一株枯草芽孢杆菌及其在生产抗菌肽中的应用

摘要

本发明公开了一株枯草芽孢杆菌及其在生产抗菌肽中的应用。本发明提供的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BF168，保藏编号为CGMCC No.7200。本发明还保护枯草芽孢杆菌BF168在生产sublancin抗菌肽或抗菌物质中的应用。本发明的方法具体有如下优点：（1）以玉米和大豆加工品等粮食产品为主要原料，代替了实验室中化学试剂级别的原料，降低了生产成本；（2）可以实现sublancin抗菌肽或抗菌物质的产业化生产；（3）可以提高sublancin抗菌肽或抗菌物质的生产效率，发酵液中的sublancin抗菌肽的含量可达80-150mg/L；（4）产量高、成本低、产物纯度高，生产过程中对操作人员要求低、工艺简单，易于推广。

权利要求

1.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BF168，其保藏编号为CGMCC No.7200。

2.权利要求1所述枯草芽孢杆菌BF168在生产sublancin抗菌肽中的应用。

3.一种生产sublancin抗菌肽的方法，包括如下步骤：发酵权利要求1所述枯草芽孢杆菌BF168，得到sublancin抗菌肽。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述发酵采用的培养基由水和溶质组成；

每立方米培养基中含如下溶质：玉米面25-35kg，豆粕15-20kg，蛋白胨15-25kg，葡萄糖

1-5kg，KH2PO42-5kg，硫酸铵3-8kg。

5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述发酵的参数如下：发酵时间为32小时，搅拌速度为150r/min，温度为36-37℃，压力为0.02-0.04Mpa；发酵过程中，前31个小3

时pH为6.5，之后1个小时pH为6.0；发酵过程中，前8个小时通气量为500m/h，之后243

个小时通气量为750m/h。

6.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述方法中，在所述发酵之前还包括种子培养的步骤。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述种子培养采用的培养基如下：将

25-35g玉米面、15-20g豆粕、10-15g蛋白胨、10-20g葡萄糖、2-5g KH2PO4和1-1.5g硫酸铵溶于水并用水定容至1L。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述种子培养的参数如下：培养时间为12小时，搅拌速度为80-90r/min，温度为36-37℃，pH为7.0-7.5，压力为0.04Mpa；培养过程

3 3

中，前4个小时通气量为13m/h，之后4个小时通气量为20m/h，最后4个小时通气量为3

25m/h。

9.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述方法中，在所述发酵之后还包括将所述发酵的发酵产物进行纯化的步骤；所述纯化依次包括如下步骤：(1)陶瓷膜过滤；(2)蒸发干燥；(3)喷雾干燥。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：所述陶瓷膜过滤的参数如下：陶瓷膜孔径为50nm，进膜压力为0.5-0.7MPa，出膜压力为0.2-0.4MPa，进膜温度≤43℃，进料温度≤39℃；所述蒸发干燥的参数如下：一效温度68-78℃，二效温度49-59℃，杀菌温度

86℃-94℃；所述喷雾干燥的参数如下：进风温度160-185℃，塔内温度95-115℃，塔内压力-0.05至-0.1MPa。

说明书

一株枯草芽孢杆菌及其在生产抗菌肽中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一株枯草芽孢杆菌及其在生产抗菌肽中的应用。

背景技术

[0002] Sublancin抗菌肽是枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）产生一种具有抗菌活性的内源性多肽，主要通过核糖体途径合成，主要通过前导序列进行转录后修饰和转运。

[0003] Sublancin抗菌肽的分子量为3877U，为无色结晶和白色结晶性粉末，易溶于水。Sublancin抗菌肽含有二硫键，具有较好的稳定性。

[0004] Sublancin抗菌肽对革兰氏阳性菌具有较强的抑制和杀灭作用，可应用于食品保鲜、抗感染以及环境消毒。目前，国内外尚未有可实现工业化生产的sublancin抗菌肽的生产方法。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一株枯草芽孢杆菌及其在生产抗菌肽中的应用。

[0006] 本发明提供的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BF168，已于2013年01月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏编号为CGMCC No.7200。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BF168CGMCC No.7200简称枯草芽孢杆菌BF168。

