一种胶冻样类芽孢杆菌以及利用其生产复合微生物菌剂的方法

摘要

本发明属于微生物制剂的制备，特别是指一种胶冻样类芽孢杆菌以及利用其生产复合微生物菌剂的方法。选用胶冻样类芽孢杆菌（Paenibacillus mucilaginosus）CGMCC No.7240进行发酵后，将其发酵液复配氨基寡糖和相应的微量元素制成复合微生物菌剂。本发明解决了现有技术存在的绿色生物农用制剂尚无成熟产品、潜在市场缺口较大的问题，具有生产的无公害绿色生物制剂具有农药和肥料双重功能，在使用中，可减少用肥次数和使用成本，产生药肥互相促进、互相提高的增效作用，具有显者的环保价值和社会效益。

权利要求

1.利用胶冻样类芽孢杆菌生产复合微生物菌剂的方法，其特征在于包括如下工艺步骤：A、扩大培养

将原始菌种经扩大培养制成生产菌种；

原始菌种选用胶冻样类芽孢杆菌（Paenibacillus mucilaginosus），其保藏编号为CGMCC No.7240；

B、制备发酵液

B1、发酵

按照体积比为生产菌种：发酵培养基＝10％-15％的比例将生产菌种接种到灭菌后的发酵培养基中发酵，发酵的条件为：温度25-32℃，压力0.03-0.7MPa，通风量控制条件是：

3 3 3

发酵开始后为200-250M/hr、发酵4小时后为320-360M/hr、发酵8小时后为420-470M/

3 3

hr、发酵12小时后为520-560M/hr、发酵20小时后为600-630M/hr，发酵开始4-8小时后开始搅拌，直至发酵终点；

发酵培养基由如下质量百分比的组份组成：

淀粉0.3-1.5％，豆饼粉0.03-0.1％，碳酸钙0.05-0.2％，蔗糖0.08-0.5％，硫酸铵0.01-0.08％，磷酸氢二钾0.08-0.5％，硫酸镁0.08-0.5％，三氯化铁0.008-0.05％，酵母膏0.03-0.15％，氢氧化钾0.01-0.1％，消泡剂0.005-0.02％，余量为自来水，pH＝

7.2-7.4；

B2、检测及终点控制

发酵中根据菌体生长状况定时取样、镜检，发酵至40±5小时后取样镜检，当95％的营养体形成芽孢，芽孢含量达到5亿个/毫升以上，终止发酵并制成发酵液；

C、复合微生物菌剂的配制

按照步骤B中制备的发酵液为69.7-91.2kg、氨基寡糖为8-30kg、复合微量元素添加剂为0.3-0.8kg的比例，将上述组分混配制成复合微生物菌剂；其中复合微量元素添加剂由如下质量的组分组成：硼砂或硼酸10-20kg，硫酸锌或氯化锌5-15kg，钼酸铵3-12kg，硫酸锰2-8kg；

所述的步骤C中氨基寡糖为为由甲壳素降解而得到的液体产品，含质量百分含量为

0.2％-0.5％的氨基寡糖，聚合度为2-10，分子量400-2000。

2.根据权利要求1所述的利用胶冻样类芽孢杆菌生产复合微生物菌剂的方法，其特征在于所述的扩大培养包括：A1、斜面菌种的的制备；A2、克氏瓶斜面菌种的制备；A3、生产菌种的制备。

3.根据权利要求2所述的利用胶冻样类芽孢杆菌生产复合微生物菌剂的方法，其特征在于所述的A1、斜面菌种的制备是：将原始菌种接入灭菌后试管斜面培养基，在25-32℃条件下恒温培养2-5天制成斜面菌种；所述的试管斜面培养基由如下组分组成：蔗糖5-15克，磷酸氢二钾0.2-1克，硫酸镁0.1-0.5克，氯化钠0.1-0.5克，碳酸钙

0.5-3克，硫酸钙0.05-0.3克，酵母膏0.1-1克，水1000毫升，琼脂15-22克，pH＝7.2。

4.根据权利要求2所述的利用胶冻样类芽孢杆菌生产复合微生物菌剂的方法，其特征在于所述的A2、克氏瓶斜面菌种的制备是：将步骤A1中制备的斜面菌种接入灭菌后的克氏瓶斜面培养基；在25-32℃条件下恒温培养4-6天制成克氏瓶斜面菌种；克氏瓶斜面培养基由如下组份组成：葡萄糖0.5-2克，蛋白胨0.5-2克，磷酸氢二钾0.5-2克，硫酸铵0.1-0.5克，酵母膏

