培育抗病水稻的方法及其专用载体和启动子

摘要

本发明公开了一种培育抗病水稻的方法及其专用载体和启动子。本发明提供的方法，将microRNA393的编码基因及驱动其表达的诱导型启动子导入目的植物，获得转基因植物；所述转基因植物的抗水稻白叶枯病高于所述目的植物；所述诱导型启动子为如下1)或2)：1)由单顺式调控元件和CaMV35S启动子组成；2)由双顺式调控元件和CaMV35S启动子组成。本发明的实验证明，本发明提供的培育转基因植物的方法，为将含有诱导型启动子和microRNA393的重组载体转化水稻，得到的转基因水稻在病原侵染过程中才启动microRNA393基因表达。

权利要求

1.一种培育抗病转基因植物的方法，为将microRNA393的编码基因及驱动其表达的诱导型启动子导入目的植物，获得转基因植物；所述转基因植物的抗病性高于所述目的植物，所述诱导型启动子为由双顺式调控元件和CaMV35S启动子组成；

所述microRNA393的核苷酸序列为序列表中的序列3；

所述双顺式调控元件的核苷酸序列为序列2的自5’末端第1-114位核苷酸；

所述CaMV35S启动子的核苷酸序列为序列表中序列2自5’末端第115-226位核苷酸；

所述植物为水稻。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述microRNA393的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列2自5’末端第227-364位核苷酸；

所述目的植物为水稻；所述转基因植物的抗病性高于所述目的植物是在引发所述病的病原菌诱导下产生的；所述病为水稻白叶枯病。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

所述microRNA393的编码基因及驱动其表达的诱导型启动子通过植物表达载体导入所述目的植物；

所述植物表达载体为将序列表中的序列2插入1300-DAS的中，得到表达microRNA393的载体。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述水稻白叶枯病的病原菌为水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)。

5.一种重组载体，为将序列表中的序列2插入1300-DAS的中，得到表达microRNA393的载体。

6.一种DNA分子A，为序列表的序列2自5’末端第1-114位核苷酸所示的DNA分子。

7.一种DNA分子B，为序列表的序列2自5’末端第1-226位核苷酸所示的DNA分子。

8.权利要求6所述的DNA分子A或权利要求7所述的DNA分子B在启动目的基因在植物中表达的应用；所述植物为水稻。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述目的基因为microRNA393或GUS；

所述microRNA393的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列2自5’末端第227-364位核苷酸。

说明书

培育抗病水稻的方法及其专用载体和启动子

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种培育抗病水稻的方法及其专用载体和启动子。

背景技术

[0002] 水稻作为重要的粮食作物之一，为世界上一半以上的人口提供食物来源。水稻种植面积约占全国耕地面积的1/4，年产量将近占全国粮食总产的1/2。水稻病害一直严重影响水稻的生产。水稻病害的种类很多，全世界有近百种，我国正式记载的达70余种，有经济重要性的有20余种，其中稻瘟病、纹枯病和白叶枯病发生面积大、流行性强、危害严重，是水稻上的“三大重要病害”。以水稻白叶枯病为例，田间常在分蘖期观察到病症，并随植株的生长而发展，至抽穗期达到高峰。水稻遭受白叶枯病后，一般减产20-30％，严重时甚至绝收。不断提高水稻产量、品质及抗病性，为保障国家粮食安全和农业可持续发展有重要意义。目前应对农作物病害的主要手段是培育抗病品种和化学农药防治。然而现有的水稻抗病品种存在育种周期长、抗性丧失快等重大技术障碍，化学农药的施用对环境造成严重污染。从植物本身进一步挖掘抗病基因资源，可为应对水稻重大病害及不断产生的新病害提供抗病育种的新手段和新策略。

[0003] 目前，水稻中已定位30多个稻瘟病抗性位点和25个白叶枯病抗性位点。抗性基因(R基因)介导的抗病性水平高，常表现高抗，是抗病基因工程中常用的抗病基因。但R基因和病原菌avr基因的互作表现为品种对小种的专化性抗性，所以R基因介导的水稻抗病性常因病原菌群体生理小种的变化而丧失。在真核生物中广泛存在的非编码小RNA(nonconding small RNAs)包括miRNAs(microRNAs)和siRNA(short interfering RNAs)，可以通过对靶标RNA的剪切或翻译抑制，以及DNA或染色体的甲基化等调控靶标基因的表达。miRNA由非编码核基因转录而来，其基因多定位于基因之间的间隔区，也有一些位于基因的内含子区域，有些成簇存在。对已测序的生物的基因组研究发现，越高等的生物其基因间隔区所占比例越大。越来越多的研究表明，这些非编码小RNA参与了生物的生长发育和抗病应答过程。系统分析植物中参与这些应答过程的小RNA，并根据小RNA对应的靶标基因分析靶标基因参与的代谢途径，为进一步应用小RNA调控植物抗病打下基础。大量的研究表明小RNA介导的基因沉默是植物和动物抵抗病毒侵染的重要分子机制。最新的研究表明，小RNA也参与了植物抗细菌的基础免疫反应。因此，小RNA为开发新的水稻抗病途径提供良好的基因资源。

