新型麦芽寡糖基海藻糖合成酶、酶基因、含该基因的重组表达载体及重组工程菌及酶的制备

摘要

本发明公开了一种麦芽寡糖基海藻糖合成酶、该酶的基因、含有该基因的重组表达载体及重组工程菌及酶的制备方法，所述合成酶具有如SEQIDNO:1所示的氨基酸序列，可以由含有SEQIDNO:2所示的核苷酸序列的基因或该基因的突变体或者它们的互补序列表达而得。本发明合成酶MTSase具有较高的最适反应温度和热稳定性，具有较低的最适pH，降低了染菌风险，提高了生产的稳定性，显著提高了其和普鲁兰酶联合作用还原性淀粉水解物生产海藻糖的效率，显著提高了海藻糖生产效率。本发明得到表达酶的基因，可通过基因重组技术生产MTSase，酶表达量高，制备效率显著提高，成本显著降低，降低了海藻糖的生产成本。

权利要求

1.一种麦芽寡糖基海藻糖合成酶，其特征是：其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的麦芽寡糖基海藻糖合成酶，其特征是：具有以下特性：（1）最适作用温度

当pH5.5温育60 min，最适作用温度60℃；

（2）最适作用pH

当60℃温育60 min，最适pH为5.5；

（3）热稳定性

当于pH5.5温浴60 min，在高达65℃下稳定；

（4）pH稳定性

当于60℃温浴60 min，在pH4.8-6.3下稳定。

3.根据权利要求1或2所述的麦芽寡糖基海藻糖合成酶，其特征是：由核苷酸序列为SEQ ID NO:2的基因表达而得。

4.一种表达权利要求1或2所述的麦芽寡糖基海藻糖合成酶的基因。

5.根据权利要求4所述的基因，其特征是：其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

6.含有权利要求4或5所述的麦芽寡糖基海藻糖合成酶的基因的重组表达载体。

7.根据权利要求6所述的重组表达载体，其特征是：由表达载体pET24a(+)和权利要求4或5所述的麦芽寡糖基海藻糖合成酶的基因构建而成。

8.含有权利要求4或5所述的麦芽寡糖基海藻糖合成酶的基因的重组工程菌。

9.根据权利要求8所述的重组工程菌，其特征是：将权利要求6或7所述的重组表达载体转入大肠杆菌中构建而成。

10.根据权利要求9所述的重组工程菌，其特征是：所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21。

11.一种制备麦芽寡糖基海藻糖合成酶的方法，其特征是：通过培养权利要求8、9或10所述的重组工程菌制得。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征是：具体包括以下步骤：将重组工程菌在含有

0.10-0.30 mMol/L卡那霉素的LB液体培养基中34-37℃培养12-15 h后，降温至26-29℃，加入终浓度为0.1-0.3 mMol/L的IPTG或者0.3-0.5 mMol/L的乳糖作为诱导剂，在26-29℃下诱导培养12-18 h，然后离心或过滤收集菌体细胞；将菌体细胞破碎、离心收集上清液，得含麦芽寡糖基海藻糖合成酶的粗酶液。

说明书

新型麦芽寡糖基海藻糖合成酶、酶基因、含该基因的重组表

达载体及重组工程菌及酶的制备

技术领域

[0001] 本发明属于基因工程和酶工程领域，具体涉及麦芽寡糖基海藻糖合成酶及其表达基因、含有该基因的重组表达载体及重组工程菌，以及利用含有该基因的重组工程菌制备该酶的方法。

背景技术

[0002] 海藻糖 (Trehalose)是一种由两个葡萄糖分子通过半缩醛羟基以 α -1,1糖苷键结合的非还原性糖，分子式为C12H22O11，相对分子量为378.33。其结构式如图1所示：

[0003]

[0004] 图1 海藻糖的分子结构

[0005] 海藻糖广泛存在于细菌、酵母、真菌、藻类、昆虫和植物中。它对生物体和生物大分子具有非特异性的保护作用。这种非特异性保护作用主要体现在，当生物细胞处于饥饿、干燥、高温、低温冷冻、辐射、高渗透压及有毒试剂等各种胁迫环境时，胞内海藻糖含量迅速上升，从而保护生命本身。

[0006] 外源性的海藻糖同样对生物体和生物大分子有非特异性的保护作用，海藻糖这种独特的生物学性质，使其广泛应用于医药、食品、化妆品等领域。

[0007] 目前海藻糖的生产工艺分为三种：

[0008] （1）提取法

[0009] 酵母在恶劣的环境下（饥饿、高温、高渗、高压）生长，酵母体内能够积累大量海藻糖，大约占菌体干重的15%。因此最初海藻糖的生产采用从酵母体内提取的方法。在酵母细胞内，由于海藻糖属胞内产物，合成受外界环境条件的影响较大，且分离提取困难，因而用此法生产海藻糖的产量较低，商品化生产的发酵水平为0.4-0.6%，成本较高，此种生产方法海藻糖价格昂贵。

