一种烷基化衍生试剂及其在肽段标记、质谱检测中的应用

摘要

本发明公开了一种烷基化衍生试剂及其在肽段标记、质谱检测中的应用。所述烷基化衍生试剂为：溴化1-[3-[(2-碘-1-氧乙基)氨基]丙基]-3-丁基咪唑（IPBI），其结构如式（Ⅰ）所示。本发明所提供的烷基化衍生试剂以碘乙酰胺基为活性功能团，同时具有强疏水性、强气相碱性且具有包含永久性正电荷的结构特征，可实现多肽/蛋白质中活性巯基的选择性衍生和高效标记，可显著地提高质谱分析中肽段的带电荷数、离子化效率和检测灵敏度，从而显著提高含半胱氨酸肽段的检出率。同时，本发明所提供的烷基化衍生试剂合成过程简单、成本较低、反应重现性好，宜于推广应用。

权利要求

1.一种如式（Ⅰ）所示的烷基化衍生试剂，

2.权利要求1所述的烷基化衍生试剂的制备方法，其特征在于，以芳香季铵化咪唑为母体结构，通过缩合反应引入和肽段反应的活性碘乙酰胺功能基团。

3.根据权利要求2所述的烷基化衍生试剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：①以1-丁基咪唑和3-溴丙胺氢溴酸盐为原料，于80～90℃回流反应16-24小时即得中间产物溴化1-(3-氨丙基)-3-丁基咪唑；

②以乙腈水为溶剂，制备溴化1-(3-氨丙基)-3-丁基咪唑溶液，加入碘乙酸，在0-10℃条件下加入缩合剂进行缩合反应1-1.5小时，即得所述烷基化衍生试剂。

4.根据权利要求3所述的烷基化衍生试剂的制备方法，其特征在于，所述缩合剂为N,N'-羰基二咪唑、1-羟基-苯并-三氮唑或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐。

5.权利要求1所述的烷基化衍生试剂在肽段的标记及质谱检测中的应用。

6.根据权利要求5所述的烷基化衍生试剂在肽段的标记及质谱检测中的应用，其特征在于，所述烷基化衍生试剂与肽段/蛋白质中的半胱氨酸发生标记反应。

7.根据权利要求5所述的烷基化衍生试剂在肽段的标记及质谱检测中的应用，其特征在于，肽段衍生方法包括以下步骤：①将浓度为0.1-0.4mg/mL的肽段用pH介于8.0-8.5的缓冲液溶解，然后加入浓度为

20mmol/L的三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液，于50℃反应1小时，冷却至室温；

②向上述溶液中加入浓度为50mmol/L的IPBI50μL，继续于37℃反应2小时即可。

说明书

一种烷基化衍生试剂及其在肽段标记、质谱检测中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物大分子的标记，具体地说是一种烷基化衍生试剂及其在肽段标记、质谱检测中的应用。

背景技术

[0002] 在后基因组学时代，蛋白质组分析受到越来越广泛的关注。然而，蛋白质样品组成的极端复杂性、宽动态范围分布特别是翻译后修饰的存在，使得其分析仍旧面临着巨大的挑战。以鸟枪法（Shotgun）为代表的bottom-up策略是复杂蛋白质组样品分离鉴定最常采用的策略，这一策略首先将蛋白质样品经蛋白质酶酶切，产生的多肽混合物经色谱分离后再通过质谱进行多肽鉴定。可见，质谱技术是蛋白质组研究必不可少的工具。

[0003] 然而，基于质谱技术的多肽分析策略其主要缺陷在于不同的肽段其离子化程度具有显著的差异，此外，肽段还存在不充分离子化的问题，其主要原因在于不同的肽段具有不同的二级结构、分子量大小，带电荷状态以及亲疏水性的差异，使得不同肽段的质谱检测灵敏度具有显著的差异。特别是对于复杂蛋白质样品的分析，其宽动态范围分布使得低丰度肽段，特别是一些药物靶点蛋白质或生物标记物的酶切肽段受到高丰度肽段的抑制，其质谱检测仍旧存在较大的困难。因此，改进肽段，特别是低丰度肽段的质谱检测灵敏度具有重要意义。