0.3-1.5克，硫酸镁0.1-0.5克，水1000ml，琼脂15-22克，pH＝7.2；将上述培养基按照每瓶60-80ml的量装入250ml克氏瓶中，灭菌、摆斜面制成克氏瓶斜面培养基。

5.根据权利要求2所述的利用胶冻样类芽孢杆菌生产复合微生物菌剂的方法，其特征在于所述的A3、生产菌种的制备是：将步骤A2中制备的克氏瓶斜面菌种接入灭菌后的种子培养基，经通气培养制成生产菌种；培养条件如下：温度25-32℃，压力0.05MPa，通风量0-8

3 3

小时50-70M/hr，8小时以后70-90M/hr，培养周期15-20小时；培养12小时后开始取样镜检观察生长状况，当菌体处于对数期生长期时，含菌量达到工艺要求，无杂菌，即可终止 培养；所述的种子培养基由如下质量百分数的组分组成：淀粉0.2-1％，豆饼粉0.1-0.7％，碳酸钙0.05-0.3％，蔗糖0.05-0.3％，硫酸铵

0.1-1％，消泡剂0.005-0.015％，余量为自来水，灭菌后pH＝6.3。

6.根据权利要求1或3-5中任一项所述的利用胶冻样类芽孢杆菌生产复合微生物菌剂的方法，其特征在于所述的灭菌的条件是：温度为121℃，时间为20-45分钟。

7.根据权利要求5中所述的利用胶冻样类芽孢杆菌生产复合微生物菌剂的方法，其特征在于步骤A3是将步骤A2中制备的克氏瓶斜面菌种制成菌悬液接入灭菌后的种子培养基，步骤A3中采用的种子发酵罐的容量为2吨，种子培养基在种子发酵罐中的装量体积比为60％-80％。

8.根据权利要求1所述的利用胶冻样类芽孢杆菌生产复合微生物菌剂的方法，其特征在于所述的步骤B1中的搅拌转速为730转/分钟，采用的发酵罐的容量为15吨，发酵培养基在发酵罐中的装量体积比为60％-80％。

说明书

一种胶冻样类芽孢杆菌以及利用其生产复合微生物菌剂的

方法

技术领域

[0001] 本发明属于微生物制剂的制备，特别是指一种胶冻样类芽孢杆菌以及利用其生产复合微生物菌剂的方法。

背景技术

[0002] 长期以来，由于大量使用化学农药而造成的环境污染问题日趋严重。化学农药因其不具有选择性，对有益的生物也会造成威胁，并且化学农药的不可降解性，极易在动植物体内积累而造成污染物的富集。随着公众对“绿色食品”、“无公害食品”的要求越来越高，市场对无污染、可降解的生物农药需求量也逐渐增多，从农药研究和生产的发展趋势来看，新型的绿色生物源农用制剂有着广阔的开发应用前景。

[0003] 近年来国内外许多研究发现，寡糖类物质具有很重要生物活性，已引起了有关学者的高度重视，一致认为其具有极大的研究和应用价值，特别是聚合度20以下的氨基寡糖，由水产品加工的附产物——甲壳素而来，是绿色安全的天然生物源物质，在医药、农业、食品方面的应用都是不容忽视的，特别是作为一种安全无毒的生物源农药被证实可有效地诱导植物产生防御反应，提高植物抗逆能力，可用来防治植物病害，从而调节和促进植物生长，不破坏生态平衡，其具有重要的研究和生产价值。微生物菌剂是近年大力发展和广泛应用的新型绿色生物制剂，具有成本低、肥效高、无污染、可节约能源等优点，能提供植物所需的多种营养物质，可促进植物生长，改良土壤结构，修复生态环境恶化的土壤，达到改善作物品质、提高产量的功效，目前是化肥有效的替代品。

发明内容

[0004] 本发明的目的之一是提供一种胶冻样类芽孢杆菌。

[0005] 本发明的目的之二是提供利用胶冻样类芽孢杆菌生产复合微生物菌剂的方法。

[0006] 本发明的整体技术构思是：

[0007] 一种胶冻样类芽孢杆菌（Paenibacillus mucilaginosus），其保藏编号为CGMCC No.7240。

[0008] 上述微生物已于2013年1月31日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC）保藏，其保藏编号为CGMCC No.7240，该保藏单位的地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