[0007] 本发明还保护枯草芽孢杆菌BF168在生产sublancin抗菌肽或抗菌物质中的应用。

[0008] 本发明还保护一种生产sublancin抗菌肽或抗菌物质的方法，包括如下步骤：发酵枯草芽孢杆菌BF168，得到sublancin抗菌肽或抗菌物质。

[0009] 所述发酵采用的培养基由水和溶质组成；每立方米培养基中含如下溶质：玉米面25-35kg（如25-30kg或30-35kg），豆粕15-20kg（如15-18kg或18-20kg），蛋白胨15-25kg（如15-20kg或20-25kg），葡萄糖1-5kg（如1-3kg或3-5kg），KH2PO42-5kg（如2-3kg或
3-5kg），硫酸铵3-8kg（如3-5kg或5-8kg）。

[0010] 所述发酵的参数如下：发酵时间为32小时，搅拌速度为150r/min，温度为36-37℃，压力为0.02-0.04Mpa；发酵过程中，前31个小时pH为6.5，之后1个小时pH为
3 3
6.0；发酵过程中，前8个小时通气量为500m/h，之后24个小时通气量为750m/h。

[0011] 所述方法中，在所述发酵之前还包括种子培养的步骤。

[0012] 所述种子培养采用的培养基如下：将25-35g（如25-30g或30-35g）玉米面、15-20g（如15-18g或18-20g）豆粕、10-15g（如10-12.5g或12.5-15g）蛋白胨、10-20g（如10-15g或15-20g）葡萄糖、2-5g（如2-3g或3-5g）KH2PO4和1-1.5g（如1-1.25g或1.25-1.5g）硫酸铵溶于水并用水定容至1L。

[0013] 所述种子培养的参数如下：培养时间为12小时，搅拌速度为80-90r/min，温度为3
36-37℃，pH为7.0-7.5，压力为0.04Mpa；发酵过程中，前4个小时通气量为13m/h，之后4
3 3
个小时通气量为20m/h，最后4个小时通气量为25m/h。所述种子培养中，可以进行一次转接，并采用相同条件培养一次。

[0014] 所述方法中，在所述发酵之后还包括将所述发酵得到的发酵产物进行纯化的步骤；所述纯化依次包括如下步骤：（1）陶瓷膜过滤；（2）蒸发干燥；（3）喷雾干燥。

[0015] 所述陶瓷膜过滤的参数如下：陶瓷膜孔径为50nm，进膜压力为0.5-0.7MPa（如0.5-0.6MPa或0.6-0.7MPa），出膜压力为0.2-0.4MPa（如0.2-0.3MPa或0.3-0.4MPa），进膜温度≤43℃（如32-43℃、32-40℃或40-43℃），进料温度≤39℃（如30-39℃、30-35℃或35-39℃）。

[0016] 所述蒸发干燥的参数如下：一效温度68-78℃（如68-75℃或75-78℃），二效温度49-59℃（如49-54℃或54-59℃），杀菌温度86℃-94℃（如86-90℃或90-94℃）。蒸发干燥时，可进行两次处理，第一次处理2个小时，第二次处理1.5个小时。

[0017] 所述喷雾干燥的参数如下：进风温度160-185℃（如160-175℃或175-185℃）；塔内温度95-115℃（如95-105℃或105-115℃）；塔内压力-0.05至-0.1MPa（如-0.05至-0.0751MPa或-0.0751MPa至-0.1MPa）。

[0018] 所述种子培养的初始时刻，将枯草芽孢杆菌BF168的菌液接种至所述种子培养基（所述菌液与所述种子培养基的体积比具体可为1：100）。

[0019] 所述枯草芽孢杆菌BF168的菌液的制备方法具体如下：（1）取菌落接种于LB液体培养基、37℃、220rpm振荡培养30小时；（2）将步骤（1）得到的菌液按1：100的体积比接种至所述种子培养基，37℃、220rpm振荡培养30小时。

[0020] 将所述种子培养得到的菌液接种至所述发酵培养基时，所述菌液与所述发酵培养基的体积比可为1:20。

[0021] 所述抗菌物质具体可为抗细菌的物质。所述细菌可为金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌、蜡样芽孢杆菌、鳗弧菌或魏氏梭菌。

[0022] 本发明的方法具体有如下优点：（1）以玉米和大豆加工品等粮食产品为主要原料，代替了实验室中化学试剂级别的原料，降低了生产成本；（2）可以实现sublancin抗菌肽或抗菌物质的产业化生产；（3）可以提高sublancin抗菌肽或抗菌物质的生产效率，发酵液中的sublancin抗菌肽的含量可达80-150mg/L；（4）产量高、成本低、产物纯度高，生产过程中对操作人员要求低、工艺简单，易于推广。