[0004] 为了提高肽段特别是低丰度肽段的质谱离子化效率，近年来，通过化学衍生技术在多肽中引入易于离子化标签的方法获得了广泛关注。Williams等合成了一系列疏水性的烷基化标签（如：2-碘-N-辛烷基乙酰胺和2-碘-N-苄基乙酰胺）以改善半胱氨酸肽段的质谱离子化效率（Williams D.K.,Meadows C.W.,Bori I.D.,Hawkridge A.M.,Comins D.L.,Muddiman D.C.,J.Am.Chem.Soc.2008,130:2122-2123），B型利钠肽经2-碘-N-辛烷基乙酰胺衍生后，其质谱检测限可降低约3.5倍（Shuford C.M.,Comins D.L.,Whitten J.L.,Burnett J.C.,Muddiman D.C.,Analyst,2010,135:36-41）。Zabet-Moghaddam等将疏水性标签，碘乙酰苯胺，用于含半胱氨酸肽段的烷基化衍生，与碘乙酰胺（IAA）修饰相比，模式肽段经碘乙酰苯胺衍生后其峰强度可提高4.6-6倍（Zabet-Moghaddam M.,Shaikh A.L.,Niwayama S.,J.Mass Spectrom.2012,47,1546-1553）。Vasicek等将季铵化标签，(3-丙烯酰胺丙基)三甲基氯化胺，用于增强含半胱氨酸肽段在电子转移裂解（ETD）质谱中的分析鉴定能力，牛血清白蛋白酶切产物经衍生后其SEQUEST得分值可提高6倍，实现了高可信度的蛋白质鉴定（Vasicek L.,Brodbelt J.S.,Anal.Chem.2009,81,7876-7884）。

[0005] 尽管目前已有多种烷基化衍生试剂报道并应用于了半胱氨酸肽段的烷基化衍生，然而，多肽的质谱检测灵敏度改善比较有限，目前仅限应用于合成肽段或标准蛋白质酶解产物的分析。因此，发展新型高效的烷基化衍生化试剂对于深入的蛋白质组研究具有重要的意义。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供一种能够增强含半胱氨酸肽段质谱分析的烷基化衍生试剂，以实现多肽/蛋白质中巯基的选择性衍生、高效标记，显著地提高衍生肽段的质谱带电荷数、离子化效率和检测灵敏度，显著提高含半胱氨酸肽段的质谱检测能力。

[0007] 本发明进一步的目的是提供所述烷基化衍生试剂在肽段标记、质谱检测中的应用。

[0008] 本发明所提供的烷基化衍生试剂1-[3-[(2-碘-1-氧乙基)氨基]丙基]-3-丁基咪唑（IPBI），如式（Ⅰ）所示结构，

[0009]

[0010] 所述的烷基化衍生试剂的制备方法，是以芳香季铵化咪唑为母体结构，通过缩合反应引入和肽段反应的活性碘乙酰胺功能基团。

[0011] 具体来说，所述的烷基化衍生试剂的制备方法包括以下步骤：

[0012] ①以1-丁基咪唑和3-溴丙胺氢溴酸盐为原料，于80～90℃回流反应16-24小时即得中间产物溴化1-(3-氨丙基)-3-丁基咪唑；

[0013] ②以乙腈水为溶剂，制备溴化1-(3-氨丙基)-3-丁基咪唑溶液，加入碘乙酸，在0-10℃条件下加入缩合剂进行缩合反应1-1.5小时，即得所述烷基化衍生试剂。

[0014] 所述制备方法第①步按如下工艺条件进行：

[0015] 以乙醇为溶剂，在氮气氛围下以1-丁基咪唑和3-溴丙胺氢溴酸盐为原料，控制二者的摩尔比为1.5-1.6:1，于80-90℃回流反应16-24小时，反应完毕后挥干溶剂，残余物用适量的水溶解，并用氢氧化钾调节溶液pH值为中性，冷冻干燥。粗产物用乙醇/四氢呋喃溶解、过滤后挥干溶剂。粗产物再用二氯甲烷洗涤3-5次，溶剂挥干后即得到中间产物：溴化1-(3-氨丙基)-3-丁基咪唑。

[0016] 所述制备方法的第②步按如下工艺条件进行：

[0017] 将溴化1-(3-氨丙基)-3-丁基咪唑溶于乙腈水溶液中至浓度为60-70mg/mL，在0-10℃条件下分别加入碘乙酸和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，所述
1-(3-氨丙基)-3-丁基咪唑和碘乙酸以及1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的摩尔比为1︰0.6-0.7︰1.2-1.3，继续反应1-1.5小时。反应完毕，采用色谱纯化即得终产物IPBI。

[0018] 所述缩合剂可以是N,N'-羰基二咪唑、1-羟基-苯并-三氮唑或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐。

