一种高效液相色谱法测定丙戊酸体液浓度过程中的衍生化方法

摘要

本发明涉及一种高效液相色谱法测定丙戊酸体液浓度过程中的衍生化方法，该方法选用氢氧化季铵盐乙腈溶液（四甲基氢氧化铵乙腈溶液或四丁基氢氧化铵乙腈溶液或四乙基氢氧化铵乙腈溶液）代替三乙胺催化丙戊酸与衍生剂（2，4′-二溴苯乙酮乙腈溶液、α-溴苯乙酮乙腈溶液、2-溴-对硝基苯乙酮乙腈溶液或4-溴-7-甲氧基香豆素乙腈溶液）衍生化成为可紫外检测的苯酯，只需要反应物摩尔倍数3-5倍量的衍生剂，即可达到95%以上的衍生化产率。具有的优点为：衍生化反应完全，色谱图基线平稳，无内源性杂质干扰，测定结果准确，精密度好，灵敏度高，衍生化剂用量少，不易使色谱柱压力增大，有利于延长色谱柱使用寿命。

权利要求

1.一种高效液相色谱法测定丙戊酸体液浓度过程中的衍生化方法，其特征在于：包括以下步骤：精密取50-100μL质控或病人血清，加入0.1-0.2μg/μL内标溶液40-80μL，再加入2-3mol/L硫酸溶液50-70μL，混匀，加入2-4mL乙醚涡旋提取1-3min，在3000-4000 r/min条件下离心分离5-10min，吸取上清液，加入10mmol/L催化剂氢氧化季铵盐乙腈溶液30-110μL，涡旋混匀，再加入反应物摩尔倍数3-7倍的衍生剂，根据需要加入适量的乙腈，使反应溶液中乙腈的总体积达到140-160μL，涡旋混匀，在50-60℃水浴反应20-40分钟，提高水浴温度至65-70℃挥干有机相，衍生化反应结束；所述的催化剂氢氧化季铵盐乙腈溶液为四甲基氢氧化铵乙腈溶液或四丁基氢氧化铵乙腈溶液或四乙基氢氧化铵乙腈溶液；所述的内标溶液为壬酸溶液、环己基丙酸溶液、辛酸溶液或癸酸溶液；所述的衍生剂为

2，4′-二溴苯乙酮乙腈溶液、α-溴苯乙酮乙腈溶液、2-溴-对硝基苯乙酮乙腈溶液或

4-溴-7-甲氧基香豆素乙腈溶液。

2.根据权利要求1一种高效液相色谱法测定丙戊酸体液浓度过程中的衍生化方法，其特征在于：所述的催化剂为四甲基氢氧化铵乙腈溶液，其加入量为10mmol/L四甲基氢氧化铵乙腈溶液90-110μL。

3.根据权利要求1一种高效液相色谱法测定丙戊酸体液浓度过程中的衍生化方法，其特征在于：所述的催化剂为四丁基氢氧化铵乙腈溶液，其加入量为10mmol/L四丁基氢氧化铵乙腈溶液30-60μL。

4.根据权利要求1、2或3一种高效液相色谱法测定丙戊酸体液浓度过程中的衍生化方法，其特征在于：所述的反应物是指血清中的高浓度丙戊酸和内标溶液中的内标物，所述的高浓度的丙戊酸是按浓度为120-200μg/mL的丙戊酸计。

5.根据权利要求4一种高效液相色谱法测定丙戊酸体液浓度过程中的衍生化方法，其特征在于：所述的加入的衍生剂与反应物的摩尔比为5倍。

6.根据权利要求1、2或3一种高效液相色谱法测定丙戊酸体液浓度过程中的衍生化方法，其特征在于：所述的质控或病人血清中丙戊酸浓度为1-200μg/mL。

7.根据权利要求4一种高效液相色谱法测定丙戊酸体液浓度过程中的衍生化方法，其特征在于：所述的质控或病人血清中丙戊酸浓度为1-200μg/mL。

说明书

一种高效液相色谱法测定丙戊酸体液浓度过程中的衍生化

方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种高效液相色谱法测定丙戊酸体液浓度过程中的衍生化方法。