[0009] 上述微生物的理化特性及培养特征是：在无氮培养基上，菌落表面湿润、光滑，边缘整齐，质地粘稠并有弹性，无色透明隆起，菌体杆状，大小为4-7×1-1.2μm，在有氮淀粉培养基上30小时开始形成芽孢，芽孢椭圆形，位于孢囊中部，孢囊不膨大，菌体幼龄时周生鞭毛，在有氮钾长石培养基上20小时后形成肥厚荚膜，革兰氏染色阴性。

[0010] 在纯培养条件下，从100g钾长石粉中释放出比对照高219mg有效钾，增加67.38%；从100g土壤矿物（硅铝酸盐）中分解出比对照高47mg的水溶性钾，增加35.34%。在以100g磷矿粉为底物时，分解出比对照高80.4mg的可利用性磷；发酵液经液相色谱测定证明，该菌株可产生赤霉素、细胞分裂素和某些抗生素类的生理活性物质和营养物质，因此利用该菌株生产的生物制剂具有营养、抗病、改土、促生长的多重效果。

[0011] 利用胶冻样类芽孢杆菌生产复合微生物菌剂的方法，包括如下工艺步骤：

[0012] A、扩大培养

[0013] 将原始菌种经扩大培养制成生产菌种；

[0014] 原始菌种选用胶冻样类芽孢杆菌（Paenibacillus mucilaginosus），其保藏编号为CGMCC No.7240；

[0015] B、制备发酵液

[0016] B1、发酵

[0017] 按照体积比为生产菌种：发酵培养基=10%-15%的比例将生产菌种接种到灭菌后的发酵培养基中发酵，发酵的条件为：温度25-32℃，压力0.03-0.7MPa，通风量控制3 3
条件是：发酵开始后为200-250M/hr、发酵4小时后为320-360M/hr、发酵8小时后为
3 3 3
420-470M/hr、发酵12小时后为520-560M/hr、发酵20小时后为600-630M/hr，发酵开始
4-8小时后开始搅拌，直至发酵终点；

[0018] 发酵培养基由如下质量百分比的组份组成：

[0019] 淀粉0.3-1.5%，豆饼粉0.03-0.1%，碳酸钙0.05-0.2%，蔗糖0.08-0.5%，硫酸铵0.01-0.08%，磷酸氢二钾0.08-0.5%，硫酸镁0.08-0.5%，三氯化铁0.008-0.05%，酵母膏
0.03-0.15%，氢氧化钾0.01-0.1%，消泡剂0.005-0.02%，余量为自来水，pH=7.2-7.4；

[0020] B2、检测及终点控制

[0021] 发酵中根据菌体生长状况定时取样、镜检，发酵至40±5小时后取样镜检，当95%的营养体形成芽孢，芽孢含量达到5亿个/毫升以上，终止发酵并制成发酵液；

[0022] C、复合微生物菌剂的配制

[0023] 按照步骤B中制备的发酵液为69.7-91.2kg、氨基寡糖为8-30kg、复合微量元素添加剂为0.3-0.8kg的比例，将上述组分混配制成复合微生物菌剂；其中复合微量元素添加剂由如下质量的组分组成：

[0024] 硼砂或硼酸10-20kg，硫酸锌或氯化锌5-15kg，钼酸铵3-12kg，硫酸锰2-8kg。

[0025] 本发明中的氨基寡糖为由甲壳素降解而得到的液体产品，含质量百分含量为0.2%-0.5%的氨基寡糖，聚合度为2-10，分子量400-2000，可市售购得。

[0026] 本发明的具体技术步骤及工艺参数是：

[0027] 为缩短发酵的工艺过程，减少发酵过程中感染杂菌的机会，较为常见的方法是采用原始菌种扩大培养制成生产菌种（种子液），将其接入发酵培养基培养的方式。其中较为优选的技术方案是，采用的所述的扩大培养包括：A1、斜面菌种的的制备；A2、克氏瓶斜面菌种的制备；A3、生产菌种的制备。

[0028] 步骤A1优选的技术方案是，所述的A1、斜面菌种的制备是：将原始菌种接入灭菌后试管斜面培养基，在25-32℃条件下恒温培养2-5天制成斜面菌种；所述的试管斜面培养基由如下组分组成：

[0029] 蔗糖5-15克，磷酸氢二钾0.2-1克，硫酸镁0.1-0.5克，氯化钠0.1-0.5克，碳酸钙0.5-3克，硫酸钙0.05-0.3克，酵母膏0.1-1克，水1000毫升，琼脂15-22克，pH=7.2。