[0010] （2）单酶法

[0011] 1995年，日本林原生化研究所从Pimelobacter、Psceuclomonus 和Thermus 三属微生物中分离纯化了一种新型淀粉酶—海藻糖合酶，它可以转化麦芽糖为海藻糖，并申请了专利CN1106065A。此后我国科研单位也相继从不同细菌中发现了海藻糖合酶并进行基因工程表达，例如CN200410013007.3、CN200910114318.1、CN200910007259.8、CN201010614814.6、CN201010614832.4、CN201210160403.3、CN201210011457.3，其中栖热菌属海藻糖合酶具有80℃的热稳定性。随着反应温度升高，海藻糖合酶转化麦芽糖生产海藻糖的转化率会下降，40℃麦芽糖对海藻糖的转化率可达到80%，60℃转化率约为60%。目前还没有利用该工艺大规模生产海藻糖的报道。

[0012] （3）双酶法

[0013] 1994年林原生化研究所发现了新型海藻糖合成酶—麦芽寡糖基海藻糖合成酶（malt ooligosyl tehalose synthase，MTSase）和水解酶（maltooligosyl trehalose hydrolase, MTHase），双酶联合作用于淀粉水解物产生海藻糖，首先MTSase作用于淀粉水解物，淀粉水解物末端形成海藻糖单元，然后MTHase切割掉末端海藻糖，形成一分子海藻糖和少两个葡萄糖基的淀粉水解物。

[0014] 目前以还原性淀粉水解物为原料，双酶转化生产海藻糖是最经济的工艺路线，仍存在以下问题：

[0015] （1）专利CN99123896.6提供了最适温度50℃和最适pH6.0的MTSase和MTHase，转化率可达到80%，目前日本林原生化研究所已利用该技术实现大规模生产。50℃双酶转化容易染菌，此外淀粉水解物需要普鲁兰酶脱支处理。目前商品普鲁兰酶最适温度为55-60℃，最适pH5.0-5.5，pH6.0时活力较低，导致普鲁兰酶和双酶共同转化淀粉生产海藻糖时效率较低，转化时间达到48 h以上。

[0016] （2）文献Production of Trehalose from Starch by Thermostable Enzymes from Sulfol obus acidocaldarius（DOI:10.1002/star.19970490107）报道了嗜酸热硫化叶菌可产最适温度75℃和最适pH5.5左右的MTSase和MTHase。该双酶虽然具有较高的最适反应温度和较低的最适pH，但是文献报道该双酶活力均很低。

发明内容

[0017] 本发明提供了一种新型麦芽寡糖基海藻糖合成酶（简称MTSase，下同），该酶具有较高的最适反应温度和热稳定性，提高了生产海藻糖的稳定性，和普鲁兰酶具有相同的最适pH，显著提高了其和普鲁兰酶联合生产海藻糖的效率。

[0018] 本发明还提供了一种表达该MTSase的基因、含有该基因的重组表达载体和重组工程菌，该基因表达量高，使酶成本显著降低，也进一步降低了制备海藻糖的成本。

[0019] 本发明还提供了一种制备MTSase的方法，通过基因重组技术高效表达得到MTSase，酶制备效率高，大大降低了MTSase的成本。

[0020] 为了得到特性良好的MTSase和MTHase，发明人广泛从土壤中和现有菌库中筛选具有MTSase和MTHase活性的微生物。经过大量筛选工作，发明人筛选出一株氧化节杆菌（Arthrobacter oxydans）TL-3，其具有MTSase和MTHase活性。经过分离纯化鉴定，MTSase和MTHase具有最适反应温度60℃和最适pH5.3-5.5，与现有MTSase和MTHase相比是更具有工业化应用前景的新型MTSase和MTHase。发明人继续研究，通过基因克隆技术获得了编码该酶的核苷酸，进一步获得了相应的氨基酸序列。发明人通过基因重组技术，将编码MTSase和MTHase的DNA导入大肠杆菌宿主中，获得了高效表达MTSase和MTHase的方法。

[0021] 本发明具体技术方案如下：

[0022] 一种新型麦芽寡糖基海藻糖合成酶（简称MTSase，下同），其特征是：它具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

[0023] 上述MTSase具有以下特性：

[0024] （1）作用

[0025] 可以作用于葡萄糖聚合度大于3的还原性淀粉水解物，形成海藻糖作为末端单元的非还原糖；

[0026] （2）分子量

[0027] 根据十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量约为85000Da；

[0028] （3）最适作用温度

[0029] 当pH5.5温育60 min，最适作用温度60℃；

[0030] （4）最适作用pH

[0031] 当60℃温育60 min，最适pH为5.5；

[0032] （5）热稳定性

[0033] 当于pH5.5温浴60 min，在高达65℃下稳定；

[0034] （6）pH稳定性

[0035] 当于60℃温浴60 min，在pH4.8-6.3下稳定；

[0036] 一种表达上述MTSase的基因，该基因含有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，或者含有由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列因遗传密码子的兼并性而取代一个或多个碱基所形成的核苷酸序列、但该突变序列不改变由SEQ ID NO:2所示核苷酸所编码的氨基酸序列，或者含有上述两种核苷酸序列的互补核苷酸序列。上述MTSase可以通过表达该基因而高效获得。