附图说明

[0023] 图1为标准曲线图。

具体实施方式

[0024] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

[0025] LB液体培养基：将10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和10g NaCl溶于水并用水定容至1L，自然pH。LB固体培养基：将10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10g NaCl和15g琼脂溶于水并用水定容至1L，自然pH。

[0026] 载 体 pBluescriptII SK(+)，其 核 苷 酸 序 列 见 GENBANK ACCESSION NO.X52328.1。 载 体 pGJ103：参 考 文 献：Ming-Ming,Y.,Z.Wei-Wei,Z.Xi-Feng,and C.Pei-LinConstruction and characterization of a novel maltose inducible expressionvector in Bacillus subtilis[J].Biotechnol Lett..2006.28:1713-8。枯草芽孢杆菌1A747：购自Bacillus Genetic Stock Centre of the Ohio State University(Columbus,OH,USA)，序列号为1A747。

[0027] 实施例1、枯草芽孢杆菌BF168的获得和保藏

[0028] 一、枯草芽孢杆菌BF168的获得

[0029] 1、将载体pBluescriptII SK(+)作为骨架载体，在其EcoRI和BamHI酶切位点之间正向插入sumo蛋白酶的表达操纵子（序列表的序列2所示的双链DNA分子），在其BamHI和SacI酶切位点之间正向插入酿酒酵母小分子泛素样蛋白与sublancin抗菌肽的融合蛋白表达操纵子（序列表的序列3所示的双链DNA分子，其中sublancin抗菌肽基因如序列表的序列1所示），得到重组质粒D1778-1。

[0030] 2、合成序列表的序列4所示的双链DNA分子（枯草芽孢杆菌p43启动子），插入载体pGJ103，得到重组质粒pGJ284。

[0031] 3、用限制性内切酶EcoR I与Sac I双酶切重组质粒D1778-1，回收约1485bp的片段。

[0032] 4、用限制性内切酶EcoR I与Sac I双酶切重组质粒pGJ284，回收约752bp的片段。

[0033] 5、将步骤3回收的片段和步骤4回收的片段连接，得到重组质粒pNF11。

[0034] 6、将重组质粒pNF11电击（2500V、5ms）转化枯草芽孢杆菌1A747的感受态细胞，然后立即转移至预冷的LBSPG培养基（溶剂为pH7.2、50mM的PBS缓冲液，溶质及其浓度为：胰蛋白胨0.1g/100mL,酵母提取物0.5g/100mL,蔗糖0.5g/100mL），37℃、200rpm恢复培养
1小时，然后4500rpm离心并收集菌体，涂布于含有5μg/ml氯霉素的LB培养基平板，37℃培养至单菌落出现。

[0035] 7、挑取单菌落，扩大培养后提取质粒，采用F1和R1组成的引物对进行PCR鉴定，如果显示1300bp的特异条带，该菌为重组枯草芽孢杆菌。

[0036] 挑取单菌落，扩大培养后提取质粒，采用F1和R1组成的引物对进行PCR鉴定，如果显示1300bp的特异条带，该菌为重组枯草芽孢杆菌。

[0037] F1：5’-CGTTTGCGCTTGTTCCGGAAC-3’；

[0038] R1：5’-CTGCCGGGCCTGCAGAAATAAC-3’。

[0039] 共得到4株重组枯草芽孢杆菌。

[0040] 8、分别将步骤7得到的4株枯草芽孢杆菌进行如下鉴定：

[0041] 将单菌落接种到25ml LB液体培养基，32℃、200rpm振荡培养12小时（此时OD600nm为2-4）；加5ml30g/100mL麦芽糖水溶液，32℃、250rpm振荡培养36小时；调整pH至8.5，25℃、200rpm振荡培养12小时；10000rpm离心10分钟，收集上清液。