[0019] 本发明的烷基化衍生试剂可以按本发明记载的方法制备，也可按现有技术中已知的类似方法制备而成。

[0020] 本发明所述的烷基化衍生试剂在肽段的标记及质谱检测中应用，可提高衍生肽段的质谱带电荷数、离子化效率和检测灵敏度，显著提高含半胱氨酸肽段的质谱检测能力。

[0021] 本发明所述的烷基化衍生试剂在肽段的标记及质谱检测中应用时，所述烷基化衍生试剂与肽段/蛋白质中的半胱氨酸专一发生标记反应。

[0022] 本发明中，肽段衍生方法及质谱分析：

[0023] ①将肽段用pH介于8.0-8.5的缓冲液溶解制成浓度为0.1-0.4mg/mL的溶液，然后加入浓度为20mmol/L的三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液，于50℃反应1小时，冷却至室温；

[0024] ②向上述溶液中加入浓度为50mmol/L的IPBI50μL，继续于37℃反应2小时。反应完毕，产物可直接进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）或电喷雾质谱（ESI MS）分析。

[0025] 本发明中蛋白质衍生过程及质谱分析：

[0026] ①将尿素变性后的蛋白质加入pH为8.0-8.5的缓冲溶液中，配置成3-6mg/mL的蛋白质溶液，加入浓度为20mmol/L的三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液，于50℃反应1小时。

[0027] ②冷却至室温，向上述溶液中加入浓度为50mmol/L的IPBI50μL，继续于37℃反应2小时。反应完毕，反相除盐，冷冻干燥后用胰蛋白酶酶切即可进行MALDI-TOF MS或ESI MS分析。

[0028] 本发明中的肽段/蛋白质的衍生方法均可按现有技术中已有的方法完成。

[0029] 本发明所提供的烷基化衍生试剂以碘乙酰胺基为活性功能团，同时具有强疏水性、强气相碱性且具有包含永久性正电荷的结构特征，可实现多肽/蛋白质中活性巯基的选择性衍生和高效标记，可显著地提高质谱分析中肽段的带电荷数、离子化效率和检测灵敏度，从而显著提高含半胱氨酸肽段的检出率。同时，本发明所提供的烷基化衍生试剂合成过程简单、成本较低、反应重现性好且肽段衍生产物具有良好的稳定性，例如肽段ALVCEQEAR经衍生后，于室温放置一周仍可稳定存在，宜于推广应用。

附图说明

[0030] 图1为肽段ALVCEQEAR、CDPGYIGSR和CKDECSLDG经IPBI衍生后的基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）谱图。

[0031] 图2为肽段ALVCEQEAR经IPBI衍生后，室温放置1、6、24、72及168小时的MALDI-TOF MS谱图。

[0032] 图3为肽段ALVCEQEAR、CDPGYIGSR、MECFG和KEEPPHHEVPESETC分别经IAA烷基化和IPBI衍生，再将各自肽段的不同衍生物等摩尔混合后进行测试所得的MALDI-TOF MS谱图。

[0033] 图4为肽段ALVCEQEAR、CDPGYIGSR、MECFG和KEEPPHHEVPESETC分别经IAA烷基化和IPBI衍生后测试所得ESI MS谱图。

[0034] 图5为蛋白质过氧化氢酶分别经IAA烷基化和IPBI衍生后经胰蛋白酶酶切肽段再以等摩尔混合后测试所得MALDI-TOF MS谱图。具体实施例

[0035] 本实施例中烷基化衍生试剂IPBI按如下方法制备：

[0036] 1)以乙醇为溶剂，在氮气保护下以1-丁基咪唑和3-溴丙胺氢溴酸盐为原料，控制二者的摩尔比为1.5:1，于80℃回流反应20小时。反应完毕后挥干溶剂，残余物用2mL蒸馏水溶解，并用氢氧化钾调节溶液pH值为中性，冷冻干燥。粗产物用15mL的乙醇/四氢呋喃溶解、过滤后挥干溶剂。粗产物再用18mL的二氯甲烷洗涤4次，溶剂挥发干后即得到中间产物：溴化1-(3-氨丙基)-3-丁基咪唑。

[0037] 2)取中间产物溴化1-(3-氨丙基)-3-丁基咪唑溶解于200μL的乙腈水配置成63mg/mL的溶液，在0℃条件下加入碘乙酸，搅拌均匀后加入的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，所述1-(3-氨丙基)-3-丁基咪唑和碘乙酸以及1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的摩尔比为1︰0.63︰1.2，继续反应1小时即可。反应完毕，采用色谱纯化即得终产物IPBI。

