树状多节孢内生真菌HDFS4-26生物发酵合成紫杉醇及其前体物的分离与纯化方法，它涉及分离与纯化的方法。它为了现有内生真菌生物发酵合成紫杉醇的方法存在发酵液中紫杉醇含量低，紫杉醇前体物回收率低和纯度低的问题。方法：一、菌株活化及种子培养；二、发酵培养；三、分离发酵液和菌丝体并回收，发酵液脱色，萃取，浓缩，得样品；四、一次层析；五、二次层析；六、反相色谱分离，即完成。本发明发酵液中紫杉醇含量为556.80μg/L，紫杉醇纯度为98％，前体物巴卡亭Ⅲ纯度为97％、三尖杉宁碱纯度为98％；本发明工艺具有操作流程简单、产物纯度高、溶剂使用量小的特点；同时，间接的降低了紫杉醇的生产成本。
1.树状多节孢HDFS4-26生物发酵合成紫杉醇及其前体物巴卡亭Ⅲ和三尖杉宁碱的分离与纯化方法，其中树状多节孢(Nodulisporium sylviforme)HDFS4-26，在中国专利“紫杉醇基因组重排菌株HDFS4-26”中己公开，其菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2008.2.28，保藏号为CCTCC M:208026；其特征在于它按以下步骤实现：一、菌株活化及种子培养：将树状多节孢HDFS4-26接种于PDA斜面培养基上，在28℃的条件下活化2～3d，然后将活化后的树状多节孢HDFS4-26接于PDA液体培养基中，在
28℃、120r/min摇床培养3d，获得种子培养液；
二、发酵培养：将种子培养液以体积比5％的接种量转入改良的S-7液体培养基中，在
28℃、120r/min发酵培养12d，其中在发酵培养的第4d补加4g/L的蔗糖和3mL/L的维生素浓缩液，在发酵培养的第6d补加0.4g/L的蛋白胨和0.2mL/L的豆饼水解液，在发酵培养的第7d补加2g/L的蔗糖和20mg/L的肉桂酸，在发酵培养的第9d补加28ug/L的两性霉素B；
三、步骤二发酵结束后，分离发酵液和菌丝体并回收，用石油醚对发酵液脱色两次，然后加入等体积的乙酸乙酯和甲醇混合液萃取过夜，分出有机相，再次加入等体积的乙酸乙酯和甲醇混合液萃取过夜，分出有机相，然后合并有机相，再用旋转蒸发仪除去乙酸乙酯和甲醇，至剩下5mL溶液，将溶液倒入平皿中晾干，获得样品；
四、一次层析：将样品按质量体积比1:10溶解在氯仿中，加入5倍量的硅藻土，拌匀后自然风干，装柱后，依次用氯仿、氯仿:甲醇＝98:2、氯仿:甲醇＝87:3、氯仿:甲醇＝90:10和氯仿:甲醇＝60:40进行洗脱，TLC检测，合并含目标产物紫杉醇的馏份，蒸干后，按8mL/g比例溶解在甲醇中，水浴加热到50℃，同时，在搅拌的情况下滴入三分之一甲醇体积的双蒸水，冷却48～72h，获得一次结晶样品；
五、二次层析：色谱柱的长径比在8:1以上，干法装柱，固定相硅胶和一次结晶样品的质量比为30:1，洗脱模式为首先用3倍柱床体积的己烷/乙酸乙酯溶液，己烷/乙酸乙酯溶液体积比60:40进行洗脱；然后，用2倍柱床体积的己烷/乙酸乙酯溶液，己烷/乙酸乙酯溶液体积比55:45进行洗脱；最后，用5倍柱床体积的己烷/乙酸乙酯溶液，己烷/乙酸乙酯溶液体积比50:50进行洗脱；TLC检测，合并含目标产物紫杉醇的馏份，蒸干后，按8mL/g比例溶解在甲醇中，水浴加热到50℃，同时，在搅拌的情况下滴入三分之一甲醇体积的双蒸水，冷却48～72h，获得二次结晶样品；
六、反相色谱分离：以PRP-6树脂为固定相，柱体成型后分别用2BV丙酮、乙酸乙酯、丙酮、20％丙酮-水进行平衡，加入二次结晶样品后，依次用体积含量为20％的丙酮-水体系、体积含量为40％的丙酮-水体系、体积含量为45％的丙酮-水体系，体积含量为50％的丙酮-水体系、体积含量为55％的丙酮-水体系、体积含量为60％的丙酮-水体系和丙酮体系进行梯度洗脱，TLC检测，合并相同馏分，浓缩，结晶，即完成树状多节孢HDFS4-26发酵产紫杉醇及其前体物巴卡亭Ⅲ和三尖杉宁碱的分离与纯化；步骤二中维生素浓缩液每100mL由15mg酪氨酸、50mg苯丙氨酸、10mg VB6、10mg VB1、10mg VH、10mg泛酸钙、10mg亚油酸和余量的蒸馏水组成。