[0030] 步骤A2优选的技术方案是，所述的A2、克氏瓶斜面菌种的制备是：将步骤A1中制备的斜面菌种接入灭菌后的克氏瓶斜面培养基；在25-32℃条件下恒温培养4-6天制成克氏瓶斜面菌种；克氏瓶斜面培养基由如下组份组成：

[0031] 葡萄糖0.5-2克，蛋白胨0.5-2克，磷酸氢二钾0.5-2克，硫酸铵0.1-0.5克，酵母膏0.3-1.5克，硫酸镁0.1-0.5克，水1000ml，琼脂15-22克，pH=7.2；将上述培养基按照每瓶60-80ml的量装入250ml克氏瓶中，灭菌、摆斜面制成克氏瓶斜面培养基。

[0032] 步骤A3优选的技术方案是，A3、生产菌种的制备是：将步骤A2中制备的克氏瓶斜面菌种接入灭菌后的种子培养基，经通气培养制成生产菌种；培养条件如下：温度3 3
25-32℃，压力0.05MPa，通风量0-8小时50-70M/hr，8小时以后70-90M/hr，培养周期
15-20小时；培养12小时后开始取样镜检观察生长状况，当菌体处于对数期生长期时，含菌量达到工艺要求，无杂菌，即可终止培养，所述的种子培养基由如下质量百分数的组分组成：

[0033] 淀粉0.2-1%，豆饼粉0.1-0.7%，碳酸钙0.05-0.3%，蔗糖0.05-0.3%，硫酸铵0.1-1%，消泡剂0.005-0.015%，余量为自来水，灭菌后pH=6.3。

[0034] 培养基灭菌是本领域的常规技术，较为常见的技术手段是采用蒸汽灭菌，其中灭菌的条件是：温度为121℃，时间为20-45分钟。

[0035] 步骤A3中优选采用的技术方案是，步骤A3是将步骤A2中制备的克氏瓶斜面菌种制成菌悬液接入灭菌后的种子培养基，步骤A3中采用的种子发酵罐的容量为2吨，种子培养基在种子发酵罐中的装量体积比为60%-80%。

[0036] 步骤B1中优选采用的技术方案是，步骤B1中的搅拌转速为730转/分钟，采用发酵罐的容量为15吨，发酵培养基在发酵罐中的装量体积比为60%-80%。

[0037] 本发明所取得的实质性特点和显著的技术进步在于：

[0038] 本发明选用申请人筛选并提交保藏的具有高效解磷、解钾功能的一种胶冻样类芽孢杆菌（Paenibacillus mucilaginosus），利用生物工程发酵的方法制备微生物活菌制剂与氨基寡糖复配，并相应添加不同的微量元素，所生产的具有农药和肥料双重功能的无公害绿色生物制剂，在使用过程中，可减少用肥次数和使用成本，产生药肥互相促进、互相提高的增效作用，具有显者的环保价值和社会效益。

[0039] 本发明中所描述的微生物已于2013年1月31日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC）保藏，其保藏编号为CGMCCNo.7240。

具体实施方式

[0040] 以下结合实施例对本发明做进一步描述，但不应理解为对本发明的限定，本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据说明书所作出的等效技术手段替换，均不脱离本发明的保护范围。

[0041] 实施例1

[0042] 一种胶冻样类芽孢杆菌（Paenibacillus mucilaginosus），其保藏编号为CGMCC No.7240。

[0043] 利用胶冻样类芽孢杆菌生产复合微生物菌剂的方法，包括如下工艺步骤：

[0044] A、扩大培养

[0045] 将原始菌种经扩大培养制成生产菌种；

[0046] 原始菌种选用胶冻样类芽孢杆菌（Paenibacillus mucilaginosus），其保藏编号为CGMCC No.7240；

[0047] B、制备发酵液

[0048] B1、发酵

[0049] 按照体积比为生产菌种：发酵培养基=10%的比例将生产菌种接种到灭菌后的发酵培养基中发酵，发酵的条件为：温度25℃，压力0.03MPa，通风量控制条件是：发酵开始后3 3 3 3
为200M/hr、发酵4小时后为320M/hr、发酵8小时后为420M/hr、发酵12小时后为520M/
3
hr、发酵20小时后为600M/hr，发酵开始4-8小时后开始搅拌，直至发酵终点；

[0050] 发酵培养基由如下质量百分比的组份组成：

[0051] 淀粉0.3%，豆饼粉0.03%，碳酸钙0.05%，蔗糖0.08%，硫酸铵0.01%，磷酸氢二钾0.08%，硫酸镁0.08%，三氯化铁0.008%，酵母膏0.03%，氢氧化钾0.01%，消泡剂0.005%，余量为自来水，pH=7.2；

