水稻叶绿体发育相关蛋白及其编码基因与应用

摘要

本发明公开了一种水稻叶绿体发育相关蛋白及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质，名称为YLM(Yellow Leaf Mutant)，来源于水稻(Oryza sativa），是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物叶绿体发育相关的由序列2衍生的蛋白质。本发明的实验证明，本发明克隆得到YLM基因，缺失该基因的植株叶片黄化，证明YLM基因在叶绿体发育中发挥重要作用。

权利要求

1.抑制或沉默YLM蛋白表达的物质在调控植物叶绿体发育中的应用；所述YLM蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2；所述抑制或沉默YLM蛋白表达的物质为重组载体、含有重组载体的转基因细胞系或重组菌；

所述重组载体为将DNA片段1和DNA片段2均插入双元表达载体中，得到的抑制或沉默YLM蛋白表达的重组载体；所述DNA片段1的编码区与所述DNA片段2的编码区互为反向互补；所述DNA分子1编码区的核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第1位-780位核苷酸；

所述植物为水稻。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述调控植物叶绿体发育为抑制植物叶绿体发育，所述抑制植物叶绿体发育体现在使植物叶片黄化和/或使植物叶片叶绿体中类囊体减少。

3.一种培育转基因植物的方法，为抑制目的植物中的YLM蛋白的活性或表达，得到转基因植物，所述转基因植物具有如下1)或2)中至少一种特征：

1)所述转基因植物叶片黄化；

2)所述转基因植物叶片叶绿体中类囊体少于所述目的植物；

所述目的植物为水稻；

所述抑制目的植物中的YLM蛋白的活性或表达为将权利要求1中的所述重组载体导入所述目的植物。

说明书

水稻叶绿体发育相关蛋白及其编码基因与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及植物基因工程领域，尤其涉及一种水稻叶绿体发育相关蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

[0002] 叶绿体是植物细胞各种代谢和调控活动的中心，它是半自主细胞器，具有自身的基因组。高等植物叶绿体不仅仅是光合作用的场所，同时也是许多代谢产物合成以及储存的重要场所。具有光合活性的叶绿体是茎端分生组织的前质体发育来的。这个发育过程是在特定器官中进行的，依赖于光，受质体和核基因组编码的众多基因控制。随着类囊体的不断完善，叶绿体逐渐发育成熟。叶绿体中有大约3000种蛋白，他们在前质体到成熟叶绿体的发育过程，植物发育阶段调控以及对植物对环境胁迫做出响应等方面扮演重要角色。这些蛋白广泛参与叶绿体DNA合成，叶绿体转录翻译元件的形成，光合作用各个元件的合成组装等。研究表明，这些蛋白并不是在合成之后便一直存在，而是在工作一定时间后被降解。参与这些蛋白降解的蛋白酶有基质丝氨酸Clp蛋白酶，结合在类囊体上的FtsH金属蛋白酶，丝氨酸DegP蛋白酶,类囊体结合t SppA和EGY1蛋白酶等。蛋白酶对底物的降解是有选择性的，对底物的识别是由降解元件及分子伴侣活性共同实现的。

[0003] 在这些蛋白酶中，ATP依赖的Clp肽酶研究最多。这类酶包含一个催化中心以及一个HSP100辅助因子。在依赖能量的方式下，Hsp100选择并转运错误折叠的蛋白底物到催化中心进行降解。研究发现，双子叶植物叶绿体Clp蛋白酶调控叶绿体生物发生以及植物发育。但单子叶植物中Clp蛋白酶的基因及功能还不清楚。

发明内容

[0004] 本发明的一个目的是提供一种水稻叶绿体发育相关蛋白及其编码基因。

[0005] 本发明提供的水稻叶绿体发育相关蛋白，名称为YLM，来源于水稻(Oryza sativa），是如下（a）或（b）：

[0006] （a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

[0007] （b）将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物叶绿体发育相关的由序列2衍生的蛋白质。