[0004] miRNA序列在拟南芥和水稻之间相对保守，但水稻中也存在其特异的miRNA，这可能暗示在水稻中存在特异的小RNA参与的基因调控网络；siRNA的种类多样，在不同物种之间的保守性不强，其功能尚未完全阐述清楚，但已有研究发现假单胞菌(Pseudomonas syringae)可以诱导拟南芥内源siRNA表达，并且siRNA在植物免疫中同miRNA一样有重要的调节功能。对水稻小RNA抗病基因资源的挖掘不但在植物抗病机理的研究上可能有新的重大发现，更重要的是分离鉴定对水稻抗病/植物免疫中有潜在应用价值的小RNA，可为水稻抗病育种提供拥有自主知识产权基因资源，建立水稻抗病育种的新策略。

[0005] 目前已发现内源小RNA广泛参与了植物形态建成、开花、根系发育、激素应答和抗胁迫反应等重要相关基因的表达调控。植物内源小RNA(small RNA)主要包括miRNA和siRNA两类。siRNA又分为主要的四类，分别为内源性siRNA(natural antisense siRNA，nat-siRNA)、反式作用siRNA(trans-acting short interfering RNAs，tasiRNAs)、异染色质siRNA(heterochromatic siRNAs，hc siRNAs)和长siRNA(long siRNA，lsiRNA)。不同的Dicer酶切割不同的底物产生21-30nt的小RNA，而miRNA和siRNA均能与特异的AGO(Argonaute)蛋白结合形成RTSC复合物(RNA-induced silencing complexes)，并作用于不同的靶标基因，引起小RNA介导的基因沉默。水稻中有8个类Dicer(OsDCLs)、19个ARGONAUTE蛋白(OsAGOs)和5个依赖RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，OsRDRs)。siRNA来源于入侵核酸或病毒复制形成的双链RNA，这些外源siRNA介导的RNA沉默是一种被动的防御机制；而在染色体上发现的内源性的siRNA则是细胞主动利用RNA沉默机制。最近的研究表明，在植物与病原细菌互作过程中，内源的小RNA也参与了植物抗细菌的基础免疫反应。

[0006] 研究者已经成功鉴定了两个植物病原细菌的病原相关分子模式PAMP(pathogen-associated molecular pattern)及其特异性的模式识别受体(pattern recognition receptor)，即鞭毛蛋白片段flg22(其受体为激酶FLS2)和延长因子EF-TU(其受体为EFR)。其中，flg22可被水稻受体OsFLS2所识别已经获得实验证实。有意义的是，目前研究发现拟南芥的microRNA393会被flg22特异性地诱导，随后microRNA393介导了植物生长素受体基因TIR1，AFB2和AFB3mRNA的降解，使生长素信号途径受到抑制。
又如，拟南芥miRNA途径关键基因DCL1和Hen1突变的dcl1-9和hen1-1突变体，会表现出一定程度的免疫缺损，III型分泌系统突变的Pseudomonas syringae pv.tomato(Pto)DC3000 hrcC-病原菌，虽然不能分泌毒性蛋白因子，但在dcl1-9和hen1-1突变体上Pto DC3000 hrcC-和野生型Pto DC3000病原菌使上述两个拟南芥突变体都感病，miRNA途径的破坏甚至导致非寄主病原(如E.coli和P.fluorescens)对拟南芥的侵染。miRNA途径可能是植物基础抗性的重要组成部分。进一步研究表明病原细菌(P.syringae)的效应蛋白AvrPtoB可通过抑制拟南芥pri-microRNA393的转录，从而抑制植物由细菌的效应蛋白引发的免疫反应，即ETI(effector-triggered immunity)途径。