[0052] B2、检测及终点控制

[0053] 发酵中根据菌体生长状况定时取样、镜检，发酵至40±5小时后取样镜检，当95%的营养体形成芽孢，芽孢含量达到5亿个/毫升以上，终止发酵并制成发酵液；

[0054] C、复合微生物菌剂的配制

[0055] 按照步骤B中制备的发酵液为69.7kg、氨基寡糖为8kg、复合微量元素添加剂为0.3kg的比例，将上述组分混配制成复合微生物菌剂；其中复合微量元素添加剂由如下质量的组分组成：

[0056] 硼砂或硼酸10kg，硫酸锌或氯化锌5kg，钼酸铵3kg，硫酸锰2-8kg。

[0057] 所述的扩大培养包括：A1、斜面菌种的的制备；A2、克氏瓶斜面菌种的制备；A3、生产菌种的制备。

[0058] 所述的A1、斜面菌种的制备是：将原始菌种接入灭菌后试管斜面培养基，在25℃条件下恒温培养5天制成斜面菌种；所述的试管斜面培养基由如下组分组成：

[0059] 蔗糖5克，磷酸氢二钾0.2克，硫酸镁0.1克，氯化钠0.1克，碳酸钙0.5克，硫酸钙0.05克，酵母膏0.1克，水1000毫升，琼脂15克，pH=7.2。

[0060] 所述的A2、克氏瓶斜面菌种的制备是：将步骤A1中制备的斜面菌种接入灭菌后的克氏瓶斜面培养基；在25℃条件下恒温培养4天制成克氏瓶斜面菌种；克氏瓶斜面培养基由如下组份组成：

[0061] 葡萄糖0.5克，蛋白胨0.5克，磷酸氢二钾0.5克，硫酸铵0.1克，酵母膏0.3克，硫酸镁0.1克，水1000ml，琼脂15克，pH=7.2；将上述培养基按照每瓶60ml的量装入250ml克氏瓶中，灭菌、摆斜面制成克氏瓶斜面培养基。

[0062] A3、生产菌种的制备是：将步骤A2中制备的克氏瓶斜面菌种接入灭菌后的种子培养基，经通气培养制成生产菌种；培养条件如下：温度25℃，压力0.05MPa，通风量0-8小时3 3
50M/hr，8小时以后70M/hr，培养周期15小时；培养12小时后开始取样镜检观察生长状况，当菌体处于对数期生长期时，含菌量达到工艺要求，无杂菌，即可终止培养，所述的种子培养基由如下质量百分数的组分组成：

[0063] 淀粉0.2%，豆饼粉0.1%，碳酸钙0.05%，蔗糖0.05%，硫酸铵0.1%，消泡剂0.005%，余量为自来水，灭菌后pH=6.3。

[0064] 培养基的灭菌条件是：温度为121℃，时间为20-45分钟。

[0065] 将步骤A2中制备的克氏瓶斜面菌种制成菌悬液接入灭菌后的种子培养基，步骤A3中采用的种子发酵罐的容量为2吨，种子培养基在种子发酵罐中的装量体积比为60%。

[0066] 步骤B1中的搅拌转速为730转/分钟，采用发酵罐的容量为15吨，发酵培养基在发酵罐中的装量体积比为60%。

[0067] 实施例2

[0068] 利用胶冻样类芽孢杆菌生产复合微生物菌剂的方法，包括如下工艺步骤：

[0069] A、扩大培养

[0070] 将原始菌种经扩大培养制成生产菌种；

[0071] 原始菌种选用胶冻样类芽孢杆菌（Paenibacillus mucilaginosus），其保藏编号为CGMCC No.7240；

[0072] B、制备发酵液

[0073] B1、发酵

[0074] 按照体积比为生产菌种：发酵培养基=15%的比例将生产菌种接种到灭菌后的发酵培养基中发酵，发酵的条件为：温度32℃，压力0.7MPa，通风量控制条件是：发酵开始后3 3 3 3
为250M/hr、发酵4小时后为360M/hr、发酵8小时后为70M/hr、发酵12小时后为560M/
3
hr、发酵20小时后为630M/hr，发酵开始8小时后开始搅拌，直至发酵终点；

[0075] 发酵培养基由如下质量百分比的组份组成：

[0076] 淀粉1.5%，豆饼粉0.1%，碳酸钙0.2%，蔗糖0.5%，硫酸铵0.08%，磷酸氢二钾0.5%，硫酸镁0.5%，三氯化铁0.05%，酵母膏0.15%，氢氧化钾0.1%，消泡剂0.02%，余量为自来水，pH=7.2-7.4；