[0008] 所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

[0009] 上述序列表中的序列2由259个氨基酸残基组成。

[0010] 编码所述蛋白的DNA分子也属于本发明的保护范围。

[0011] 所述DNA分子是如下(1）或(2）或(3）的DNA分子：

[0012] (1）编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；

[0013] (2）在严格条件下与（1）限定的DNA序列杂交且编码与植物叶绿体发育相关蛋白的DNA分子；

[0014] (3）与（1）限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有
99%同源性且编码与植物叶绿体发育相关蛋白的DNA分子。

[0015] 上述严格条件为在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下杂交,然后用2×SSC,0.1%SDS和1×SSC,0.1%SDS各洗膜一次。

[0016] 上述序列表中的序列1由780个核苷酸组成。

[0017] 本发明的另一个目的是提供抑制或沉默上述蛋白表达的物质的用途。

[0018] 本发明提供的抑制或沉默上述蛋白表达的物质在调控植物叶绿体发育中的应用。

[0019] 上述应用中，所述抑制或沉默上述蛋白表达的物质为重组载体、含有重组载体的转基因细胞系或重组菌；

[0020] 所述重组载体为将DNA片段1和DNA片段2均插入双元表达载体中，得到的抑制或沉默权利要求1所述蛋白表达的重组载体；所述DNA片段1的编码区与所述DNA片段2的编码区互为反向互补；所述DNA分子1编码区的核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第1位-780位核苷酸；在本发明的实施例中，双元表达载体为

[0021] pCUbi1390-△FAD2，重组载体为RNA干扰重组载体pCUbi1390-△FAD2-SX-YLM，具体构建方法见实施例2的一。

[0022] 上述应用中，所述调控植物叶绿体发育为抑制植物叶绿体发育，所述抑制植物叶绿体发育具体体现在使植物叶片黄化和/或使植物叶片叶绿体中类囊体减少；

[0023] 所述植物具体为双子叶植物或单子叶植物；所述单子叶植物进一步具体为水稻。

[0024] 本发明的第三个目的提供重组载体、含有重组载体的转基因细胞系或重组菌。

[0025] 本发明提供的重组载体、含有重组载体的转基因细胞系或重组菌：

[0026] 所述重组载体为将DNA片段1和DNA片段2均插入双元表达载体中，得到的抑制或沉默权利要求1所述蛋白表达的重组载体；所述DNA片段1的编码区与所述DNA片段2的编码区互为反向互补；所述DNA分子1编码区的核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第1位-780位核苷酸；

[0027] 在本发明的实施例中，双元表达载体为pCUbi1390-△FAD2，重组载体为RNA干扰重组载体pCUbi1390-△FAD2-SX-YLM，其构建方法见实施例2的一。

[0028] 本发明的第四个目的是提供一种培育转基因植物的方法。

[0029] 本发明提供的方法，为抑制目的植物中的上述蛋白的活性或表达，得到转基因植物，所述转基因植物具有如下1）或2）中至少一种特征：

[0030] 1）所述转基因植物叶片黄化；

[0031] 2）所述转基因植物叶片叶绿体中类囊体少于所述目的植物。

[0032] 与目的植物相比，所述转基因植物叶片的类囊体排列松散。

[0033] 上述方法中，所述抑制目的植物中的上述蛋白的活性或表达具体为上述的重组载体导入所述目的植物；

[0034] 所述目的植物具体为双子叶植物或单子叶植物；所述单子叶植物进一步具体为水稻。

[0035] 扩增所述基因全长或其任意片段的引物对也是本发明保护的范围。

[0036] 本发明的实验证明，本发明克隆得到YLM基因，缺失该基因的植株叶片黄化且使植物叶片的类囊体减少，证明YLM基因或其编码的蛋白在叶绿体发育中发挥重要作用。