[0037] 本发明还得到了含有MTSase表达基因的重组表达载体，所述重组表达载体优选由表达载体pET24a(+)和MTSase表达基因构建而成。

[0038] 本发明还得到了含有MTSase表达基因的重组工程菌。该重组工程菌是将含有MTSase表达基因的重组表达载体转入大肠杆菌中构建而成；所述大肠杆菌优选为大肠杆菌BL21。

[0039] 制备MTSase的方法，其特征是：通过培养含有MTSase表达基因的重组工程菌制得。

[0040] 上述方法能高效获得MTSase，其步骤包括：将重组工程菌在含有0.10-0.30mMol/L卡那霉素的LB液体培养基中34-37℃培养12-15h后，降温至26-29℃，加入终浓度为0.1-0.3 mMol/L的IPTG（异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，下同）或者0.3-0.5 mMol/L的乳糖作为诱导剂，在26-29℃下诱导培养12-18h，然后离心或过滤收集菌体细胞；将菌体细胞破碎、离心收集上清液，得含麦芽寡糖基海藻糖合成酶的粗酶液。

[0041] 从氧化节杆菌（Arthrobacter oxydans）TL-3筛选得到的另一种酶——麦芽寡糖基海藻糖水解酶（简称MTHase，下同），具有以下特性：

[0042] （1）作用

[0043] 特异性作用于海藻糖作为末端单元的非还原糖，得到一分子海藻糖和少了两个葡萄糖基的非还原糖；

[0044] （2）分子量

[0045] 根据十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量约为65000Da；

[0046] （3）最适作用温度

[0047] 当pH5.3温育60 min，最适作用温度60℃；

[0048] （4）最适作用pH

[0049] 当60℃温育60 min，最适pH为5.3；

[0050] （5）热稳定性

[0051] 当于pH5.3温浴60 min，在高达70℃下稳定；

[0052] （6）pH稳定性

[0053] 当于60℃温浴60 min，在pH4.5-6.5下稳定。

[0054] 从上述MTHase的特性可以看出，MTHase也具有与MTSase基本一致的较高的最适反应温度和较低的最适pH，也能提高生产海藻糖的稳定性。MTHase具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，可以通过表达具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列的基因而高效获得。

[0055] 本发明公开了一种新型MTSase、表达这种酶的基因，含有这种酶的基因的重组表达载体和重组工程菌、制备这种酶的方法，在知道了酶的基因和核苷酸序列的基础上，可以通过现有技术得到基因的核苷酸序列和酶的氨基酸序列，例如PCR扩增技术。此外，相关载体、宿主细胞、内切酶、试剂等都是现有技术中公开的内容，本领域人员可以很容易的得到。

[0056] 本发明的技术方案与现有技术相比具有以下优点：

[0057] （1）本发明中新型MTSase具有较高的最适反应温度和热稳定性，具有60℃的最适反应温度和65℃热稳定性，MTSase在转化淀粉水解物生产海藻糖过程中，不易染菌，降低了染菌风险，可提高海藻糖生产中的稳定性。

[0058] （2）本发明中新型MTSase具有较低的最适pH，在酸性条件pH 5.5左右最适宜反应，和普鲁兰酶具有相同的最适宜pH，更适合和普鲁兰酶协同作用淀粉水解物生产海藻糖，显著提高生产海藻糖的效率。

[0059] （3）本发明得到表达酶的基因，采用基因重组技术构建基因工程菌生产MTSase，菌体培养简单，MTSase，酶制备效率显著提高，酶成本显著降低，降低了海藻糖的生产成本，为海藻糖在食品、医药、化妆品等领域的广泛应用奠定了坚实的成本基础。

附图说明

[0060] 为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中：

[0061] 图1显示温度对麦芽寡糖基海藻糖合成酶活性的影响。

[0062] 图2显示pH对麦芽寡糖基海藻糖合成酶活性的影响。

[0063] 图3显示温度对麦芽寡糖基海藻糖合成酶稳定性的影响。

[0064] 图4显示pH对麦芽寡糖基海藻糖合成酶稳定性的影响。

[0065] 图5为麦芽寡糖基海藻糖合成酶重组质粒限制性图谱，粗黑实线显示是编码麦芽寡糖基海藻糖合成酶的核苷酸序列。

[0066] 图6显示温度对麦芽寡糖基海藻糖水解酶活性的影响。

[0067] 图7显示pH对麦芽寡糖基海藻糖水解酶活性的影响。

[0068] 图8显示温度对麦芽寡糖基海藻糖水解酶稳定性的影响。

[0069] 图9显示pH对麦芽寡糖基海藻糖水解酶稳定性的影响。

[0070] 图10为麦芽寡糖基海藻糖水解酶重组质粒限制性图谱，粗黑实线显示是编码麦芽寡糖基海藻糖水解酶的核苷酸序列。

具体实施方式

[0071] 根据下述实施例，可以更好地理解本发明。但是本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体工艺条件、物料配比及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所描述的本发明。