[0077] B2、检测及终点控制

[0078] 发酵中根据菌体生长状况定时取样、镜检，发酵至40±5小时后取样镜检，当95%的营养体形成芽孢，芽孢含量达到5亿个/毫升以上，终止发酵并制成发酵液；

[0079] C、复合微生物菌剂的配制

[0080] 按照步骤B中制备的发酵液为91.2kg、氨基寡糖为30kg、复合微量元素添加剂为0.8kg的比例，将上述组分混配制成复合微生物菌剂；其中复合微量元素添加剂由如下质量的组分组成：

[0081] 硼砂或硼酸20kg，硫酸锌或氯化锌15kg，钼酸铵12kg，硫酸锰8kg。

[0082] 所述的扩大培养包括：A1、斜面菌种的的制备；A2、克氏瓶斜面菌种的制备；A3、生产菌种的制备。

[0083] 所述的A1、斜面菌种的制备是：将原始菌种接入灭菌后试管斜面培养基，在32℃条件下恒温培养2天制成斜面菌种；所述的试管斜面培养基由如下质量的组分组成：

[0084] 蔗糖15克，磷酸氢二钾1克，硫酸镁0.5克，氯化钠0.5克，碳酸钙3克，硫酸钙0.3克，酵母膏1克，水1000毫升，琼脂22克，pH=7.2。

[0085] 所述的A2、克氏瓶斜面菌种的制备是：将步骤A1中制备的斜面菌种接入灭菌后的克氏瓶斜面培养基；在32℃条件下恒温培养4天制成克氏瓶斜面菌种；克氏瓶斜面培养基由如下质量的组份组成：

[0086] 葡萄糖2克，蛋白胨2克，磷酸氢二钾2克，硫酸铵0.5，酵母膏1.5克，硫酸镁0.5克，水1000ml，琼脂22克，pH=7.2；将上述培养基按照每瓶80ml的量装入250ml克氏瓶中，灭菌、摆斜面制成克氏瓶斜面培养基。

[0087] A3、生产菌种的制备是：将步骤A2中制备的克氏瓶斜面菌种接入灭菌后的种子培养基，经通气培养制成生产菌种；培养条件如下：温度32℃，压力0.05MPa，通风量0-8小时3 3
70M/hr，8小时以后90M/hr，培养周期20小时；培养12小时后开始取样镜检观察生长状况，当菌体处于对数期生长期时，含菌量达到工艺要求，无杂菌，即可终止培养；

[0088] 培养基的灭菌条件是：温度为121℃，时间为20-45分钟。

[0089] 将步骤A2中制备的克氏瓶斜面菌种制成菌悬液接入灭菌后的种子培养基，步骤A3中采用的种子发酵罐的容量为2吨，种子培养基在种子发酵罐中的装量体积比为80%。

[0090] 步骤B1中的搅拌转速为730转/分钟，采用发酵罐的容量为15吨，发酵培养基在发酵罐中的装量体积比为80%。

[0091] 其余内容同实施例1。

[0092] 实施例3

[0093] 利用胶冻样类芽孢杆菌生产复合微生物菌剂的方法，包括如下工艺步骤：

[0094] A、扩大培养

[0095] 将原始菌种经扩大培养制成生产菌种；

[0096] 原始菌种选用胶冻样类芽孢杆菌（Paenibacillus mucilaginosus），其保藏编号为CGMCC No.7240；

[0097] B、制备发酵液

[0098] B1、发酵

[0099] 按照体积比为生产菌种：发酵培养基=12%的比例将生产菌种接种到灭菌后的发酵培养基中发酵，发酵的条件为：温度30℃，压力0.2MPa，通风量控制条件是：发酵开始后3 3 3 3
为230M/hr、发酵4小时后为350M/hr、发酵8小时后为450M/hr、发酵12小时后为550M/
3
hr、发酵20小时后为620M/hr，发酵开始6小时后开始搅拌，直至发酵终点；

[0100] 发酵培养基由如下质量百分比的组份组成：

[0101] 淀粉0.7%，豆饼粉0.07%，碳酸钙0.1%，蔗糖0.2%，硫酸铵0.055%，磷酸氢二钾0.2%，硫酸镁0.2%，三氯化铁0.03%，酵母膏0.08%，氢氧化钾0.04%，消泡剂0.015%，余量为自来水，pH=7.2-7.4；