树状多节孢内生真菌HDFS4-26生物发酵合成紫杉醇及其
前体物的分离与纯化方法
技术领域
[0001] 本发明涉及树状多节孢内生真菌HDFS4-26生物发酵合成紫杉醇及其前体物的分离与纯化方法。
背景技术
[0002] 恶性肿瘤严重地威胁着人类的健康，且癌症是目前人类疾病中仅次于心脑血管疾患的第二大死因。
[0003] 紫杉醇是从红豆杉属植物中提取出来的具有多种抗肿瘤疗效的二萜生物碱类药物。由于红豆杉（又名紫杉）是珍稀树种，生长速度缓慢，并且其生物学特性对生态环境要求较高，天然更新能力差，所以种群数量极为有限，属濒危保护植物，资源十分有限。因此，国内外学者在研究与开发紫杉醇新药源的问题上做出了多方面努力。
[0004] 紫杉醇独特的抗癌活性已被世界认可，而其天然资源红豆杉树匮乏及限制采集措施的施行，势必导致对紫杉醇及其类似物的新资源和替代资源进行研究。微生物发酵法生产紫杉醇是降低生产成本、大量获取紫杉醇的最有前景的方法之一。
[0005] 利用微生物发酵生产紫杉醇具有下列优点：
[0006] （1）微生物作为工业生产的源泉，可以在发酵罐中进行，可以源源不尽的进行生产；
[0007] （2）微生物发酵的方法容易扩大化，利于工业化生产；
[0008] （3）微生物的生长仅仅需要一般的培养技术，在收集紫杉醇之前，可以通过改善培养环境、改进技术来提高产量；
[0009] （4）微生物易于通过基因工程等方法筛选高产菌株，提高紫杉醇的产量；
[0010] （5）内生真菌生长迅速，易于培养，应用的培养基相对比较便宜；
[0011] （6）可望满足市场的需求，降低紫杉醇的价格。植物内生真菌是一类应用前景广阔的资源微生物，用微生物发酵的方法生产紫杉醇，是解决药源问题的有效途径。
[0012] 但是，目前内生真菌生物发酵合成紫杉醇的方法存在发酵液中紫杉醇含量低，紫杉醇前体物回收率低和纯度低的问题。
发明内容
[0013] 本发明目的是解决现有内生真菌生物发酵合成紫杉醇的方法存在发酵液中紫杉醇含量低，紫杉醇前体物回收率低和纯度低的问题，而提供树状多节孢内生真菌HDFS4-26生物发酵合成紫杉醇及其前体物的分离与纯化方法。
[0014] 树状多节孢内生真菌HDFS4-26生物发酵合成紫杉醇及其前体物的分离与纯化方法，按以下步骤实现：
[0015] 一、菌株活化及种子培养：将树状多节孢HDFS4-26接种于PDA斜面培养基上，在28℃的条件下活化2～3d，然后将活化后的树状多节孢HDFS4-26接于PDA液体培养基中，在28℃、120r/min摇床培养3d，获得种子培养液；
[0016] 二、发酵培养：将种子培养液以体积比5%的接种量转入改良的S-7液体培养基中，在28℃、120r/min发酵培养12d，其中在发酵培养的第4d补加4g/L的蔗糖和3mL/L的维生素浓缩液，在发酵培养的第6d补加0.4g/L的蛋白胨和0.2mL/L的豆饼水解液，在发酵培养的第7d补加2g/L的蔗糖和20mg/L的肉桂酸，在发酵培养的第9d补加28μg/L的两性霉素B；
[0017] 三、步骤二发酵结束后，分离发酵液和菌丝体并回收，用石油醚对发酵液脱色两次，然后加入等体积的乙酸乙酯和甲醇混合液萃取过夜，分出有机相，再次加入等体积的乙酸乙酯和甲醇混合液萃取过夜，分出有机相，然后合并有机相，再用旋转蒸发仪除去乙酸乙酯和甲醇，至剩下5mL溶液，将溶液倒入平皿中晾干，获得样品；
[0018] 四、一次层析：将样品按质量体积比1:10溶解在氯仿中，加入5倍量的硅藻土，拌匀后自然风干，装柱后，依次用氯仿、氯仿:甲醇=98:2、氯仿:甲醇=87:3、氯仿:甲醇=90:10和氯仿:甲醇=60:40进行洗脱，TLC检测，合并含目标产物紫杉醇的馏份，蒸干后，按8mL/g比例溶解在甲醇中，水浴加热到50℃，同时，在搅拌的情况下滴入三分之一甲醇体积的双蒸水，冷却48～72h，获得一次结晶样品；
[0019] 五、二次层析：色谱柱的长径比在8:1以上，干法装柱，固定相硅胶和一次结晶样品的质量比为30:l，洗脱模式为己烷/乙酸乙酯60/40（3BV）-55/45（2BV）-50/50（5BV），TLC检测，合并含目标产物紫杉醇的馏份，蒸干后，按8mL/g比例溶解在甲醇中，水浴加热到50℃，同时，在搅拌的情况下滴入三分之一甲醇体积的双蒸水，冷却48～72h，获得二次结晶样品；