[0072] 无特殊说明，以下实施例中酶活检测和酶活单位定义如下：

[0073] （1）麦芽寡糖基海藻糖合成酶（MTSase）酶活测定和定义

[0074] 将麦芽五糖溶于100 mMol/L pH 5.5的柠檬酸缓冲液中，配成20%的溶液。取100 mL该溶液，加入1 mL MTSase酶液，60℃反应10 min，100℃沸水中煮10 min终止反应。将转化液冷却后，调节pH到4.2，加入0.1 mL葡萄糖糖化酶（诺维信公司产品），60℃糖化24 h，常规液相色谱测定糖化液中海藻糖的含量。MTSase催化麦芽五糖生成麦芽糖五糖基海藻糖，糖化酶可以水解α-1,4-糖苷键，而不能水解α-1,1-糖苷键，故而糖化后的溶液中只含有海藻糖和葡萄糖。因此，最终海藻糖的摩尔生成量即等于MTSase催化产生的麦芽五糖基海藻糖摩尔的量。MTSase的酶活单位(U)定义为每1 min转化麦芽五糖生成1 mMol麦芽五糖基海藻糖所需的酶量。

[0075] （2）麦芽寡糖基海藻糖水解酶（MTHase）酶活测定和定义

[0076] 将麦芽五糖溶于100 mMol/L pH 5.5的柠檬酸缓冲液中，配成20%的溶液。取100 mL该溶液，加入200 U MTSase酶液，60℃反应5 h，100℃沸水中煮10 min终止反应。待溶液冷却后，调节pH 5.3，加入1 mLMTHase酶液，60℃反应10 min，100℃沸水中煮10 min终止反应。HPLC测定转化液中海藻糖的含量。MTHase的酶活单位(U)定义为每1 min水解麦芽五糖基海藻糖生成1 mMol海藻糖所需的酶量。

[0077] 培养基组成(W/V)：1% 蛋白胨，0.5% 酵母膏，1% NaCl，pH7.0±0.2。

[0078] 培养基组成(W/V)：2% 蛋白胨，0.5% 酵母膏，0.05% NaCl，0.0186% KCl，0.095% MgCl2，0.36% 葡萄糖，pH7.0±0.2。

[0079] 本发明所用到的技术，例如PCR扩增技术、引物设计技术、载体构建技术、工程菌构建技术、检测技术、电泳技术等均为基因工程中比较成熟的技术，本领域人员可以根据现有技术实现。在操作过程中所用的设备或者试剂、载体、酶等，如无特别说明，均能在市场中得到。

[0080] 麦芽寡糖基海藻糖合成酶（MTSase）和麦芽寡糖基海藻糖水解酶（MTHase）的筛选[0081] 实施例1 菌体培养

[0082] 经过大量的筛选，选择出具有MTSase和MTHase良好活性的氧化节杆菌（Arthrobacter oxydans）TL-3，该菌株保存于美国模式菌种收集中心（ATCC），保藏编号：14358。该菌株的培养基组成为：蛋白胨10 g/L、酵母抽提物30 g/L、葡萄糖10 g/L、MgSO4
0.06 g/L, KH2PO4 2.13 g/L，K2HPO4·3H2O 16.43 g/L，pH 7.0。121℃加热灭菌15 min。

[0083] 菌体培养过程为：培养基冷却后，从斜面菌种，取两环A.oxydans TL-3菌体接种装有200 mL上述培养基的1000 mL三角瓶，220 rpm，38℃震荡培养24 h。

[0084] 实施例2 MTSase分离纯化和酶学特性研究

[0085] 实施例2-1 MTSase分离纯化

[0086] (1)菌体破碎

[0087] 按实施例1中方法进行菌体培养，获得10升培养物，以8000 rpm离心20 min，收获150 g湿菌体，重新悬浮于缓冲液中，冰浴条件下超声破碎菌体。缓冲液组成为0.2 Mol/L柠檬酸缓冲液，pH5.5。超声破碎后离心(10000 r/min, 20 min)，取上清液，得粗酶液。

[0088] （2）硫酸铵沉淀

[0089] 硫酸铵沉淀及透析均在冰浴中进行，在粗酶液中缓慢加入硫酸铵使饱和度达到40%，4℃放置过夜，然后12000 r/min 离心20 min，上清液中继续缓慢加入硫酸铵使饱和度达到60%，再次离心，收集沉淀并溶于0.025 Mol/L磷酸钾缓冲液（pH5.8）中，用截留分子量为10000 Da的透析袋透析除盐。