[0007] 启动子是调控基因表达的重要元件，是生物遗传操作中必要因素，对于基因功能的研究和转基因育种都具有重要价值。组成型启动子是应用较为广泛的启动子，多用于基因的过量表达，没有时间和空间的特异性；而诱导型启动子则因具有应答特异刺激下表达的特点而被应用在光、热、创伤、病原、激素等生物诱导或非生物逆境胁迫(干旱、高盐、低温等)条件下表达；组织特异性启动子在根、叶、花、果实等特定组织中表达。组织特异性启动子和诱导型启动子较组成型启动子在应用上的优势在于，只在特定时空表达而避免过度损耗能量，有利于平衡植物生长发育与应答逆境的关系。因此，挖掘诱导型或组织特异性启动子元件，转基因分子设计育种都具有重要作用。

[0008] 植物抗病基因工程所首选的最佳目的基因是来自植物自身的抗病基因，包括参与抗病功能调控的小RNA。利用病原诱导型的启动子驱动抗病相关的小RNA表达是较为理想的策略。

发明内容

[0009] 本发明的一个目的是提供一种培育抗病转基因植物方法。

[0010] 本发明提供的方法，为将microRNA393的编码基因及驱动其表达的诱导型启动子导入目的植物，获得转基因植物；所述转基因植物的抗病性高于所述目的植物。

[0011] 上述方法中，所述诱导型启动子为如下1)或2)：

[0012] 1)由单顺式调控元件和CaMV35S启动子组成；

[0013] 2)由双顺式调控元件和CaMV35S启动子组成；

[0014] 所述microRNA393的核苷酸序列为序列表中的序列3；

[0015] 所述单顺式调控元件的核苷酸序列为序列1的自5’末端第1-66位核苷酸；

[0016] 所述双顺式调控元件的核苷酸序列为序列2的自5’末端第1-114位核苷酸；

[0017] 所述CaMV35S启动子的核苷酸序列为序列1的自5’末端第67-178位核苷酸或序列表中序列2自5’末端第115-226位核苷酸；

[0018] 上述microRNA393的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列1自5’末端第179-316位核苷酸或序列表中的序列2自5’末端第227-364位核苷酸。

[0019] 上述方法中，所述microRNA393的编码基因及驱动其表达的诱导型启动子通过植物表达载体导入所述目的植物；

[0020] 所述植物表达载体为如下a)或b)：

[0021] a)为将序列表中的序列1插入1300-DAS的中，得到表达microRNA393的载体；

[0022] b)为将序列表中的序列2插入1300-DAS的中，得到表达microRNA393的载体。

[0023] 上述方法中，所述目的植物为双子叶植物或者单子叶植物，所述单子叶植物具体为水稻。

[0024] 上述方法中，所述转基因植物的抗病性高于所述目的植物是在引发所述病的病原菌诱导下产生的；

[0025] 所述病具体为水稻白叶枯病，所述水稻白叶枯病的病原菌具体为水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)。

[0026] 本发明的另一个目的是提供一种重组载体。

[0027] 本发明提供的重组载体，为如下a)或b)：

[0028] a)为将序列表中的序列1插入1300-DAS的HindIII和EcoRI酶切位点中，得到表达microRNA393的载体；

[0029] b)为将序列表中的序列2插入1300-DAS的HindIII和EcoRI酶切位点中，得到表达microRNA393的载体。

[0030] 本发明的第三个目的是提供一种DNA分子A。

[0031] 本发明提供的DNA分子A，为如下1)-4)中的任一一种：

[0032] 1)序列表的序列1自5’末端第1-66位核苷酸所示的DNA分子；

[0033] 2)序列表的序列2自5’末端第1-114位核苷酸所示的DNA分子；

[0034] 3)在严格条件下与1)或2)所述DNA序列杂交且具有同样功能的DNA分子；

[0035] 4)与1)或2)中所述DNA序列具有90％以上同源性，且具有同样功能的DNA分子。

[0036] 上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

[0037] 本发明的第四个目的是提供一种DNA分子B。

[0038] 本发明提供的DNA分子B，为如下为如下1)-4)中的任一一种：

[0039] 1)序列表的序列1自5’末端第1-178位核苷酸所示的DNA分子；

[0040] 2)序列表的序列2自5’末端第1-226位核苷酸所示的DNA分子；

[0041] 3)在严格条件下与1)或2)所述DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；

[0042] 4)与1)或2)中所述DNA序列具有90％以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。

[0043] 上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

[0044] 上述的DNA分子A或上述的DNA分子B在启动目的基因在植物中表达的应用。

[0045] 在上述应用中，所述目的基因为microRNA393或GUS(genbank号gb|S69414.1)；

[0046] 所述microRNA393的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列1自5’末端第179-316位核苷酸或序列表中的序列2自5’末端第227-364位核苷酸。