[0020] 六、反相色谱分离：以PRP-6树脂（聚苯乙烯-二乙烯基苯多孔微球）为固定相，柱体成型后分别用2BV丙酮、乙酸乙酯、丙酮、20%丙酮-水进行平衡，加入二次结晶样品后，依次用体积含量为20%的丙酮-水体系、体积含量为40%的丙酮-水体系、体积含量为45%的丙酮-水体系、体积含量为50%的丙酮-水体系、体积含量为55%的丙酮-水体系、体积含量为60%的丙酮-水体系和丙酮体系进行梯度洗脱，TLC检测，合并相同馏分，浓缩，结晶，即完成树状多节孢内生真菌HDFS4-26生物发酵合成紫杉醇及其前体物的分离与纯化方法；
[0021] 其中步骤三中乙酸乙酯和甲醇混合液按照体积比1:1混合。
[0022] 本发明中树状多节孢内生真菌HDFS4-26生物发酵合成紫杉醇的方法，发酵液中紫杉醇含量为556.80μg/L，紫杉醇纯度为98%，前体物巴卡亭Ⅲ纯度为97%、三尖杉宁碱纯度为98%。
[0023] 本发明紫杉醇及其前体物分离与纯化方法具有操作流程简单、产物纯度高、溶剂使用量小的特点；同时，为利用化学合成紫杉醇提供了前体物质，可以间接的降低了紫杉醇的生产成本，尽早实现紫杉醇的工业化生产。
附图说明
[0024] 图1为紫杉醇的化学结构图；
[0025] 图2为紫杉醇的ESI-MS图谱；
[0026] 图3为紫杉醇的1H-NMR图谱；
[0027] 图4为紫杉醇的13C-NMR图谱；
[0028] 图5为巴卡亭Ⅲ的化学结构图；
[0029] 图6为巴卡亭Ⅲ的ESI-MS图谱；
[0030] 图7为巴卡亭Ⅲ的1H-NMR图谱；
[0031] 图8为巴卡亭Ⅲ的13C-NMR图谱；
[0032] 图9为三尖杉宁碱的化学结构图；
[0033] 图10为三尖杉宁碱的ESI-MS图谱；
[0034] 图11为三尖杉宁碱的1H-NMR图谱；
[0035] 图12为三尖杉宁碱的13C-NMR图谱。
具体实施方式
[0036] 本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
[0037] 具体实施方式一：本实施方式树状多节孢内生真菌HDFS4-26生物发酵合成紫杉醇及其前体物的分离与纯化方法，按以下步骤实现：
[0038] 一、菌株活化及种子培养：将树状多节孢HDFS4-26接种于PDA斜面培养基上，在28℃的条件下活化2～3d，然后将活化后的树状多节孢HDFS4-26接于PDA液体培养基中，在28℃、120r/min摇床培养3d，获得种子培养液；
[0039] 二、发酵培养：将种子培养液以体积比5%的接种量转入改良的S-7液体培养基中，在28℃、120r/min发酵培养12d，其中在发酵培养的第4d补加4g/L的蔗糖和3mL/L的维生素浓缩液，在发酵培养的第6d补加0.4g/L的蛋白胨和0.2mL/L的豆饼水解液，在发酵培养的第7d补加2g/L的蔗糖和20mg/L的肉桂酸，在发酵培养的第9d补加28μg/L的两性霉素B；
[0040] 三、步骤二发酵结束后，分离发酵液和菌丝体并回收，用石油醚对发酵液脱色两次，然后加入等体积的乙酸乙酯和甲醇混合液萃取过夜，分出有机相，再次加入等体积的乙酸乙酯和甲醇混合液萃取过夜，分出有机相，然后合并有机相，再用旋转蒸发仪除去乙酸乙酯和甲醇，至剩下5mL溶液，将溶液倒入平皿中晾干，获得样品；
[0041] 四、一次层析：将样品按质量体积比1:10溶解在氯仿中，加入5倍量的硅藻土，拌匀后自然风干，装柱后，依次用氯仿、氯仿:甲醇=98:2、氯仿:甲醇=87:3、氯仿:甲醇=90:10和氯仿:甲醇=60:40进行洗脱，TLC检测，合并含目标产物紫杉醇的馏份，蒸干后，按8mL/g比例溶解在甲醇中，水浴加热到50℃，同时，在搅拌的情况下滴入三分之一甲醇体积的双蒸水，冷却48～72h，获得一次结晶样品；
[0042] 五、二次层析：色谱柱的长径比在8:1以上，干法装柱，固定相硅胶和一次结晶样品的质量比为30:l，洗脱模式为己烷/乙酸乙酯60/40（3BV）-55/45（2BV）-50/50（5BV），TLC检测，合并含目标产物紫杉醇的馏份，蒸干后，按8mL/g比例溶解在甲醇中，水浴加热到50℃，同时，在搅拌的情况下滴入三分之一甲醇体积的双蒸水，冷却48～72h，获得二次结晶样品；