[0102] B2、检测及终点控制

[0103] 发酵中根据菌体生长状况定时取样、镜检，发酵至40±5小时后取样镜检，当95%的营养体形成芽孢，芽孢含量达到5亿个/毫升以上，终止发酵并制成发酵液；

[0104] C、复合微生物菌剂的配制

[0105] 按照步骤B中制备的发酵液为80kg、氨基寡糖为25kg、复合微量元素添加剂为0.5kg的比例，将上述组分混配制成复合微生物菌剂；其中复合微量元素添加剂由如下单位质量的组分组成：

[0106] 硼砂或硼酸15kg，硫酸锌或氯化锌10kg，钼酸铵8kg，硫酸锰5kg。

[0107] 所述的扩大培养包括：A1、斜面菌种的的制备；A2、克氏瓶斜面菌种的制备；A3、生产菌种的制备。

[0108] 所述的A1、斜面菌种的制备是：将原始菌种接入灭菌后试管斜面培养基，在25-32℃条件下恒温培养2-5天制成斜面菌种；所述的试管斜面培养基由如下质量的组分组成：

[0109] 蔗糖10克，磷酸氢二钾0.6克，硫酸镁0.3克，氯化钠0.3克，碳酸钙1克，硫酸钙0.2克，酵母膏0.5克，水1000毫升，琼脂18克，pH=7.2。

[0110] 所述的A2、克氏瓶斜面菌种的制备是：将步骤A1中制备的斜面菌种接入灭菌后的克氏瓶斜面培养基；在30℃条件下恒温培养4-6天制成克氏瓶斜面菌种；克氏瓶斜面培养基由如下质量的组份组成：

[0111] 葡萄糖1.2克，蛋白胨1.2克，磷酸氢二钾1.2克，硫酸铵0.3克，酵母膏1克，硫酸镁0.3克，水1000ml，琼脂20克，pH=7.2；将上述培养基按照每瓶80ml的量装入250ml克氏瓶中，灭菌、摆斜面制成克氏瓶斜面培养基。

[0112] A3、生产菌种的制备是：将步骤A2中制备的克氏瓶斜面菌种接入灭菌后的种子培养基，经通气培养制成生产菌种；培养条件如下：温度28℃，压力0.05MPa，通风量0-8小时3 3
60M/hr，8小时以后80M/hr，培养周期18小时；培养12小时后开始取样镜检观察生长状况，当菌体处于对数期生长期时，含菌量达到工艺要求，无杂菌，即可终止培养；

[0113] 培养基的灭菌条件是：温度为121℃，时间为20-45分钟。

[0114] 将步骤A2中制备的克氏瓶斜面菌种制成菌悬液接入灭菌后的种子培养基，步骤A3中采用的种子发酵罐的容量为2吨，种子培养基在种子发酵罐中的装量体积比为70%。

[0115] 步骤B1中的搅拌转速为730转/分钟，采用发酵罐的容量为15吨，发酵培养基在发酵罐中的装量体积比为70%。

[0116] 采用实施例1-3中所制备的复合微生物菌剂进行了对花生增产效果和花生青枯病防治效果试验，结果如下：

[0117] 1、试验地点：保定市清苑县大庄乡

[0118] 2、花生品种：鲁花10号。

[0119] 3、试验设计：设施用胶冻样类芽孢杆菌微生物活菌制剂（以下简称HM8841菌剂）、氨基寡糖和复合微生物菌剂（以下简称复合菌剂）3个试验组，以不施用上述制剂为对照组，每试验组设三次重复。田间管理和其它用肥均按常规方法进行。

[0120] 4、施肥方法：播种前将全部制剂用量的2/3与底肥混合后施用，其余1/3分别在盛花期、幼果初期、果实膨大期稀释100倍均匀喷施。

[0121] 5、施肥用量：按亩（666.7m2）用量计，每亩施用氨基寡糖1kg，HM8841菌剂10kg，复合菌剂15kg，对照不施用上述三种制剂。

[0122] 6、试验结果：由表1、表2的试验结果表明：施用复合菌剂效果最好，增产效果显著，比对照分别增产41.92%、39.23、45.38%，比单一使用氨基寡糖和HM8841菌剂分别增产31.54%和25%、28.85%和22.31%、35.00%和28.46%，增产效果主要表现在花生双成果和单成果数量增加，双秕果和单秕果数量减少，表现为果实色白、鲜亮、均一，果仁饱满，商品性好；对花生青枯病控制效果也十分显著，比对照病株率降低100%，死亡率降低96.43%、
95.00%和97.86%，比单一使用氨基寡糖和微生物菌剂病株率和死亡率都有明显的降低，花生植株的抗逆性增加，叶片光合作用的功能期延长，根系发达，增强了抵抗力。