[0090] （3）DEAE-Sepharose 阴离子交换层析

[0091] 将硫酸铵沉淀并透析过后的酶液进行DEAE-Sepharose (16 mMol/L×350 mm)阴离子交换层析，上样缓冲液A为0.025 Mol/L 磷酸钾(pH=5.8)缓冲液，洗脱缓冲液B为缓冲液A+1Mol/L NaCl. 用0-100%缓冲液B进行线性梯度洗脱，分管收集洗脱液，检测酶活。

[0092] （4）SP Fast Flow 强阳离子交换层析

[0093] 将DEAE-Sepharose 阴离子交换层析得到的含有酶活力的酶液透析、浓缩，进行SP Fast Flow强阳离子交换层析，上样缓冲液C为0.025 Mol/L 磷酸钾(pH=5.8)缓冲液，洗脱缓冲液D为缓冲液C+1 Mol/L NaCl。用0%-25%缓冲液D线性梯度洗脱，收集活性峰，浓缩。4 6
浓缩处理的纯酶进行凝胶过滤层析，使用分子筛Sephacryl S-300（Mr：1× 10- 1.5×10）对酶进行分子量标定。分子筛标准品分别为：Thyroglobulin(669 kD)，Ferritin(440 kD)， Aldolase(158 kD)，BSA(67 kD)，VB12（1.382 kD）。

[0094] MTSase纯化结果见表1：

[0095]

[0096] SP Fast Flow阳离子交换层析后样品经电泳检测为单条带，作logMr−Rf 分子量标准曲线，对照Marker分子量，计算得MTSase分子量约为85 kDa。

[0097] 实施例 2-2 MTSase酶学性质

[0098] （1）MTSase的最适温度

[0099] 在30℃-80℃范围进行酶反应，除了温度外酶反应步骤和条件同酶活检测一致，测定MTSase酶活力，酶活最高时的温度即为最适温度。结果表明，MTSase最适作用温度为60℃，见附图1。

[0100] （2）MTSase的最适pH

[0101] 麦芽五糖溶于不同pH 值的缓冲液(浓度均为0.025 Mol/L)，其他条件同酶活测定，测定酶活力，MTSase活力最高时的pH即为最适pH值。结果表明，MTSase最适pH值为5.5，见附图2。

[0102] （3）MTSase的热稳定性

[0103] 将酶液分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃水浴中保存60min，然后进行酶活检测，以未处理酶液所测酶活力为对照，计算MTSase的相对酶活力，相对酶活力(%)=处理后酶液剩余酶活力(U/mg)/未处理酶液酶活力(U/mg)。结果表明，MTSase在高达65℃下稳定，见附图3。

[0104] （4）MTSase的pH稳定性

[0105] 麦芽五糖溶于不同pH 值的缓冲液(浓度均为0.025 Mol/L)，于60℃水浴中保存60 min，然后进行酶活检测，以未处理酶液所测酶活力为对照，计算MTSase的相对酶活力，相对酶活力(%)=处理后酶液剩余酶活力(U/mg)/未处理酶液酶活力(U/mg)。结果表明，MTSase在pH4.8-6.3下稳定，见附图4。

[0106] 实施例3 MTHase分离纯化和酶学特性研究

[0107] 实施例3-1 MTHase分离纯化

[0108] (1)菌体破碎

[0109] 按实施例1中方法进行菌体培养，获得10升培养物以8000 rpm离心20 min，收获150 g湿菌体，重新悬浮于缓冲液中，冰浴条件下超声破碎菌体。缓冲液组成为0.2 Mol/L柠檬酸缓冲液，pH5.3。超声破碎后离心(12000 r/min，20 min)，取上清液，得粗酶液。

[0110] （2）硫酸铵沉淀

[0111] 硫酸铵沉淀及透析均在冰浴中进行，在粗酶液中缓慢加入硫酸铵使饱和度达到40%，4℃放置过夜，然后12000 r/min 离心20 min，上清液中继续缓慢加入硫酸铵使饱和度达到60%，再次离心，收集沉淀并溶于0.025 Mol/L磷酸钾缓冲液（pH5.8）中，用截留分子量为10000 Da的透析袋透析除盐。

[0112] （3）DEAE-Sepharose阴离子交换层析

[0113] 将硫酸铵沉淀并透析过后的酶液进行DEAE-Sepharose (16 mMol/L×350 mm)阴离子交换层析，上样缓冲液A为0.025 Mol/L 磷酸钾(pH=5.5)缓冲液，洗脱缓冲液B为缓冲液A+1Mol/L NaCl. 用0-100%缓冲液B进行线性梯度洗脱，分管收集洗脱液，检测酶活。

[0114] （4）SP Fast Flow强阳离子交换层析

[0115] 将DEAE-Sepharose阴离子交换层析得到的含有酶活力的酶液透析、浓缩，进行SP Fast Flow强阳离子交换层析，上样缓冲液C为0.025 Mol/L磷酸钾(pH=5.5)缓冲液，洗脱缓冲液D为缓冲液C+1 Mol/L NaCl。用0%-25%缓冲液D线性梯度洗脱，收集活性峰，浓缩。4 6
浓缩处理的纯酶进行凝胶过滤层析，使用分子筛Sephacryl S-300（Mr：1×10-1.5×10）对酶进行分子量标定。分子筛标准品分别为：Thyroglobulin (669 kD)，Ferritin(440 kD)，Aldolase(158 kD)，BSA(67 kD)，VB12（1.382 kD）。