[0043] 六、反相色谱分离：以PRP-6树脂（聚苯乙烯-二乙烯基苯多孔微球）为固定相，柱体成型后分别用2BV丙酮、乙酸乙酯、丙酮、20%丙酮-水进行平衡，加入二次结晶样品后，依次用体积含量为20%的丙酮-水体系、体积含量为40%的丙酮-水体系、体积含量为45%的丙酮-水体系、体积含量为50%的丙酮-水体系、体积含量为55%的丙酮-水体系、体积含量为60%的丙酮-水体系和丙酮体系进行梯度洗脱，TLC检测，合并相同馏分，浓缩，结晶，即完成树状多节孢内生真菌HDFS4-26生物发酵合成紫杉醇及其前体物的分离与纯化方法；
[0044] 其中步骤三中乙酸乙酯和甲醇混合液按照体积比1:1混合。
[0045] 本实施方式步骤一中树状多节孢（Nodulisporium sylviforme）HDFS4-26，在中国专利“紫杉醇基因组重排菌株HDFS4-26（专利号ZL200810064048.3，申请日2008.2.29）”中已公开，其菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2008.2.28，保藏号为CCTCC M:208026。
[0046] 本实施方式步骤二中改良的S-7液体培养基，是在1993年Strobel原S-7培养基基础上将苯丙氨酸、酪氨酸、亚油酸增至终浓度1.5～5.0mg/L制成。
[0047] 本实施方式步骤四中加入5倍量的硅藻土是以浸膏样品（即样品和氯仿的总质量）质量为基准。
[0048] 本实施方式中一次结晶样品为针状晶体，二次结晶体系为甲醇/水。
[0049] 本实施方式步骤四中所得紫杉醇纯度可达50%～70%，回收率95%以上。将一次结晶后母液用乙酸乙酯进行萃取，脱水蒸干，并且与下一批物料累积循环处理，可进一步提高总收率。
[0050] 本实施方式步骤五中二次结晶可以使紫杉醇纯度达到98.5%以上，回收率95%以上，如果需要进一步提高纯度，可用甲醇/水体系再结晶一次。
[0051] 本实施方式步骤六中所得结晶，通过HPLC、MS、1H-NMR和13C-NMR确定结构：HPLC检测，色谱柱：Dikma Diamonsil C18（250×4.6mm i.d.,5μm），流动相:乙腈∶水=45∶55（v∶v）；柱温：30℃；检测波长：227nm;进样量：20μL；流速：10mL/min。紫杉醇标准品浓1 13
度为100μg/mL（购自Sigma公司）。NMR分析：样品用三氯甲烷溶解，测定 H NMR和 C NMR谱图。
[0052] 紫杉醇，白色粉末状固体（化学结构见图1），熔点213-216℃，ESI-MS m/z：854处+ + 1可见[M+H] 离子峰、876处可见[M+Na]，分子式为C47H51NO14,分子量为853；ESI-MS、H-NMR
13
和 C-NMR图谱分别见图2-4。
[0053] 巴卡亭Ⅲ（Baccatin III），白色针状结晶（化学结构见图5），熔点223-225℃，+ +ESI-MSm/z：587处可见[M+H] 离子峰、609处可见[M+Na]，分子式为C31H38O11，分子量为
1 13
586。ESI-MS、H-NMR和 C-NMR图谱分别见图6-8。
[0054] 三尖杉宁碱（Cephalomannine），白色粉末（化学结构见图9），熔点240-242℃，+ +ESI-Msm/z：832处可见[M+H]、609处可见[M+Na]，分子式为C45H53NO14，分子量为831。
1 13
ESI-MS、H-NMR和 C-NMR图谱分别见图10-12。
[0055] 具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是，步骤二中维生素浓缩液每100mL由15mg酪氨酸、50mg苯丙氨酸、10mg VB6、10mg VB1、10mg VH、10mg泛酸钙、10mg亚油酸和余量的蒸馏水组成。其它与具体实施方式一相同。