背景技术

[0002] 丙戊酸是一种最常用的广谱抗癫痫药，其治疗浓度范围窄，个体差异大，治疗过程中须监测血药浓度，通过个体化用药，提高癫痫病控制率、减少不良反应。

[0003] 监测丙戊酸血药浓度常常使用HPLC法（高效液相色谱法），而用HPLC法常需把丙戊酸衍生化成具有紫外吸收或能发荧光的酯类。常用的衍生化方法是使用三乙胺作催化剂，催化丙戊酸与α-溴苯乙酮、2，4′-二溴苯乙酮、2-溴-对硝基苯乙酮或4-溴-7-甲氧基香豆素等进行衍生化反应，为了提高衍生化效率，常常需要加入过量的衍生化剂，但长期使用过量的衍生化剂（＞400μg）易使色谱柱压力过大，柱效下降，缩短色谱柱寿命。

[0004] 例如下述2篇文献均是采用三乙胺作催化剂，催化丙戊酸与衍生剂进行衍生化反应。

[0005] 1、冯惠平，王璟，陈宜峰等的“柱前衍生-高效液相色谱法测定人血清中丙戊酸钠浓度”。

[0006] 色谱条件：Agilent HC-C18色谱柱(5μm，4.6×250mm)，流动相：甲醇-水(73：27)；流速：1mL/min，柱温：40℃；紫外检测波长：262nm；进样量为20μL。

[0007] 样品处理方法：精密量取血清样品0.1mL，置具塞试管中，加入环己烷羧酸内标液50μL(200μg/mL)，1.0mol/L的硫酸l00μL，涡旋振荡30s，加正戊烷2mL，涡旋振荡3min，离心5min(5500r/min)，精密吸取上层有机相1.0mL，加ω-溴苯乙酮10μL（10.3mg/mL），加三乙胺10μL，涡旋振荡30s，置50℃-55℃水浴中衍生化反应10min，并挥干有机相，残渣中加入甲醇200μL，涡旋振荡30s，离心3min(5500r/min)，取20μL进样。

[0008] 结果：在10.1～182.2μg/mL范围内，丙戊酸和内标环己烷羧酸衍生物的峰面积比与浓度呈良好的线性关系（r=0.9997），平均回收率98.4-99.8%，日内和日间RSD≤5.9%。最低定量浓度为10.1μg/mL。

[0009] 不足：当血清丙戊酸浓度为182.2μg/mL时，1.0mL上层有机相中含丙戊酸0.063μmol,内标环己烷羧酸0.039μmol，加入的衍生化剂ω-溴苯乙酮0.52μmol，即衍生化剂与反应物的摩尔数比为5.1倍，反应不完全，方法灵敏度低，重复性不好。

[0010] 2、Zhuo-jia Chen,Xue-ding Wang,Hong-sheng Wang 等 的“Simultaneous determination of valproic acid and2-propyl-4-pentenoic acid for the prediction of clinical adverse effects in Chinese patients with epilepsy”（同时测定中国癫痫病人的丙戊酸和2-丙基-4-戊烯酸血清浓度，预测丙戊酸的副作用）。

[0011] 色谱条件：C18色谱柱(5μm，4.6×150mm)，流动相：甲醇-水(76：24)，流速：1mL/min；紫外检测波长：254nm；进样量为20μL。

[0012] 样品处理方法：取质控血清和病人血清各140μL分置于10mL具塞离心试管内，加乙腈100μL，1.0mol/L的硫酸l00μL和1mg/mL.内标（辛酸）溶液20μL混匀后，加1.5mL乙酸乙酯混旋5min、离心(4000r/min)10min。吸取上述上层有机相于10mL具塞离心试管内，加三乙胺10μL，混匀后加12mg/mL衍生试剂2，4′-二溴苯乙酮50μL（600μg，6.5倍），密塞后置70℃水浴上保温40min，去塞后氮气吹干，100μL流动相溶解残余物，10μL进样分析。