[0042] 用高效液相色谱法检测上清液中的Sublancin抗菌肽浓度。高效液相色谱仪为Agilent1260,色谱柱为ZORBAX300SB-C8（4.6×150mm，5μm），流速为1ml/min，检测波长为280nm，柱温为25℃。洗脱液由溶液A和溶液B组成。溶液A为0.1%三氟乙酸水溶液。溶液B为含80%（体积比）乙腈和0.085%三氟乙酸的水溶液。洗脱过程：第0-1min，溶液A占洗脱液的体积比为80%；第1-15min，溶液A占洗脱液的体积比由80%线性下降至47%；第
15-15.01min,溶液B占洗脱液的体积比由53%线性上升至100%；第15.01-17min,溶液B占洗脱液的体积比为100%；第17-17.01min，溶液A占洗脱液的体积比由0%线性上升至80%。
Sublancin抗菌肽标准品的出峰位置为12.5min-14min保留时间，峰面积与Sublancin抗菌肽浓度的标准曲线见图1，标准曲线方程为y=47.614x+7.1974（x为标准品的质量、单位为ng，y为平均峰面积）。收集目标峰并通过标准曲线方程计算上清液中的Sublancin抗菌肽浓度。

[0043] 4株枯草芽孢杆菌得到的上清液中的Sublancin抗菌肽浓度分别为2mg/L、2.3mg/L、2.5mg/L和1.8mg/L。

[0044] 将产量最高的一株菌命名为枯草芽孢杆菌BF168。

[0045] 二、枯草芽孢杆菌BF168的保藏

[0046] 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BF168已于2013年01月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏编号为CGMCC No.7200。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BF168CGMCC No.7200简称枯草芽孢杆菌BF168。

[0047] 实施例2、应用枯草芽孢杆菌BF168生产Sublancin抗菌肽或抗菌物质

[0048] 种子培养基：将30g玉米面、18g豆粕、12.5g蛋白胨、15g葡萄糖、3g KH2PO4和1.25g硫酸铵溶于水并用水定容至1L。

[0049] 发酵罐培养基：30kg玉米面、18kg豆粕、20kg蛋白胨、3kg葡萄糖、3kg KH2PO4和5kg硫酸铵溶于水并用水定容至1立方米。

[0050] 一、菌种活化

[0051] 从-70℃冰箱取出冻干保存的枯草芽孢杆菌BF168，接种于LB斜面培养基上，37℃培养30小时。

[0052] 二、菌种扩大培养

[0053] 1、从步骤一的斜面上取菌落接种于LB液体培养基（每个250ml的锥形瓶装有30mlLB液体培养基）、37℃、220rpm振荡培养30小时。

[0054] 2、将步骤1得到的菌液按1：100的体积比接种至种子培养基（每个500ml的锥形瓶装有50ml培养基），37℃、220rpm振荡培养30小时。

[0055] 三、种子罐培养

[0056] 种子罐KMYR09040-30L和种子罐KMYR09040-3M3：浙江科美制药机械有限公司。

[0057] 1、将步骤二得到的菌液按1：100的体积比接种至种子罐KMYR09040-30L（30L种子罐，装有15L种子培养基），按照表1的参数进行培养。

[0058] 2、将步骤1得到的菌液按1：100的体积比接种至种子罐KMYR09040-3M3（3立方米种子罐，装有1.5立方米种子培养基），按照表1的参数进行培养。

[0059] 表1 培养参数

[0060]

[0061] 四、发酵罐培养

[0062] 发酵罐KMYR09047：浙江科美制药机械有限公司。

[0063] 将步骤三得到的种子液按照1:20的体积比接种于发酵罐KMYR09047（30立方米发酵罐，装有21立方米发酵培养基）并进行发酵，按照表2的参数进行培养。

[0064] 完成发酵后，取样，10000rpm离心10分钟，收集上清液，按照实施例1的步骤8中的方法检测Sublancin抗菌肽浓度。Sublancin抗菌肽浓度为150mg/L。

[0065] 表2 培养参数

[0066]

[0067] 五、从发酵液中纯化Sublancin抗菌肽

[0068] 1、发酵液的压滤

[0069] 将步骤四得到的发酵体系通过发酵罐自身保留的压力泵入50立方米的贮存罐中，通过板框压滤方式滤去菌体及残留培养物，将滤液（命名为滤液甲）泵入另一个50立方米的贮存罐中。

[0070] 2、发酵液的陶瓷膜过滤

[0071] 原理：膜分离技术是在分子水平上不同粒径分子的混合物在通过半透膜时，实现选择性分离的技术，半透膜又称分离膜或滤膜，膜壁布满小孔，根据孔径大小可以分为：微滤膜（MF）、超滤膜（UF）、纳滤膜（NF）、反渗透膜（RO）等，膜分离都采用错流过滤方式。膜分离技术由于具有常温下操作、无相态变化、高效节能、在生产过程中不产生污染等特点，因此在饮用水净化、工业用水处理，食品、饮料用水净化、除菌，生物活性物质回收、精制等方面得到广泛应用，并迅速推广到纺织、化工、电力、食品、冶金、石油、机械、生物、制药、发酵等各个领域。