[0116] MTHase纯化结果见表2：

[0117]

[0118] SP Fast Flow阳离子交换层析后样品经电泳检测为单条带，作logMr−Rf 分子量标准曲线，对照Marker分子量，计算得MTHase分子量约为65 kDa。

[0119] 实施例3-2 MTHase酶学性质

[0120] （1）MTHase的最适温度

[0121] 在30℃-80℃范围进行酶反应，除了温度外酶反应步骤和条件同酶活检测一致，测定MTHase酶活力，酶活最高时的温度即为最适温度。结果表明，MTHase最适作用温度为63℃，见附图6。

[0122] （2）MTHase的最适pH

[0123] 麦芽五糖溶于不同pH 值的缓冲液(浓度均为0.025 Mol/L)，其他条件同酶活测定，测定酶活力，MTHase活力最高时的pH即为最适pH 值。结果表明，MTHase最适为5.3，见附图7。

[0124] （3）MTHase的热稳定性

[0125] 将酶液分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃水浴中保存60 min，然后进行酶活检测，以未处理酶液所测酶活力为对照，计算MTHase的相对酶活力，相对酶活力(%)=处理后酶液剩余酶活力(U/mg)/未处理酶液酶活力(U/mg)。结果表明，MTHase在高达70℃下稳定，见附图8。

[0126] （4）MTHase的pH稳定性

[0127] 麦芽五糖溶于不同pH 值的缓冲液(浓度均为0.025 Mol/L)，于60℃水浴中保存60 min，然后进行酶活检测，以未处理酶液所测酶活力为对照，计算MTHase的相对酶活力，相对酶活力(%)=处理后酶液剩余酶活力(U/mg)/未处理酶液酶活力(U/mg)。结果表明，MTHase在pH 4.5-6.5下稳定，见附图9。

[0128] 基因的克隆和表达

[0129] 实施例4 总DNA提取

[0130] A．oxydans TL-3按实施例1中培养18 h，8000 rpm离心收集菌体，然后按照Takara大连公司提供的Genonic DNA Purification Kit使用说明，提取基因组DNA。

[0131] 实施例5 MTSase基因克隆、表达

[0132] (1)MTSase基因克隆

[0133] 引物设计：根据Genbank上已报道的节杆菌Arthrobacter sp. Q36来源的MTSase的基因序列，用Vector NTI软件设计引物：

[0134] 上游引物：5’-CCCATATGGGATGACGCACACCTACCCT-3’下划线为NdeⅠ酶切位点；

[0135] 下游引物：5’-TTGCGGCCGCAAAGTCAGCGACTGCTGC-3’下划线为NotⅠ酶切位点。

[0136] （聚合酶链式反应）的扩增体系：以A.oxydans TL-3基因组为模板，扩增目的基因片段，条件如下：基因组DNA 2 μL，上下游引物各2 μL，dNTP 4 μL，10×Taq缓冲液5 μL，Taq 酶（宝生物工程(大连) 有限公司）1 μL，ddH2O 34 μL；

[0137] PCR反应程序为：94℃预变性2 min；96℃变性30 s，然后59℃退火1 min，72℃延伸1 min，循环25次；最后72℃延伸10 min；

[0138] 产物测序：产物用1%琼脂糖凝胶电泳验证，扩增得到2300 bp左右的DNA片段，切胶回收，基因测序表明片段为2331 bp的开放阅读框，如SEQ ID NO:2所示，编码一个由776个氨基酸组成的蛋白质，如SEQ ID NO:1所示。NCBI序列比对分析表明，该蛋白属于淀粉酶家族，和Arthrobacter sp. Q36来源的MTSase氨基酸序列有75%的相似性。

[0139] 基因表达

[0140] 限制性酶切：首先用NdeⅠ限制性内切酶（宝生物工程(大连) 有限公司）分别对上述（1）中PCR产物和pET24a(+)进行酶切处理，酶切体系为：DNA 5 μL，NdeⅠ5 μL,10×H缓冲液10 μL，ddH2O 80 μL，总体积100 μL，酶切后的产物经大连宝生物公司DNA片段纯化试剂盒纯化。纯化后，再分别用NotⅠ限制性内切酶（宝生物工程(大连) 有限公司）酶切，酶切反应体系为：DNA 5 μL，NotⅠ 5 μL，10×H缓冲液10μL，0.1%BSA（牛血清白蛋白）10 μL，0.1%TritonX-100 10 μL，ddH2O 60 μL，总体积100 μL，酶切后的产物经大连宝生物公司DNA片段纯化试剂盒纯化。