[0013] 结果：在5–200μg/mL范围内，丙戊酸衍生物和内标的峰面积比与浓度呈良好的线性关系，r=0.9998，平均回收率101.3-104.5%，日内和日间RSD≤5.1%。其最低检测浓度-1为5.0μg·mL 。

[0014] 不足：当血清丙戊酸浓度为200μg/mL时，上层有机相中含丙戊酸0.19μmol,内标辛酸0.14μmol，加入的衍生化剂2，4′-二溴苯乙酮2.16μmol，剂衍生化剂与反应物的摩尔数比为6.5倍，反应不完全，方法灵敏度低，重复性不好。衍生化剂2，4′-二溴苯乙酮用量过大（＞400μg），降低了方法学的检测灵敏度，长期重复使用，易使色谱柱压力过大，可使柱效下降，缩短色谱柱寿命。

[0015] 综上所述，三乙胺催化丙戊酸衍生反应的效率不高，通常需要反应物摩尔倍数9-11倍以上的衍生剂才能把丙戊酸完全衍生化。但过量的衍生剂容易造成HPLC分析基线不平，降低了方法学的灵敏度；长期重复使用过量的衍生化剂（＞400μg）易使色谱柱压力过大，柱效下降，缩短色谱柱寿命。

发明内容

[0016] 本发明要解决的技术问题是：提供一种选用氢氧化季铵盐乙腈溶液作为催化剂的衍生化方法，用于衍生化-HPLC法测定丙戊酸体液浓度，该方法只需要反应物摩尔倍数3-5倍的衍生剂就能把丙戊酸完全衍生化，从而提高HPLC法测定丙戊酸血药浓度的灵敏度、准确度、精密度和重现性，干扰少，可延长色谱柱使用寿命。

[0017] 解决上述技术问题的技术方案是：一种高效液相色谱法测定丙戊酸体液浓度过程中的衍生化方法，包括以下步骤：精密取50-100μL质控或病人血清，加入0.1-0.2μg/μL内标溶液40-80μL，再加入2-3mol/L硫酸溶液50-70μL，混匀，加入2-4mL乙醚涡旋提取1-3min，在3000-4000r/min条件下离心分离5-10min，吸取上清液，加入10mmol/L催化剂氢氧化季铵盐乙腈溶液30-110μL，涡旋混匀，再加入反应物摩尔倍数3-7倍的衍生剂，根据需要加入适量的乙腈，使反应溶液中乙腈的总体积达到140-160μL，涡旋混匀，在50-60℃水浴反应20-40分钟，提高水浴温度至65-70℃挥干有机相，衍生化反应结束。

[0018] 所述的催化剂氢氧化季铵盐乙腈溶液为四甲基氢氧化铵乙腈溶液或四丁基氢氧化铵乙腈溶液或四乙基氢氧化铵乙腈溶液；所述的内标溶液为壬酸溶液、环己基丙酸溶液、辛酸溶液或癸酸溶液；所述的衍生剂为2，4′-二溴苯乙酮乙腈溶液、α-溴苯乙酮乙腈溶液、2-溴-对硝基苯乙酮乙腈溶液或4-溴-7-甲氧基香豆素乙腈溶液。