[0038] 本实施例中的多肽/蛋白质衍生过程及质谱分析：

[0039] 1)肽段衍生过程如下：将肽段用pH为8.4的缓冲液溶解制成浓度为0.33mg/mL的溶液。取15μL肽段溶液，加入浓度为20mmol/L的三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液10μL，然后于50℃反应1小时，冷却至室温，向上述溶液中加入50mmol/L的IPBI50μL，继续于37℃反应2小时。反应完毕，产物可直接进行MALDI-TOF MS或ESI MS分析。

[0040] 2)蛋白质衍生过程如下：称取1.0mg的蛋白质用浓度为8mol/L的尿素溶液70μL溶解，然后于56℃变性1小时，冷至室温，将变性后的蛋白质用pH为8.4的缓冲溶液稀释至浓度为4.8mg/mL。取15μL蛋白质溶液，加入浓度为20mmol/L的三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液10μL，于50℃反应1小时。冷却至室温，向上述溶液中加入50mmol/L的IPBI50μL，继续于37℃反应2小时。反应完毕，反相除盐，冷冻干燥后用胰蛋白酶酶切即可进行MALDI-TOF MS或ESI MS分析。

[0041] 通过下述实施例，说明本发明提出的烷基化衍生试剂可对多肽或蛋白质中的半胱氨酸进行高效衍生，并提高肽段质谱带电荷数、离子化效率和质谱检测灵敏度。

[0042] 实施例1

[0043] 向肽段ALVCEQEAR中加入浓度为50mmol/L、pH为8.4的Tris-HCl缓冲溶液配置成浓度为0.33mg/mL的肽段溶液。取15μL肽段溶液，加入浓度为20mmol/L的三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液10μL，然后于50℃反应1小时。冷至室温，向上述溶液中加入浓度为50mmol/L的IPBI50μL，继续于37℃反应2小时。反应完毕，直接点样进行MALDI-TOF MS分析，结果显示，肽段ALVCEQEAR的衍生效率为100%（图1中A图）。

[0044] 实施例2

[0045] 向肽段CDPGYIGSR中加入50mmol/L pH为8.4的Tris-HCl缓冲溶液配置成0.33mg/mL的肽段溶液。取15μL肽段溶液，加入浓度为20mmol/L的三(2-羧乙基)膦盐酸盐10μL，然后于50℃反应1小时。冷至室温，向上述溶液中加入浓度为50mmol/L的IPBI50μL，继续于37℃反应2小时。反应完毕，直接点样进行MALDI-TOF MS分析，结果显示，肽段CDPGYIGSR的衍生效率为99.4%（图1中B图）。

[0046] 实施例3

[0047] 向肽段CKDECSLDG中加入浓度为50mmol/L、pH为8.4的Tris-HCl缓冲溶液配置成0.33mg/mL的肽段溶液。取15μL肽段溶液，加入浓度为20mmol/L的三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液10μL，然后于50℃反应1小时。冷至室温，向上述溶液中加入浓度为50mmol/L的IPBI50μL，继续于37℃反应2小时。反应完毕，直接点样进行MALDI-TOF MS分析，结果显示，肽段CKDECSLDG的衍生效率为100%（图1中C图）。

[0048] 实施例4

[0049] 向肽段ALVCEQEAR中加入浓度为50mmol/L、pH为8.4的Tris-HCl缓冲溶液配置成0.33mg/mL的肽段溶液。取15μL肽段溶液，加入浓度为20mmol/L的三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液10μL，然后于50℃反应1小时。冷至室温，向上述溶液中加入浓度为50mmol/L的IPBI50μL，继续于37℃反应2小时。反应完毕，分别于1小时、6小时、24小时、72小时和168小时点样进行MALDI-TOF MS分析，结果显示，肽段ALVCEQEAR的衍生产物既使于室温放置一周，其MALDI-TOF MS谱型没有发生变化（图2所示），显示了肽段衍生产物具有高稳定性。

[0050] 实施例5

[0051] 向肽段ALVCEQEAR中加入浓度为50mmol/L、pH为8.4的Tris-HCl缓冲溶液配置成0.33mg/mL的肽段溶液，平行取15μL肽段溶液2份，分别加入浓度为20mmol/L的三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液10μL，然后于50℃反应1小时。冷至室温，向一溶液中加入浓度为50mmol/L的IPBI50μL，向另一溶液中加入浓度为50mmol/L的IAA50μL，继续于37℃反应2小时。反应完毕，取等摩尔IAA烷基化和IPBI衍生的肽段混合点样进行MALDI-TOF MS分析，结果显示，肽段ALVCEQEAR经IPBI衍生后与IAA烷基化相比其检测灵敏度提高了97倍（图3中A图）。