[0047] 本发明的实验证明，本发明提供的培育转基因植物的方法，为将含有诱导型启动子和microRNA393的重组载体转化水稻，得到的转基因水稻在病原侵染过程中才启动microRNA393基因表达，可以实现抗水稻白叶枯病菌的目的，避免microRNA393过表达及对转基因植物本身的不利影响。本发明的显著优点为在单子叶植物中抗病育种中具有重要的应用价值。本发明提供的诱导型启动子为WRKY家族转录因子结合位点顺式元件(ATCGTTGACCGAGTTGACTTTATCGTTGACCGAGTTGACTTT)与CaMV35S mini启动子-89～+1(TCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGA)序列融合，构建成单倍顺式元件和双倍顺式元件分别与CaMV35S mini启动子组成的诱导型启动子驱动microRNA393表达的植物表达载体。

附图说明

[0048] 图1为包含CaMV35S-89mini启动子的植物表达载体pBI-89的结构示意图[0049] 图2为转GUS基因水稻染色实验

[0050] 图3为中间载体p1300-DAS的结构示意图

[0051] 图4为质粒构建过程简图

[0052] 图5为转基因水稻抗病实验

具体实施方式

[0053] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0054] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0055] 实施例1、启动子的获得

[0056] 1)设计引物

[0057] 引物序列如表1：

[0058] 表1为引物序列

[0059]

[0060] 2)退火反应体系

[0061] 表2退火反应体系

[0062]

[0063] 95℃水浴5分钟，室温放置(温度降至室温25℃)加1μl DNA polymerase，2μl dNTP；37℃水浴30分钟；75℃水浴15分钟；加PstI3μl。37℃水浴2小时；氯仿抽提，沉淀，电泳检测，得到顺式元件片段(cis element)。

[0064] 3)pBI-89载体的酶切及脱磷酸化

[0065] 将上述得到的顺式元件片段(cis element)和pBI-89(The promoter of a rice glycine-rich protein gene，Osgrp-2，confers vascular-specific expression in transgenic plants.Planta.216(5)：824-33.2003，公众可从中国科学院微生物研究所获得，载体图见图1)均经PstI酶切，分别得到cis element/PstI和pBI-89/PstI；酶切体系如下表3：

[0066] 表3为酶切体系

[0067]

[0068] 37℃水浴2小时，电泳检测，加SAP脱磷15分钟，氯仿抽提，乙醇沉淀；

[0069] 4)pBI-cisE35S载体的构建

[0070] 将上述得到的cis element/PstI和pBI-89/PstI连接，连接体系如下表4：

[0071] 表4为连接体系

[0072]

[0073] 16℃连接过夜，电击转化大肠杆菌感受态，在氨苄青霉素抗性平板上筛选阳性转化子。

[0074] 将阳性转化子提取质粒送去测序，结果得到两种质粒：

[0075] 质粒1为将序列表中序列1的自5’末端第1-66位核苷酸插入pBI-89的PstI酶切位点处得到的载体，将该质粒命名为pBI-cisE35S(单顺式)，序列表中序列1的自5’末端第1-66位核苷酸即为单顺式元件，序列表中序列1的自5’末端第1-178位核苷酸为单顺式元件与35S mini启动子融合得到的新启动子1，其中35S mini启动子为序列表中序列1的自5’末端第67-178位；

[0076] 质粒2为将序列表中序列2的自5’末端第1-114位核苷酸插入pBI-89的PstI酶切位点处得到的载体，将该质粒命名为pBI-cisE35S(双顺式)，序列表中序列2的自5’末端第1-114位核苷酸即为双顺式元件，序列表中序列2的自5’末端第1-226位核苷酸为双顺式元件与35S mini启动子融合得到的新启动子2，其中35S mini启动子为序列表中序列2的自5’末端第115-226位。

[0077] 实施例2、启动子的功能验证

[0078] 一、pcisE35S-GUS转基因水稻的获得

[0079] 1、pcisE35S-GUS的构建

[0080] 将由实施例1得到的pBI-cisE35S(单顺式/双顺式)经BamHI和HindIII酶切，分别得到178bp pBI-cisE35S(单顺式)BH酶切片段和226bp pBI-cisE35S(双顺式)BH酶切片段；

[0081] 将pOsPLD3-GUS载体(水稻OsPLD3和OsPLD4基因及其启动子.生物工程学报Chin J Biotech 24(3)：368-375 2008，公众可从中国科学院微生物研究所获得)经HindIII和BamHI酶切，得到10710bp的pOsPLD3-GUS/BH酶切片段；