[0072] 陶瓷膜过滤器F01：上海朗极化工科技有限公司。

[0073] 将步骤1得到的滤液甲通过空气压缩机的压力导入陶瓷膜过滤器F01进行膜过滤，收集滤液（将其命名为滤液乙）。操作参数：进膜压力0.6MPa，出膜压力0.3MPa，进膜温度40℃，进料温度35℃；陶瓷膜孔径为50nm（能除热原、除盐及除分子量低于1000D的小分子物质）。

[0074] 3、双效降膜蒸发器蒸发

[0075] 原理：物料经分配器被均匀的分配到各蒸发器管内，物料在重力和自蒸发形式的二次蒸汽的作用下形成螺旋形膜状自上而下流动，同时物料薄膜与列管外壁蒸汽发生热量交换，使物料中的水份受热蒸发，稳定的温差和传热面积，形成稳定的水份蒸发量，被蒸发的水份所形成的二次蒸汽被多次利用，最大限度的利用热能，降低蒸汽消耗，形成多次蒸发。其作用是去除发酵液中约80%的水分，提高sublancin抗菌肽在产品中的含量。

[0076] 双效降膜蒸发器TNJM02-2000-C：黑龙江省金达市金路机械制造有限公司。

[0077] 将步骤2得到的滤液乙导入双效降膜蒸发器TNJM02-2000-C。操作参数：进料量3
5m/h；一效温度75℃，二效温度54℃，杀菌温度90℃；每次产品重复蒸发2次，第一次处理时间2个小时，第二次处理时间1.5个小时。

[0078] 4、喷雾干燥

[0079] 原理：在干燥室中将含有sublancin抗菌肽的滤液经雾化后，在与热空气的接触中，水分迅速汽化，即得到干燥产品；该方法能直接使含有sublancin抗菌肽的滤液干燥成粉状，sublancin抗菌肽对热稳定性较强是喷雾干燥得到应用的基础。

[0080] 压力喷雾干燥机（YPG-100型）：常州市金陵喷雾干燥工程有限公司。

[0081] 将步骤3得到的产物采用压力喷雾干燥机进行喷雾干燥，得到粉末状产物。操作参数：进风温度175℃，塔内温度105℃，塔内压力-0.0751MPa。

[0082] 将1千克粉末状产物产物溶于1L水，按照实施例1的步骤8中的方法检测-4Sublancin抗菌肽浓度。产物中Sublancin抗菌肽的纯度为105mg/1kg=1.05×10 。

[0083] 六、Sublancin抗菌肽的抗菌活性实验

[0084] 以金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌、蜡样芽孢杆菌、鳗弧菌、魏氏梭菌为指示菌。将sublancin抗菌肽按照倍比稀释接种到96孔板（每一列抗菌肽浓度相同），然后将指示菌稀释OD值为0.01时，接种到96孔板，测定Sublancin抗菌肽的最小抑菌浓度。结果见表3-4（以有效成分计，即加入的步骤五得到的粉末状产物的质量乘以1.05×10 ）。

[0085] 结果发现，sublancin抗菌肽对各种金黄色葡萄球菌均有较强的杀菌作用，对一些金黄色葡萄球菌耐药菌株，如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ATCC29213、ATCC25923等也有良好的杀菌作用。除此之外，sublancin对嗜水气单胞菌、鳗弧菌等水产常见致病菌，对魏氏梭菌等猪和家禽常见致病菌也有良好的杀菌作用。

[0086]

[0087]