[0141] 连接：双酶切产物纯化后用T4连接酶（宝生物工程(大连) 有限公司）连接，连接反应体系为：酶切纯化的PCR产物8 μL，酶切纯化的pET24a(+) 8 μL，T4连接酶2 μL，10×T4缓冲液2 μL。37℃连接2 h，纯化后获得重组质粒pET24a(+)-MTSase，见图5。

[0142] 转化：E.coli BL21（大肠杆菌）宿主菌在LB液体培养基中培养12 h，按5%接种量移至新鲜的LB液体培养基中，37℃培养2 h，取1 mL培养液加入1.5 mL离心管中，5000 rpm离心5 min（4℃），倾去上清液加入用冰冷却的0.1Mol/L CaCl2 500 μL，震荡均匀，5000 rpm低温离心5 min，再加入500 μL CaCl2，震荡均匀，5000 rpm低温离心5 min，收集菌体，加入200 μL CaCl2摇匀，作为感受态细胞。吸取5 μL重组质粒pET24a(+)-MTSase加入100 μL感受态细胞中，冰浴30 min，42℃水浴90 s，迅速将离心管转移至冰浴中，冷却1-2 min，然后加入1 mL SOC培养基中，37℃培养45 min后，取200 μL涂布于含有0.15 mMol/L卡那霉素的LB固体培养基表面，37℃培养12-16 h至单菌落出现，保存单菌落于LB固体培养基斜面。

[0143] 鉴定：将上述单菌落接种于含有0.15 mMol/L卡那霉素的LB液体培养基，37℃培养15 h，降温至27℃，加入终浓度为0.2 mMol/L的IPTG作为诱导剂，27℃诱导培养14 h后离心收获菌体细胞。细胞经过常规超声破碎，8000 rpm离心收集上清液，酶活检测表明，每毫升发酵液可以产MTSase 28.7 U，说明MTSase表达成功，并且和原始菌相比，产酶量提高了89.7倍。

[0144] 实施例6 MTHase基因克隆、表达

[0145] (1)MTHase基因克隆

[0146] 引物设计：根据Genbank上已报道的节杆菌Arthrobacter sp. Q36来源的MTHase的基因序列，用Vector NTI软件设计引物：

[0147] 上游引物：5’-CCCATATGGGATGAGTACGCCAGTGTCC-3’下划线为NdeⅠ酶切位点；

[0148] 下游引物：5’-TTGCGGCCGCAAGTGAGAGGTGGACAGACG-3’下划线为NotⅠ酶切位点。

[0149] （聚合酶链式反应）的扩增体系：以A.oxydans TL-3基因组为模板，扩增目的基因片段，条件如下：基因组DNA 2 μL，上下游引物各2 μL，dNTP 4 μL，10×Taq缓冲液5 μL，Taq 酶1 μL，ddH2O 34 μL；

[0150] PCR反应程序为：94℃预变性2 min；96℃变性30 s，然后58℃退火1 min，72℃延伸1 min，循环25次；最后72℃延伸10 min；

[0151] 产物测序：产物用1%琼脂糖凝胶电泳验证，扩增得到1800bp左右的DNA片段，切胶回收，基因测序表明片段为1797bp的开放阅读框，如SEQ ID NO:4所示，编码一个由598个氨基酸组成的蛋白质，如SEQ ID NO:3所示。NCBI序列比对分析表明，该蛋白属于淀粉酶家族，和Arthrobacter sp. Q36来源的MTHase氨基酸序列有79%的相似性。

[0152] 基因表达

[0153] 限制性酶切：首先用NdeⅠ限制性内切酶分别对上述（1）中PCR产物和pET24a(+)进行酶切处理，酶切体系为：DNA 5 μL，NdeⅠ 5 μL，10×H缓冲液10 μL，ddH2O 80 μL，总体积100 μL，酶切后的产物经大连宝生物公司DNA片段纯化试剂盒纯化。纯化后，再分别用NotⅠ限制性内切酶酶切，酶切反应体系为：DNA 5 μL，NotⅠ 5 μL，10×H缓冲液10 μL，0.1%BSA 10 μL，0.1%TritonX-100 10 μL，ddH2O 60 μL，总体积100 μL，酶切后的产物经大连宝生物公司DNA片段纯化试剂盒纯化。

[0154] 连接：双酶切产物纯化后用T4连接酶连接，连接反应体系为：酶切纯化的PCR产物8 μL，酶切纯化的pET24a(+)8 μL，T4连接酶2 μL，10×T4缓冲液2 μL。37℃连接2h，纯化后获得重组质粒pET24a(+)-MTHase，见图10。