[0082] 上述酶切均用快速酶切法37℃酶切15分钟，75℃灭活10分钟1％琼脂糖凝胶电泳，回收pBI-cisE35S(单顺式)BH酶切片段、pBI-cisE35S(双顺式)BH酶切片段、和pOsPLD3-GUS/BH酶切片段，然后将pBI-cisE35S(单顺式)BH酶切片段和pOsPLD3-GUS/BH酶切片段16℃连接过夜，热击转化大肠杆菌，卡那霉素平板筛选，得到阳性转化子1；将pBI-cisE35S(双顺式)BH酶切片段和pOsPLD3-GUS/BH酶切片段16℃连接过夜，热击转化大肠杆菌，卡那霉素平板筛选，得到阳性转化子2；

[0083] 提取阳性转化子1和阳性转化子2的质粒，分别测序，结果为阳性转化子1的质粒为将序列表中的序列1中第1-178位核苷酸插入pOsPLD3-GUS的HindIII和BamHI酶切位点间得到的载体，命名为pcisE35S-GUS(单顺式)；

[0084] 阳性转化子2的质粒为将序列表中的序列2中第1-226位核苷酸插入pOsPLD3-GUS的HindIII和BamHI酶切位点间得到的载体，命名为pcisE35S-GUS(双顺式)。

[0085] 2、pcisE35S-GUS转基因水稻的获得

[0086] 1)、农杆菌的电击转化

[0087] (1)将 上 述 得 到 的pcisE35S-GUS( 单 顺 式 )质 粒 加 入50μl农 杆 菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105(Chia-Hui Liau et al.The sweet pepper ferredoxin-like protein pflp conferred resistance against soft rot disease in Oncidium orchid Transgenic Research 12：329-336，2003，公众可从中国科学院微生物研究所获得。)感受态细胞中，混匀；

[0088] (2)冰上放置30分钟后，电击转化，立即置于冰上2分钟；

[0089] (3)转入500ul LB培养基中，28℃，100rpm震荡培养1.5小时；

[0090] (4)菌液涂于含100μg/ml卡那霉素LB平板上，28℃倒置培养48小时。

[0091] 得到重组菌，将重组菌提取质粒送去测序，结果为质粒为pcisE35S-GUS(单顺式)，将含有该质粒的重组菌命名为EHA105/pcisE35S-GUS(单顺式)；

[0092] 采用同样的方法将pcisE35S-GUS(双顺式)转入农杆菌中，得到重组菌EHA105/pcisE35S-GUS(双顺式)，也提取质粒送去测序验证了。

[0093] 2)、水稻愈伤的农杆菌转化

[0094] 将水稻(Oryza sativa var.japonica，以下简称野生型水稻，Cheng et al.Afine physical map of the rice chromosome 5.Mol Genet Genomics.2005Nov；274(4)：337-45.2005，公众可从中国科学院微生物研究所获得。)种子脱壳灭菌，接种到愈伤诱导培养基(KNO3 2830mg/L，(NH4)2SO3 463mg/L，KH2PO4 400mg/L，MgSO4.7H2O185mg/L，CaCl2.2H2O 160mg/L，MnSO4.4H2O 10mg/L，ZnSO4.7H2O 8.6mg/L，H3BO3 6mg/L，KI0.83mg/L CuSO4.5H2O 0.025mg/L，Na2MoO4.2H2O 0.25mg/L，CoCl2.6H2O 0.025mg/L，VBl10mg/L，VB6
1mg/L，VB5 1mg/L，FeSO4.7H2O 27.8mg/L，Na2-EDTA 37.5mg/L，蔗糖30g/L，2.4-D 2mg/L，phytagel 2.6g/L，pH5.8)上，26℃暗培养3周后，从盾片处长出愈伤组织，挑选生长旺盛、比较松散的愈伤，以EHA105/pcisE35S-393(单顺式)或EHA105/pcisE35S-393(双顺式)侵染水稻愈伤，在潮霉素培养基(KNO3 2830mg/L，(NH4)2SO3463mg/L，KH2PO4 400mg/L，MgSO4.7H2O 185mg/L，CaCl2.2H2O 160mg/L，MnSO4.4H2O 10mg/L，ZnSO4.7H2O 8.6mg/L，H3BO3
6mg/L，KI 0.83mg/L CuSO4.5H2O 0.025mg/L，Na2MoO4.2H2O0.25mg/L，CoCl2.6H2O 0.025mg/L，VBl 10mg/L，VB6 1mg/L，VB5 1mg/L，FeSO4.7H2O27.8mg/L，Na2-EDTA 37.5mg/L，蔗糖
30g/L，2.4-D 2mg/L，6BA 0.5mg/L，KT 2mg/L，头孢霉素300mg/L，潮霉素50mg/L，phytagel
2.6g/L，pH5.8)上筛选抗性愈伤，转至分化培养基(KNO3 2830mg/L，(NH4)2SO3 463mg/L，KH2PO4 400mg/L，MgSO4.7H2O 185mg/L，CaCl2.2H2O 160mg/L，MnSO4.4H2O 10mg/L，ZnSO4.7H2O
8.6mg/L，H3BO3 6mg/L，KI 0.83mg/LCuSO4.5H2O 0.025mg/L，Na2MoO4.2H2O 0.25mg/L，CoCl2.6H2O 0.025mg/L，VBl 10mg/L，VB61mg/L，VB5 1mg/L，FeSO4.7H2O 27.8mg/L，Na2-EDTA
37.5mg/L，蔗糖30g/L，2.4-D2mg/L，6BA 1mg/L，NAA 0.5mg/L，KT 4mg/L，头孢霉素300mg/L，潮霉素50mg/L，phytagel2.6g/L，pH5.8)，在生根培养基(KNO3 950mg/L，(NH4)2SO3
825mg/L，KH2PO4 85mg/L，MgSO4.7H2O 185mg/L，CaCl2.2H2O 220mg/L，MnSO4.4H2O 10mg/L，ZnSO4.7H2O 8.6mg/L，H3BO3 6mg/L，KI 0.83mg/L CuSO4.5H2O 0.025mg/L，Na2MoO4.2H2O
0.25mg/L，CoCl2.6H2O0.025mg/L，VB1 10mg/L，VB6 1mg/L，VB5 1mg/L，FeSO4.7H2O 27.8mg/L，Na2-EDTA37.5mg/L，蔗 糖30g/L，phytagel 2.6g/L，pH5.8)生 根，得 到15株T0 代pcisE35S-GUS(单顺式)转基因水稻；得到10株T0代pcisE35S-GUS(双顺式)转基因水稻。