[0019] 本发明的进一步技术方案是：所述的催化剂为四甲基氢氧化铵乙腈溶液，其加入量为10mmol/L四甲基氢氧化铵乙腈溶液90-110μL。

[0020] 本发明的另一进一步技术方案是：所述的催化剂为四丁基氢氧化铵乙腈溶液，其加入量为10mmol/L四丁基氢氧化铵乙腈溶液30-60μL。

[0021] 所述的反应物是指血清中的高浓度丙戊酸和内标溶液中的内标物，所述的高浓度的丙戊酸是指浓度为120-200μg/mL的丙戊酸。

[0022] 本发明的更进一步技术方案是：所述的加入的衍生剂与反应物的摩尔比为5倍。

[0023] 所述的质控或病人血清中丙戊酸浓度为1-200μg/mL。

[0024] 本发明用氢氧化季铵盐乙腈溶液代替三乙胺催化丙戊酸与衍生剂（如2-溴苯乙酮或2,4-二溴苯乙酮等）衍生化成为可紫外检测的苯酯，只需要反应物摩尔倍数3-5倍量的衍生剂，即可达到97%以上的衍生化产率。具有的优点为：衍生化反应完全（97%以上），色谱图基线平稳，无内源性杂质干扰，测定结果准确，精密度好，灵敏度高，衍生化剂2，4′-二溴苯乙酮、α-溴苯乙酮等用量少，不易使色谱柱压力增大，有利于延长色谱柱使用寿命。

[0025] 下面，结合附图和实施例对本发明之一种高效液相色谱法测定丙戊酸体液浓度过程中的衍生化方法的技术特征作进一步的说明。

附图说明

[0026] 图1：空白血清色谱图（四甲基氢氧化铵催化）。

[0027] 图2：空白血清色谱图（三乙胺催化）。

[0028] 图3：标准品血清色谱图（四甲基氢氧化铵催化，标准品血清中丙戊酸浓度120μg/mL）。

[0029] 图4：标准品血清色谱图（三乙胺催化，标准品血清中丙戊酸浓度120μg/mL）。

[0030] 图5：病人血清色谱图（三乙胺催化）。

[0031] 图6：病人血清色谱图（四甲基氢氧化铵催化）。

[0032] 图中：丙戊酸tR为8.9-9.0min，内标tR为9.9-10.0min。

具体实施方式

[0033] 仪器：岛津LC-20AT四元梯度高效液相色谱系统（日本岛津）；HANGPING FA 1004电子分析天平；XW-80漩涡混合器；80-2S台式低速离心机。

[0034] 实施例1：一种高效液相色谱法测定丙戊酸体液浓度过程中的衍生化方法，以四甲基氢氧化铵为催化剂，2,4′-二溴苯乙酮为衍生剂。

[0035] 反应式如下：

[0036]

[0037] 具体操作步骤：精密取质控或病人血清50μL，加入0.10μg/μL内标壬酸溶液60μL，再加3mol/L硫酸溶液50μL，混匀；加入乙醚2mL涡旋提取1min，离心5min-1（3500r·min ），吸取上清液至离心管中，加入10mmol/L四甲基氢氧化铵乙腈溶液100μL漩涡混匀，再加入2mg/mL2,4′-二溴苯乙酮乙腈溶液63μL（即衍生剂为126μg，
0.45μmol，相当于反应物摩尔倍数的5倍，反应物血清中丙戊酸的浓度按152.0μg/mL计），漩涡混匀，在55℃水浴反应约20-40分钟，提高水浴温度至65℃蒸干，衍生化反应结束。

[0038] 本实施例水浴蒸干后得到的残渣用150μL甲醇溶解，旋涡振荡30s，取20μL进HPLC按常规方法进行检测。检测结果：丙戊酸在1.0～152.0μg/mL范围内呈良好线性关系(r=0.9999)，其最低定量浓度为1.0μg/mL（RSD%=10.2%）。日内和日间RSD<3.0%，平均回收率为98.3%-101.5%。

[0039] 表1丙戊酸的回收率与精密度（n=6）

[0040]