附图说明

[0037] 图1为pCUbi1390-△FAD2载体结构图谱

[0038] 图2为YLM干扰植株中YLM基因转录水平检测

[0039] 图3为YLM缺失植株外观表型

[0040] 图4为YLM缺失植株叶绿体发育观察

具体实施方式

[0041] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0042] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0043] 水稻(Oryza sativa ssp.Japonica)Asominori（以下也称为野生型水稻或水稻日本晴,WT）记载在如下文献中：Wu W,Zheng XM,Lu G,Zhong Z,Gao H,Chen L,Wu C,Wang HJ,Wang Q,Zhou K,Wang JL,Wu F,Zhang X,Guo X,Cheng Z,Lei C,Lin Q,Jiang L,Wang H,Ge S,Wan J（2013）Association of functional nucleotide polymorphisms at DTH2with the northward expansion of rice cultivation in Asia.Proc Natl Acad Sci U S A.19;110(8):2775-80，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。

[0044] 根 癌 农 杆 菌 EHA105（Agrobacterium tumefaciens EHA105） 记 载在 New Agrobacterium helper plasmids for gene transfer to plants.Hood,Elizabeth E;Gelvin,Stanton B;Melchers,Leo S;Hoekema,Andre.Transgenic Research,2(4):p.208-218-218（1993）.公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。

[0045] 双元表达载体pCUbi1390记载在如下文献中：Wu Z,Zhang X,He B,Diao L,Sheng S,Wang J,Guo X,Su N,Wang L,Jiang L,Wang C,Zhai H,Wan J.A chlorophyll-deficient rice mutant with impaired chlorophyllide esterification in chlorophyll biosynthesis.Plant Physiol.2007Sep;145(1):29-40，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。

[0046] pCUbi1390-△FAD2载体记载在如下文献中：Wax crystal-sparse leaf2,a rice homologue of WAX2/GL1,is involved in synthesis of leaf cuticular wax.Mao B.,et al.(2012).Planta235:39–52，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。

[0047] 水稻材料的栽培条件：将水稻种子用水浸泡3天，然后播种在苗床上。4叶期的水稻幼苗移栽到水田中，分单株插秧。

[0048] 实施例1、YLM基因的获得

[0049] 根 据 gramene 数 据 库，设 计 引 物（引 物 序 列 为：forward primer，5’-ATGGCGCCTATGGCCATCTCCAC-3’；reverse primer，5’-TTAGTATCTTGTTTCCAGCAGG[0050] -3’），用上述引物，以水稻(Oryza sativa ssp.Japonica)Asominori的2周幼苗的cDNA为模板，进行PCR扩增，得到PCR产物具有序列表中序列1所示的核苷酸，该PCR产物的基因为YLM，该基因的编码区为序列表中序列1所示的核苷酸；该基因编码的蛋白命名为YLM，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。

[0051] 实施例2、YLM基因在调控植物叶绿体发育中的应用

[0052] 一、YLM基因RNA干扰载体pCUbi1390-△FAD2-SX-YLM的构建

[0053] 1、YLM基因干扰片段的获得

[0054] （1）水稻(Oryza sativa ssp.Japonica)Asominori幼苗RNA的提取及cDNA的制备

[0055] 使用RNAprep pure植物总RNA提取试剂盒（购自天根生化科技（北京）有限公司），提取水稻(Oryza sativa ssp.Japonica)Asominori的14天幼苗的RNA，反转录得到cDNA。

[0056] （2）引物设计

[0057] 扩增YLM正义片段的引物为YLM-sense-F:5-

[0058] TTCTGCACTAGGTACCAGGCCTGATGGCGCCTATGGCCATCTCCAC-3和

[0059] YLM-sense-R:5-CTGACGTAGGGGCGATAGAGCTCTTAGTATCTTGTTTCCAGCAGG-3。

[0060] 扩 增 YLM 反 义 片 段 的 引 物 为 YLM-antisense-F:5-CGGGGATCCGTCGACTAC ATGGCGCCTATGGCCATCTCCAC-3 和 YLM-antisense-R:5-AGGTGGAAGACGCGTTAC TTAGTATCTTGTTTCCAGCAGG-3。

[0061] （3）PCR扩增YLM基因干扰片段

[0062] 以（1）得到的cDNA为模板，用YLM-sense-F及YLM-sense-R引物进行PCR扩增，得片段1。以cDNA为模板，用YLM-antisense-F及YLM-antisense-R引物进行PCR扩增，得到片段2。