[0095] 分别提取T0代pcisE35S-GUS(单顺式)转基因水稻和T0代pcisE35S-GUS(双顺式)转基因水稻的基因组DNA为模板，分别用引物JY101/JY02进行PCR扩增；结果得304bp的PCR产物的为阳性T0代pcisE35S-GUS(单顺式)转基因水稻和结果得352bp的PCR产物的为阳性T0代pcisE35S-GUS(双顺式)转基因水稻，共得到15株阳性T0代pcisE35S-GUS(单顺式)转基因水稻和10株阳性T0代pcisE35S-GUS(双顺式)转基因水稻。

[0096] 二、启动子的功能验证

[0097] 将水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)(Liang H，Zhao YT，Zhang JQ，Wang XJ，Fang RX，Jia YT.Identification and funetional characterization of small non-coding RNAs in Xanthomonas oryzae pathovar oryzae.BMC Genomics.12：87.2011，公众可从中国科学院微生物研究所获得。)培养至OD600＝0.6，以剪叶法分别接种上述一得到的阳性T0代pcisE35S-GUS(单顺式)转基因水稻和阳性T0代pcisE35S-GUS(双顺式)转基因水稻的叶片上，2小时后进行GUS染色。染色液的组成为：
50mmol/L磷酸钠缓冲液(pH 7.0)，10mmol/L Na2EDTA(pH 8.0)，0.5mmol/L，K3[Fe(CN)6]，
0.5mmol/L K4[Fe(CN)6]，5％(V/V)甲醇，0.1％(V/V)TritonX-100，1.5mmol/L X-Gluc。在
37℃下染色后75％乙醇脱色，观察结果并拍照。以野生型水稻为对照。

[0098] 结果如图2所示，1-2均为阳性T0代pcisE35S-GUS(单顺式)转基因水稻，3-4均为阳性T0代pcisE35S-GUS(双顺式)转基因水稻，可以看出，1-4的转基因水稻均在水稻叶片接菌处出现蓝色，说明序列表中的序列1中第1-178位和序列表中的序列2中第1-226位为启动子，且说明构建的启动子受病原诱导表达。

[0099] 实施例3、含有诱导型启动子驱动microRNA393基因的载体构建

[0100] 制备序列1和序列2，其中，序列1的自5’末端第1-66位为单顺式元件，第67-178位为35S启动子；第179-316位为microRNA393基因；序列2的自5’末端第1-114位为双顺式元件，第115-226位为35S启动子；第227-364位为microRNA393基因。microRNA393的序列为序列表中的序列3。