[0088] 表3 sublancin抗菌肽对病原菌的最小抑菌浓度

[0089] CMCC网址：http://www.cmccb.org.cn/index.php。

[0090] CVCC网址：http://www.cvcc.org.cn/。

[0091] ATCC网址：http://www.atcc.org/。

[0092] 实施例3、应用枯草芽孢杆菌BF168生产Sublancin抗菌肽

[0093] 种子培养基：将35g玉米面、20g豆粕、15g蛋白胨、20g葡萄糖、5g KH2PO4和1.5g硫酸铵溶于水并用水定容至1L。

[0094] 发酵罐培养基：35kg玉米面、20kg豆粕、25kg蛋白胨、5kg葡萄糖、5kg KH2PO4和8kg硫酸铵溶于水并用水定容至1立方米。

[0095] 一、菌种活化

[0096] 同实施例2的步骤一。

[0097] 二、菌种扩大培养

[0098] 同实施例2的步骤二。

[0099] 三、种子罐培养

[0100] 同实施例2的步骤三。

[0101] 四、发酵罐培养

[0102] 同实施例2的步骤四。

[0103] Sublancin抗菌肽浓度为80mg/L。

[0104] 五、从发酵液中纯化Sublancin抗菌肽

[0105] 1、发酵液的压滤

[0106] 同实施例2的步骤五的1。

[0107] 2、发酵液的陶瓷膜过滤

[0108] 操作参数：进膜压力0.7MPa，出膜压力0.4MPa，进膜温度43℃，进料温度39℃；陶瓷膜孔径为50nm。

[0109] 其它均同实施例2的步骤五的2。

[0110] 3、双效降膜蒸发器蒸发

[0111] 操作参数：进料量5m3/h；一效温度78℃，二效温度59℃，杀菌温度94℃；每次产品重复蒸发2次，第一次处理时间2个小时，第二次处理时间个1.5小时。

[0112] 其它均同实施例2的步骤五的3。

[0113] 4、喷雾干燥

[0114] 操作参数：进风温度185℃，塔内温度115℃，塔内压力-0.05MPa。

[0115] 将1千克粉末状产物产物溶于1L水，按照实施例1的步骤8中的方法检测-4Sublancin抗菌肽浓度。产物中Sublancin抗菌肽的纯度为105mg/1kg=1.25×10 。

[0116] 六、Sublancin抗菌肽的抗菌活性实验

[0117] 结果见表4（以有效成分计，即加入的步骤五得到的粉末状产物的质量乘以-41.25×10 ）。

[0118] 表4 sublancin抗菌肽对病原菌的最小抑菌浓度

[0119]

[0120] 实施例4、应用枯草芽孢杆菌BF168生产Sublancin抗菌肽

[0121] 种子培养基：将25g玉米面、15g豆粕、10g蛋白胨、10g葡萄糖、2g KH2PO4和1g硫酸铵溶于水并用水定容至1L。

[0122] 发酵罐培养基：25kg玉米面、15kg豆粕、15kg蛋白胨、1kg葡萄糖、2kg KH2PO4和3kg硫酸铵溶于水并用水定容至1立方米。

[0123] 一、菌种活化

[0124] 同实施例2的步骤一。

[0125] 二、菌种扩大培养

[0126] 同实施例2的步骤二。

[0127] 三、种子罐培养

[0128] 同实施例2的步骤三。

[0129] 四、发酵罐培养

[0130] 同实施例2的步骤四。

[0131] Sublancin抗菌肽浓度为150mg/L。

[0132] 五、从发酵液中纯化Sublancin抗菌肽

[0133] 1、发酵液的压滤

[0134] 同实施例2的步骤五的1。

[0135] 2、发酵液的陶瓷膜过滤

[0136] 操作参数：进膜压力0.5MPa，出膜压力0.2MPa，进膜温度32℃，进料温度30℃；陶瓷膜孔径为50nm。

[0137] 其它均同实施例2的步骤五的2。

[0138] 3、双效降膜蒸发器蒸发

[0139] 操作参数：进料量5m3/h；一效温度68℃，二效温度49℃，杀菌温度86℃；每次产品重复蒸发2次，第一次处理时间2个小时，第二次处理时间1.5个小时。

[0140] 其它均同实施例2的步骤五的3。

[0141] 4、喷雾干燥

[0142] 操作参数：进风温度160℃，塔内温度95℃，塔内压力-0.1MPa。

[0143] 将1千克粉末状产物产物溶于1L水，按照实施例1的步骤8中的方法检测-4Sublancin抗菌肽浓度。产物中Sublancin抗菌肽的纯度为105mg/1kg=1.35×10 。

[0144] 六、Sublancin抗菌肽的抗菌活性实验

[0145] 结果见见表5（以有效成分计，即加入的步骤五得到的粉末状产物的质量乘以-41.35×10 ）。

[0146] 表5 sublancin抗菌肽对病原菌的最小抑菌浓度

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