[0063] 将上述片段电泳检测,片段大小为780bp，片段2大小为780bp。将片段1和片段2均送去测序，结果表明片段1的编码序列为序列表中序列1所示核苷酸自5’末端第1-780bp，片段2的编码序列为序列表中序列1所示核苷酸自5’末端第1-780的反向互补序列。

[0064] 2、带YLM基因正义干扰片段的pCUbi1390-△FAD2-sense-YLM重组载体获得[0065] （1）YLM基因正义干扰片段的同源重组定向克隆

[0066] 用Sac Ⅰ 酶 切 载 体 pCUbi1390- △ FAD2（参 见 图1），得 到 了 线 性pCUbi1390-△FAD2，回收。将片段1采用同源重组定向克隆的方法连接到线性的pCUbi1390-△FAD2载体（具体步骤和方法参考clontech infusion kit说明书，该试剂盒可从大连宝生物公司购买），再将同源重组产物转入DH5α感受态细胞，37度培养过夜，得到单克隆。

[0067] （2）鉴定pCUbi1390-△FAD2-sense-YLM重组载体

[0068] 挑选（1）中所得的单克隆，接种于含卡拉霉素的LB液体培养基中，过夜培养；取过夜培养的菌液作为PCR反应模板，使用载体引物1390-F及FAD-R进行PCR扩增,鉴定已经插入片段1的pCUbi1390-△FAD2-sense-YLM重组载体，得到854bp DNA条带的即为阳性克隆，引物序列如下：

[0069] 1390-F：5'-TGCCTTCATACGCTATTTATTTGC-3'；

[0070] FAD-R：5'-GAAGCGACGGACCTGGAGAT-3'。

[0071] 提取阳性克隆的质粒，送去测序，测序引物为Left MCS-F及Left MCS-R，测序结果表明，片段1正确连接到pCUbi1390-△FAD2载体SacⅠ上的质粒命名为pCUbi1390-△FAD2-sense-YLM。

[0072] 3、带YLM基因正义及反义干扰片段的pCUbi1390-△FAD2-SX-YLM重组载体的获得

[0073] （1）YLM基因反义干扰片段的同源重组定向克隆

[0074] 用SnaBⅠ酶切步骤pCUbi1390-△FAD2-sense-YLM质粒，回收待用。采用同源重组定向克隆的方法（具体步骤和方法参考clontech infusion kit说明书，该试剂盒可从大连宝生物公司购买），先将回收的片段2和线性pCUbi1390-△FAD2-sense-YLM进行同源重组反应，再将同源重组产物转入DH5α感受态细胞，37度过夜培养得到单克隆。

[0075] （2）鉴定pCUbi1390-△FAD2-SX-YLM重组载体

[0076] 挑选单克隆菌，接种于含卡拉霉素的LB液体培养基中，过夜培养；取过夜培养的菌液作为PCR反应模板，使用FAD-F及1390-R引物，进行PCR扩增反应。引物序列如下：

[0077] FAD-F：5'-CCTTTCACAACCTGATTTCCCA-3'；

[0078] 1390-R：5'-TAATCATCGCAAGACCGGCAACAGG-3'。

[0079] 能够扩出片段大小为1k的质粒即为阳性克隆。将该质粒送去测序，以FAD-F及1390-R作为测序引物，该质粒为将片段1连接到pCUbi1390-△FAD2载体SacⅠ，且将片段2连接到pCUbi1390-△FAD2载体SnabI位点的质粒，片段1的编码区和片段2的编码区互为反向互补；命名为pCUbi1390-△FAD2-SX-YLM。