[0041] 四甲基氢氧化铵乙腈溶液和三乙胺催化作用的比较：

[0042] 取浓度为60.8、121.6μg/mL的丙戊酸质控血清，以20%三乙胺乙腈溶液50μL或四甲基氢氧化铵乙腈溶液作催化剂，以不同量的2mg/mL2,4′-二溴苯乙酮溶液作衍生剂，其余按“实施例1中具体操作步骤”项下方法操作进行衍生化反应，反应结束后得到的残渣用150μL甲醇溶解，旋涡振荡30s，取20μL进行HPLC在色谱条件下测定。以20倍的2,4′-二溴苯乙酮溶液作衍生剂的条件下测定的峰面积为100%计算反应产率。结果见表
2。

[0043] 表2三乙胺和四甲基氢氧化铵催化作用下丙戊酸衍生物的产率（n=6，%）[0044]

[0045] 从上表的结果可见，在四甲基氢氧化铵催化作用下，5倍量的衍生剂即可使中、高浓度的丙戊酸衍生化产率达到97%以上，而用三乙胺作催化剂，中、高浓度的丙戊酸分别需要11倍量和9倍量以上的衍生剂，衍生化产率才能达到95%以上。

[0046] 实施例2：一种高效液相色谱法测定丙戊酸体液浓度过程中的衍生化方法，以四甲基氢氧化铵为催化剂，α-溴苯乙酮为衍生剂。

[0047] 反应式如下：

[0048]

[0049] 具体操作步骤：精密取质控或病人血清50μL，加入0.16μg/μL内标环己基丙酸溶液50μL，再加3mol/L硫酸50μL，混匀；加入乙醚2mL涡旋提取1min，离心5min（3500r/min），吸取上清液至离心管中，加入10mmol/L四甲基氢氧化铵乙腈溶液100μL漩涡混匀，再加入2mg/mLα-溴苯乙酮乙腈溶液55μL（即衍生剂为110μg，0.55μmol，相当于反应物摩尔倍数的5.3倍，反应物血清中丙戊酸的浓度按152.0μg/mL计），漩涡混匀，在55℃水浴反应约20-40分钟，提高水浴温度至65℃蒸干，衍生化反应结束。

[0050] 本实施例水浴蒸干后得到的残渣用150μL甲醇溶解，旋涡振荡30s，取20μL进HPLC按常规方法进行检测。检测结果：丙戊酸在1.0～152.0μg/mL范围内呈良好线性关系(r=0.9999)，其最低定量浓度为1.0μg/mL（RSD%=5.3%）。日内和日间RSD≤4.2%，平均回收率为100.4%-103.6%。详见表3。

[0051] 表3丙戊酸的回收率与精密度（n=6）

[0052]

[0053] 四甲基氢氧化铵乙腈溶液和三乙胺催化作用的比较：

[0054] 取浓度为121.6μg/mL的丙戊酸质控血清，以20%三乙胺乙腈溶液50μL或10mmol/L四甲基氢氧化铵乙腈溶液100μL作催化剂，以不同摩尔倍数的2mg/mLα-溴苯乙酮溶液作衍生剂，其余按“实施例2中具体操作步骤”项下方法操作进行衍生化反应，反应结束后得到的残渣用150μL甲醇溶解，旋涡振荡30s，取20μL进行HPLC在色谱条件下测定。以20倍的α-溴苯乙酮溶液作衍生剂的条件下测定的峰面积为100%计算反应产率。
结果见表4。

[0055] 表4三乙胺和四甲基氢氧化铵催化作用下丙戊酸衍生物的产率（n=5）[0056]

[0057] 从上表的结果可见，在四甲基氢氧化铵催化作用下，4倍量的衍生剂即可使高浓度的丙戊酸和内标衍生化产率达到95%以上，而用三乙胺作催化剂，加入10倍量的衍生剂，丙戊酸的衍生化产率还不到95%。

[0058] 实施例3：一种高效液相色谱法测定丙戊酸体液浓度过程中的衍生化方法，以四丁基氢氧化铵为催化剂，α-溴苯乙酮为衍生剂。

[0059] 反应式如下：

[0060]