[0101] 制备含有诱导型启动子驱动microRNA393基因的载体pcisE35S-393(单顺式)：为将序列表中的序列1插入1300-DAS(水稻OsPLD3和OsPLD4基因及其启动子.生物工程学报Chin J Biotech 24(3)：368-3752008，公众可从中国科学院微生物研究所获得，载体结构示意图如图3所示)的HindIII和EcoRI酶切位点间得到的载体；

[0102] 制备含有诱导型启动子驱动microRNA393基因的载体pcisE35S-393(双顺式)：为将序列表中的序列2插入1300-DAS的HindIII和EcoRI酶切位点间得到的载体；

[0103] 上述载体的制备方法具体如下，构建流程图如图4所示：

[0104] 1、microRNA393基因的获得

[0105] 1)基因组DNA的获得

[0106] (1)取适量水稻(Oryza sativa var.japonica)叶片，用剪刀剪细碎，放入带瓷珠和石英砂的离心管中研成粉末状。

[0107] (2)离心管内加入1ml提取缓冲液(0.1M Tris-HCl pH8.0，50mM EDTA pH8.0，0.5M NaCl，1.25％SDS，β-巯基乙醇1.5ml/L)，65℃水浴30min。

[0108] (3)加入0.375ml 5M KAc，轻轻颠倒混匀，冰上放置20min，4℃，12000rpm离心5min。

[0109] (4)将上清转入另一干净离心管中，加入0.3ml氯仿，轻轻颠倒混匀，10000rpm离心10min，取上清移于新的离心管中。

[0110] (5)加入0.5ml异丙醇，轻轻颠倒混匀，4℃10000rpm离心10min，弃上清，70％乙醇洗涤，倒置离心管于干净滤纸上，室温晾干。

[0111] (7)将沉淀重悬于50μl无菌水中，-20℃冰箱保存，得到基因组DNA。

[0112] 2)水稻基因microRNA393的PCR扩增

[0113] 引物序列如下表5：

[0114] 表5为microRNA393的扩增引物

[0115]

[0116] PCR反应体系如表6：

[0117] 表6为PCR反应体系

[0118]

[0119] PCR扩增程序为：94℃预变性2min；94℃30s，52℃30s，68℃30s，进行30个循环后；72℃延伸5min，4℃保存。反应完成后，在1％琼脂糖凝胶中电泳观察。

[0120] 得到148bp的PCR产物。

[0121] 3)pGEM-T-393载体的构建

[0122] 将上述PCR产物与pGEM-T vector连接(连接体系如表7)，16℃连接过夜，电击转化大肠杆菌感受态，得到转化子，提取转化子的质粒，送去测序，结果为该PCR产物为序列表中序列1自5’末端第1-144位(包括microRNA393的编码基因第7-138位)核苷酸或序列表中序列2自5’末端第1-144位(包括microRNA393的编码基因第7-138位)核苷酸，将含有该PCR产物的质粒命名为pGEM-T-393载体。

[0123] 表7为连接体系

[0124]

[0125] 2、pcisE35S-393的构建

[0126] 将由实施例1得到的PBI-cisE35S(单顺式/双顺式)经BamHI和HindIII酶切，分别得到178bp pBI-cisE35S(单顺式)BH酶切片段和226bp pBI-cisE35S(双顺式)BH酶切片段；

[0127] 将上述1得到的pGEM-T-393载体经BamHI和EcoRI酶切，得到144bp的pGEM-T-393/BE酶切片段；

[0128] 将1300-DAS载体经HindIII和EcoRI酶切，得到8901bp 1300-DAS/HE酶切片段；

[0129] 上述酶切均用快速酶切法37℃酶切15分钟，75℃灭活10分钟1％琼脂糖凝胶电泳，回收pBI-cisE35S(单顺式)BH酶切片段、pBI-cisE35S(双顺式)BH酶切片段、pGEM-T-393/BE酶切片段和1300-DAS/HE酶切片段，

[0130] 然后将pBI-cisE35S(单顺式)BH酶切片段、pGEM-T-393/BE酶切片段和1300-DAS/HE酶切片段16℃连接过夜，热击转化大肠杆菌，卡那霉素平板筛选，得到阳性转化子1；将pBI-cisE35S(双顺式)BH酶切片段、pGEM-T-393/BE酶切片段和1300-DAS/HE酶切片段16℃连接过夜，热击转化大肠杆菌，卡那霉素平板筛选，得到阳性转化子2；

[0131] 提取阳性转化子1和阳性转化子2的质粒，分别测序，结果为阳性转化子1的质粒为将序列表中的序列1(单顺式原件+35S启动子+393)插入1300-DAS的HindIII和EcoRI酶切位点间得到的载体，命名为pcisE35S-393(单顺式)；