[0155] 转化：E.coli BL21宿主菌在LB液体培养基中培养12 h，按5%接种量移至新鲜的LB液体培养基中，37℃培养2 h，取1 mL培养液加入1.5 mL离心管中，5000 rpm离心5 min（4℃），倾去上清液加入用冰冷却的0.1 Mol/L CaCl2 500 μL,震荡均匀，5000 rpm低温离心5 min，再加入500 μL CaCl2，震荡均匀，5000 rpm低温离心5 min，收集菌体，加入200 μL CaCl2摇匀，作为感受态细胞。吸取5 μL重组质粒pET24a(+)-MTHase加入100 μL感受态细胞中，冰浴30 min，42℃水浴90 s，迅速将离心管转移至冰浴中，冷却1-2 min，然后加入1 mL SOC培养基中，37℃培养45 min后，取200 μL涂布于含有0.15 mMol/L卡那霉素的LB固体培养基表面，37℃培养12-16 h至单菌落出现，保存单菌落于LB固体培养基斜面。

[0156] 鉴定：将上述单菌落接种于含有0.15 mMol/L卡那霉素的LB液体培养基，37℃培养15 h，降温至28℃，加入终浓度为0.2 mMol/L的IPTG作为诱导剂，28℃诱导培养16 h后离心收获菌体细胞。细胞经过常规超声破碎，8000 rpm离心收集上清液，酶活检测表明，每毫升发酵液可以产MTHase 86.2 U，说明MTHase重组表达成功，并且和原始菌相比，产酶量提高了70.4倍。

[0157] 实施例7 MTSase制备

[0158] 实施例7-1 MTSase制备

[0159] MTSase重组菌（含有重组质粒pET24a(+)-MTSase的E.coli BL21大肠杆菌）在含有0.15 mMol/L卡那霉素的LB液体培养基34℃培养15 h，降温至26℃，加入终浓度为0.1 mMol/L的IPTG作为诱导剂，26℃诱导培养18 h后离心收获菌体细胞。细胞经过常规超声破碎，8000 rpm离心20 min收集上清液作为粗酶液，酶活检测表明，每毫升发酵液可以产MTSase 24.6 U。

[0160] 实施例7-2 MTSase制备

[0161] MTSase重组菌在含有0.15 mMol/L卡那霉素的LB液体培养基37℃培养13.5 h，降温至29℃，加入终浓度为0.3 mMol/L的IPTG作为诱导剂，29℃诱导培养18 h后过滤收获菌体细胞。细胞经过常规高压匀浆机破碎，8000 rpm离心20 min收集上清液作为粗酶液，酶活检测表明，每毫升发酵液可以产MTSase 29.3 U。

[0162] 实施例7-3 MTSase制备

[0163] MTSase重组菌在含有0.15 mMol/L卡那霉素的LB液体培养基37℃培养15 h，降温至26℃，加入终浓度为0.3 mMol/L的乳糖作为诱导剂，26℃诱导培养18 h后过滤收获菌体细胞。细胞经过常规超声破碎，8000 rpm离心20 min收集上清液作为粗酶液，酶活检测表明，每毫升发酵液可以产MTSase 30.4 U。

[0164] 实施例7-4 MTSase制备

[0165] MTSase重组菌在含有0.15 mMol/L卡那霉素的LB液体培养基34℃培养15 h，降温至29℃，加入终浓度为0.5 mMol/L的乳糖作为诱导剂，29℃诱导培养15 h后过滤收获菌体细胞。细胞经过常规超声破碎，8000 rpm离心20 min收集上清液作为粗酶液，酶活检测表明，每毫升发酵液可以产MTSase 31.2 U。

[0166] 实施例8 MTHase制备

[0167] MTHase重组菌（含有重组质粒pET24a(+)-MTHase的E.coli BL21大肠杆菌）在含有0.15 mMol/L卡那霉素的LB液体培养基37℃培养15 h，降温至28℃，加入终浓度为0.3 mMol/L的乳糖作为诱导剂，28℃诱导培养16 h后过滤收获菌体细胞。细胞经过常规超声破碎，8000 rpm离心20 min收集上清液作为粗酶液，酶活检测表明，每毫升发酵液可以产MTHase 90.2 U。

[0168] 实施例9 MTSase和MTHase在海藻糖生产中的应用

[0169] 实施例9-1 MTSase和MTHase在海藻糖生产中的应用

[0170] 质量浓度27.5%的淀粉乳调pH5.8，每升反应液加入0.3 mL的诺维信高温淀粉酶（诺维信公司，下同），95℃反应25 min，可得到DE值为8.3的淀粉水解物，132℃灭酶5 min。

[0171] DE值为8.3还原性淀粉水解物1L，加入300 U MTSase、300 U MTHase，1.0 mL诺维信普鲁兰酶，pH5.4条件下60℃反应29.5 h，海藻糖的转化率可达到85.4%。

[0172] 实施例9-2 MTSase和MTHase在海藻糖生产中的应用

[0173] 质量浓度27.5%的淀粉乳调pH5.4，每升反应液加入0.5mL的诺维信高温淀粉酶，94℃反应25 min，可得到DE值为7.6的淀粉水解物，132℃灭酶7 min。

[0174] DE值为7.6还原性淀粉水解物1 L，加入100 U MTSase、900 U MTHase，0.6 mL诺维信普鲁兰酶，pH5.3条件下65℃反应32 h，海藻糖的转化率可达到83.7%。

[0175] 上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。