[0061] 具体操作步骤：精密取质控或病人血清50μL，加入0.16μg/μL内标环己基丙酸溶液50μL，再加3mol/L硫酸50μL，混匀；加入乙醚2mL涡旋提取1min，离心5min（3500r/min），吸取上清液至离心管中，加入10mmol/L四丁基氢氧化铵乙腈溶液40μL，漩涡混合30s，再加入2mg/mLα-溴苯乙酮乙腈溶液55μL（即衍生剂为110μg，0.55μmol，相当于反应物摩尔倍数的5.3倍，反应物血清中丙戊酸的浓度按152.0μg/mL计），加入适量的乙腈，使反应溶液中乙腈的总体积达到140-160μL，漩涡混匀，在55℃水浴反应约20-40分钟，提高水浴温度至65℃蒸干，衍生化反应结束。

[0062] 本实施例水浴蒸干后得到的残渣用150μL甲醇溶解，旋涡振荡30s，取20μL进HPLC按常规方法进行检测。检测结果：丙戊酸在1.0～152.0μg/mL范围内呈良好线性关系(r=0.9999)，其最低定量浓度为1.0μg/mL。

[0063] 四丁基氢氧化铵乙腈溶液和三乙胺催化作用的比较：

[0064] 具体操作步骤：精密取质控或病人血清50μL，加入0.16μg/μL内标环己基丙酸溶液50μL，再加3mol/L硫酸50μL，混匀；加入乙醚2mL涡旋提取1min，离心5min（3500r/min），吸取上清液至离心管中，加入20%三乙胺乙腈溶液50μL或10mmol/L四丁基氢氧化铵乙腈溶液40μL，漩涡混合30s，再加入不同摩尔倍数的2mg/mLα-溴苯乙酮溶液（2、3、4、5、7、8、10、15、20倍，反应物血清中丙戊酸的浓度按121.6μg/mL计），加入适量的乙腈，使反应溶液中乙腈的总体积达到140-160μL，漩涡混匀，在55℃水浴反应约20-40分钟，提高水浴温度至65℃蒸干，衍生化反应结束。

[0065] 本实施例水浴蒸干后得到的残渣用150μL甲醇溶解，旋涡振荡30s，取20μL进HPLC按常规方法进行检测。以20倍的α-溴苯乙酮溶液作衍生剂的条件下测定的峰面积为100%计算反应产率。结果见表5。

[0066] 表5三乙胺和四丁基氢氧化铵催化作用下丙戊酸衍生物的产率（n=5）[0067]

[0068] 从表5的结果可见，在四丁基氢氧化铵催化作用下，3倍量的衍生剂即可使高浓度的丙戊酸和内标衍生化产率达到98%以上，而用三乙胺作催化剂，加入10倍量的衍生剂，丙戊酸的衍生化产率还不到95%。

[0069] 本发明各实施例中，精密称取的质控或病人血清中丙戊酸浓度为1-200μg/mL。

[0070] 作为本发明各实施例的一种变换，所述的催化剂除了使用四甲基氢氧化铵乙腈溶液或四丁基氢氧化铵乙腈溶液外，还可以采用其他氢氧化季铵盐乙腈溶液，例如四乙基氢氧化铵乙腈溶液等。所述的内标溶液还可以使用辛酸溶液或癸酸溶液等；所述的衍生剂还可以使用2-溴-对硝基苯乙酮乙腈溶液或4-溴-7-甲氧基香豆素乙腈溶液等。

[0071] 本发明加入的衍生剂与反应物的摩尔比优选为3-7倍（更优选为5倍），所述的反应物是指血清中高浓度丙戊酸和内标溶液中的内标物，所述的高浓度丙戊酸是按浓度为120-200μg/mL的丙戊酸计，高浓度丙戊酸的浓度选择是根据测定方法标准曲线的最高浓度。