[0132] 阳性转化子2的质粒为将序列表中的序列2(双顺式原件+35S启动子+393)插入1300-DAS的HindIII和EcoRI酶切位点间得到的载体，命名为pcisE35S-393(双顺式)。

[0133] 按照如下表8所示的体系进行酶切和表9所示的体系连接：

[0134] 表8为酶切体系

[0135]

[0136] 表9为pcisE35S-393连接体系

[0137]

[0138] 实施例4、诱导型启动子驱动microRNA393基因在转基因植物中的应用[0139] 一、培育转基因植物

[0140] 1、农杆菌的电击转化

[0141] (1)将由实施例3得到的pcisE35S-393(单顺式)质粒加入50μl农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105感受态细胞中，混匀；

[0142] (2)冰上放置30分钟后，电击转化，立即置于冰上2分钟；

[0143] (3)转入500ul LB培养基中，28℃，100rpm震荡培养1.5小时；

[0144] (4)菌液涂于含100μg/ml卡那霉素LB平板上，28℃倒置培养48小时。

[0145] 得到重组菌，将重组菌提取质粒送去测序，结果为质粒为pcisE35S-393(单顺式)，将含有该质粒的重组菌命名为EHA105/pcisE35S-393(单顺式)；

[0146] 采用同样的方法将pcisE35S-393(双顺式)转入农杆菌中，得到重组菌EHA105/pcisE35S-393(双顺式)，也提取质粒送去测序验证了。

[0147] 2、水稻愈伤的农杆菌转化

[0148] 方法同上述实施例2，得到30株T0代转393(单顺式)水稻和25株T0代转393(双顺式)水稻。

[0149] 分别提取T0代转393(单顺式)水稻和T0代转393(双顺式)水稻的基因组DNA为模板，分别用引物JY101/JY02进行PCR扩增；分别以pcisE35S-393(单顺式)和pcisE35S-393(双顺式)为PCR阳性对照。

[0150] 结果得304bp的PCR产物的为阳性T0代转393(单顺式)水稻和结果得352bp的PCR产物的为阳性阳性T0代转393(双顺式)水稻，共得到28株阳性T0代转393(单顺式)水稻和25株阳性T0代转393(双顺式)水稻。

[0151] 二、转基因水稻抗病性实验

[0152] 将上述得到的阳性T0代转393(单顺式)水稻和阳性T0代转393(双顺式)水稻种植于温室中，将水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)培养至OD600＝0.6，以剪叶法分别接种水稻叶片，接菌10天后观察抗病情况；以由实施例2得到的阳性T0代pcisE35S-GUS(单顺式)转基因水稻、阳性T0代pcisE35S-GUS(双顺式)转基因水稻和野生型水稻作为阴性对照。

[0153] 结果如图5所示，其中1为阴性对照(阳性T0代pcisE35S-GUS(单顺式)转基因水稻)，2为阳性T0代转393(单顺式)水稻，3为阳性T0代转393(双顺式)水稻；从表型可以看出，与阴性对照相比，阳性T0代转393(单顺式)水稻和阳性T0代转393(双顺式)水稻较对照叶片枯萎程度减轻，说明miR393基因对白叶枯病菌具有一定的抗性，可以看出阳性T0代转393(单顺式)水稻和阳性T0代转393(双顺式)水稻对白叶枯病菌的抗性高于阴性对照。阳性T0代pcisE35S-GUS(单顺式)转基因水稻、阳性T0代pcisE35S-GUS(双顺式)转基因水稻和野生型水稻的结果无显著差异。

[0154] 测量每个株系的水稻叶片枯萎部分的长度，并进行统计学t检验，每个株系10株共检测15片叶片，实验重复三次，结果取平均值。

[0155] 结果如下：

[0156] 阴性对照(阳性T0代pcisE35S-GUS(单顺式)转基因水稻)的叶片枯萎部分的长度为平均值9.72cm；

[0157] 阳性T0代转393(单顺式)水稻的叶片枯萎部分的长度为平均值7.93cm；

[0158] 阳性T0代转393(双顺式)水稻的叶片枯萎部分的长度为平均值6.97cm。

[0159] 阳性T0代pcisE35S-GUS(单顺式)转基因水稻、阳性T0代pcisE35S-GUS(双顺式)转基因水稻和野生型水稻的结果无显著差异。

[0160] 从上述也可以看成，与阴性对照相比，阳性T0代转393(单顺式)水稻和阳性T0代转393(双顺式)水稻较对照叶片枯萎程度减轻，说明miR393基因在诱导启动子的作用下对白叶枯病菌具有一定的抗性。