[0080] 二、RNA干扰转YLM RNAi水稻的获得

[0081] 将 上 述 获 得 的RNA 干 扰 重 组 载 体pCUbi1390- △FAD2-SX-YLM 通 过热激的方法转入根癌农杆菌EHA105中，得到重组菌，提取质粒，送去测序，质 粒 为 pCUbi1390-△ FAD2-SX-YLM，含 有 该 质 粒 的 重 组 菌 命 名 为 EHA105/pCUbi1390-△FAD2-SX-YLM。将水稻(Oryza sativa ssp.Japonica)Asominori的种子脱壳灭菌，接种到诱导愈伤的培养基（N6基本培养基，美国PhytoTechnology Laboratories，C167）中。培养3周后，从盾片处生长出愈伤组织，挑选生长旺盛，颜色浅黄，比较松散的胚性愈伤，用作转化的受体。

[0082] 将上述获得的EHA105/pCUbi1390-△FAD2-SX-YLM侵染胚性愈伤，在黑暗处25℃培养3天后，在含有50mg／L潮霉素的选择培养基（N6基本培养基，美国PhytoTechnology Laboratories，C167）上，加入50mg/L的潮霉素抗性植株。将潮霉素抗性植株在阴凉处炼苗，几天后移栽到水田，得到T0代转YLM RNAi水稻。

[0083] T0代转YLM RNAi水稻植株收种后播种得到T1代转YLM RNAi水稻植株。

[0084] 用载体上的引物1390-F(10707-10730):TGCCTTCATACGCTATTTATTTGC和FAD2-R(10827-10846):GAAGCGACGGACCTGGAGAT进行RT-PCR鉴定阳性苗。以野生型水稻（Asominori）为对照。

[0085] 内 参 为 Ubiquitin，内 参 的 引 物 为 UBI-F:ACCCTGGCTGACTACAACATC 和UBI-R:AGTTGACAGCCCTAGGGTG。

[0086] 结果如图2所示，野生型水稻中YLM的相对表达量为0.06,而T1代转YLM RNAi水稻株系R1，R2，R3，R7，R8，R10,R15，R16中YLM的相对表达量分别为0.001,0.01,0.02,0.005,0.01,0.015,0.014和0.03。可见T1代转YLM RNAi水稻中YLM表达量低于野生型水稻。

[0087] 采用同样方法将空载体pCUbi1390-△FAD2转入野生型水稻中，得到T0代转pCUbi1390-△FAD2水稻，收种、播种，得到T1代转pCUbi1390-△FAD2水稻。。

[0088] 三、RNA干扰转YLM RNAi水稻的表型鉴定

[0089] 将T1代转YLM RNAi水稻(YLM)株系R1、野生型水稻（WT）的种子播种后，观察整个生长期内野生型和转基因植株表型差异。

[0090] 表型观察结果如图3，为生长2周苗表型对比；可以看出，T1代转YLM RNAi水稻（YLM）和野生型水稻（WT）相比，叶片黄化，植株生长缓慢。

[0091] 野生型水稻（WT）和T1代转pCUbi1390-△FAD2水稻结果无显著差异。

[0092] 通过扫面电镜对野生型水稻和T1代转YLM RNAi水稻(YLM)叶绿体结构进行了对比观察。别取3周龄叶片中段，室温固定于1%戊二醛和1%锇酸(pH7.2)中1小时，用30%，50%，70%，80%，90%，100%乙醇系列脱水，每个梯度30min，后用London Resin White树脂(London Reson Company)包埋一聚合。用超薄切片机(Leica Ultracut E，Germany)切成约80nm厚的切片，装入铜网（Electron Microscopy Sciences,America）室温经2%醋酸铀酰染色5min，再经柠檬酸铅染色3min，用透射电子显微镜（HITACHI-H7500TEM;Japan）观察、照相。

[0093] 结果如图4所示，选取5叶期苗为材料，对叶绿体结构进行观察。A和B为野生型第三片叶上半部的叶绿体结构；C和D为T1代转YLM RNAi水稻植株第三片叶上半部的叶绿体结构；从图中可以看出，野生型叶片比T1代转YLM RNAi水稻叶片叶绿体中类囊体更丰富，并且排列更紧密规则。这说明YLM基因在叶片发育中起重要作用。以上结果表明，YLM为与叶绿体发育相关的基因，其编码的蛋白与叶绿体发育相关，干扰其表达，可以使植物叶片黄化，且导致叶片叶绿体中类囊体减少。