍龙醒脑提取物，按照常规工艺，加入珍龙醒脑提取物5倍重量份的糖粉及2％-5％羟丙基甲基纤维素(HPMC)，混匀，用体积浓度80％乙醇制粒，干燥，每袋装2g，即得。
[0114] 实施例3、一种治疗中风后遗症的药物组合物片剂的制备
[0115] (1)挥发油提取及包合：按原料药组成配比取荜茇435g，丁香485g，肉豆蔻435g，豆蔻435g，草果325g，香旱芹270g，檀香435g，黑种草子270g，沉香865g，冬葵果865g，肉桂865g，木香1080g，紫檀香1080g，烈香杜鹃325g，共14味药材混合，按14味药材总重量的8倍加水，采用水蒸汽蒸馏法，提取挥发油，提取6h，收集挥发油，得挥发油22ml，药液滤过，得提取液A和药渣A；
[0116] 将所得挥发油加入重量体积百分比4％的β环糊精饱和水溶液中，挥发油与β环糊精的体积重量比为1ml∶3g，搅拌条件下，保持温度40℃，搅拌6h，0℃冷藏过夜，抽滤，沉淀，50℃真空干燥，得挥发油包合物；
[0117] (2)乙醇提取：在上述步骤(1)提取挥发油后的药渣A中按上述原料药比例加入甘草650g，短穗兔耳草2165g，广枣325g、塞北紫堇650g，诃子1405g，余甘子1080g，毛诃子