[0123] 表1复合菌剂对花生试验的调查结果

[0124]

[0125] 表2复合菌剂对花生青枯病控制效果

[0126]

[0127] 施用复合菌剂后，在增产效果和病情控制方面，比单一施用二种制剂的任何一种都表现出明显的增效作用。一方面由于药肥合用减少了使用成本和用工成本，显者地提高了经济效益，另一方面由于药肥制剂是生物源的绿色无公害制剂，具有显者的环保价值和社会效益。

[0128] 采用实施例1-3中所制备的复合微生物菌剂进行了对烟草进行了试验，结果如下：

[0129] 烟草是典型的喜钾作物，本发明的复合微生物菌剂对烟草的生长发育有明显的促进作用。施入复合微生物菌剂的烟苗比对照缓苗时间缩短两天左右。当进入团棵期之后，烟的长势，特别是叶片的长度开始与对照有了明显的差异（见表3A、3B）。当烟草进入旺长期，施入复合微生物菌剂的烟苗与对照在长势上的差距更加明显（见表4A、4B）。这种差异不仅表现在地上部分，地下部分的差异也很明显（见表5）。

[0130] 烟苗进入中后期生长阶段，随着气温的升高，菌剂中的有益菌在土壤中繁殖的速度加快，解钾、解磷能力进一步增强，施用复合微生物菌剂的烟株中上部叶片面积比对照明显扩大，表6-1的实验表明，施复合微生物菌剂的烟草植株上部叶片面积分别比对照增加2 2 2 2 2 2
41.6cm、42.3cm、43.5cm ；中部叶片面积增加18.88cm、19.2cm、19.87cm ；下部叶片面积
2 2 2
增加3.56cm、3.41cm、3.79cm ；中上部叶片面积增加幅度明显比下部叶片大。这就奠定了烟草丰产的基础。

[0131] 表3A复合微生物菌剂对烟草团棵期影响

[0132]

[0133] 表3B复合微生物菌剂对烟草团棵期影响结果

[0134]

[0135] 表4A复合微生物菌剂对旺长期烟苗影响

[0136]

[0137] 表4B复合微生物菌剂对旺长期烟苗影响结果

[0138]

[0139] 表5复合微生物菌剂对烟苗地下部分的影响

[0140]

[0141] 表6-1复合微生物菌剂对烟株营养体的影响

[0142]项目 株高（cm） 茎粗（cm） 上部叶（cm） 中部叶（cm） 下部叶（cm）复合菌剂实施例1 128.7 2.62 32.6×16.7 55.8×33.2 46.1×30.2
CK 126.1 2.60 31.4×15.3 54.7×32.8 45.0×29.6
比CK增加 2.6 0.02 1.2×1.4 1.10×0.4 1.10×0.6
单叶面积增加 41.6cm2 18.88cm2 3.56cm2

[0143] 表6-2复合微生物菌剂对烟株营养体的影响

[0144]项目 株高（cm） 茎粗（cm） 上部叶（cm） 中部叶（cm） 下部叶（cm）复合菌剂实施例2 129.8 2.64 33.3×16.3 54.9×34.7 46.9×30.0
CK 125.7 2.61 31.1×14.9 53.3×33.8 45.7×29.3
比CK增加 4.1 0.03 2.2×1.4 1.6×0.9 1.2×0.7
单叶面积增加 42.3cm2 19.2cm2 3.41cm2

[0145] 表6-3复合微生物菌剂对烟株营养体的影响

[0146]项目 株高（cm） 茎粗（cm） 上部叶（cm） 中部叶（cm） 下部叶（cm）复合菌剂实施例3 128.9 2.66 34.7×17.2 56.3×34.7 47.1×31.2
CK 124.3 2.59 32.1×15.7 54.5×33.4 44.9×30.1
比CK增加 4.6 0.07 2.6×1.5 1.8×1.3 2.2×1.1
单叶面积增加 43.5cm2 19.87cm2 3.79cm2

[0147] 为了验证本发明的应用效果，申请人先后在全国40多个县市30多种作物上进行了试验示范（表7），统计表明，采用本发明的复合微生物菌剂应用于粮食作物一般增产13%左右，应用于经济作物增产10%—25%，应用于瓜果蔬菜增产20-30%，增产效果和经济效益十分显著。

[0148] 表7复合微生物菌剂在不同种类作物上的增产效果

[0149]