[0052] 实施例6

[0053] 向肽段CDPGYIGSR中加入浓度为50mmol/L、pH为8.4的Tris-HCl缓冲溶液配置成0.33mg/mL的肽段溶液，平行取15μL肽段溶液2份，分别加入浓度为20mmol/L的三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液10μL，然后于50℃反应1小时。冷至室温，向一溶液中加入浓度为50mmol/L的IPBI50μL，向另一溶液中加入浓度为50mmol/L的IAA50μL，继续于37℃反应2小时。反应完毕，取等摩尔IAA烷基化和IPBI衍生的肽段混合点样进行MALDI-TOF MS分析，结果显示，肽段CDPGYIGSR经IPBI衍生后与IAA烷基化相比其检测灵敏度提高了62倍（图3中B图）。

[0054] 实施例7

[0055] 向肽段MECFG中加入浓度为50mmol/L、pH为8.4的Tris-HCl缓冲溶液配置成0.33mg/mL的肽段溶液，平行取15μL肽段溶液2份，分别加入浓度为20mmol/L的三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液10μL，然后于50℃反应1小时。冷至室温，向一溶液中加入浓度为
50mmol/L的IPBI50μL，向另一溶液中加入浓度为50mmol/L的IAA50μL，继续于37℃反应
2小时。反应完毕，取等摩尔IAA烷基化和IPBI衍生的肽段混合点样进行MALDI-TOF MS分析，结果显示，当肽段MECFG经IPBI衍生后信噪比为278时，仍旧观察不到肽段经IAA烷基化的谱峰，显示肽段经IPBI衍生后检测灵敏度显著提高（图3中C图）。

[0056] 实施例8

[0057] 向肽段KEEPPHHEVPESETC中加入浓度为50mmol/L、pH为8.4的Tris-HCl缓冲溶液配置成0.33mg/mL的肽段溶液，平行取15μL肽段2份，分别加入浓度为20mmol/L的三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液10μL，然后于50℃反应1小时。冷至室温，向一溶液中加入浓度为50mmol/L的IPBI50μL，向另一溶液中加入浓度为50mmol/L的IAA50μL，继续于37℃反应2小时。反应完毕，取等摩尔IAA烷基化和IPBI衍生的肽段混合点样进行MALDI-TOF MS分析，结果显示，当肽段KEEPPHHEVPESETC经IPBI衍生后信噪比达1250时，仍旧观察不到肽段经IAA烷基化后的谱峰，显示肽段经IPBI衍生后检测灵敏度极大提高（图3中D图）。

[0058] 实施例9

[0059] 向肽段ALVCEQEAR中加入浓度为50mmol/L、pH为8.4的Tris-HCl缓冲溶液配置成0.33mg/mL的肽段溶液，平行取15μL肽段溶液2份，分别加入浓度为20mmol/L的三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液10μL，然后于50℃反应1小时。冷至室温，向一溶液中加入浓度为
50mmol/L的IPBI50μL，向另一溶液中加入浓度为50mmol/L的IAA50μL，继续于37℃反应
2小时。反应完毕，直接进样进行ESI MS分析，结果显示，肽段经IAA烷基化后主要带+2价电荷，此外尚有少部分带+1价电荷；而肽段经IPBI衍生后，带+1价电荷的肽段完全消失，此时肽段主要带+3价电荷，显著提高了肽段的质谱带电荷数（图4中A图）。

[0060] 实施例10

[0061] 向肽段CDPGYIGSR中加入浓度为50mmol/L、pH为8.4的Tris-HCl缓冲溶液配置成0.33mg/mL的肽段溶液，平行取15μL肽段溶液2份，分别加入浓度为20mmol/L的三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液10μL，然后于50℃反应1小时。冷至室温，向一溶液中加入浓度为50mmol/L的IPBI50μL，向另一溶液中加入浓度为50mmol/L的IAA50μL，继续于37℃反应2小时。反应完毕，直接进样进行ESI MS分析，结果显示，肽段经IAA烷基化后主要带+2价电荷，此外尚有少部分带+1价电荷；而肽段经IPBI衍生后，尽管肽段仍以带+2价电荷为主，但带+1价电荷的肽段完全消失，出现带+3价电荷的肽段谱峰，提高了肽段的质谱带电荷数（图4中B图）。

[0062] 实施例11

[0063] 向肽段MECFG中加入浓度为50mmol/L、pH为8.4的Tris-HCl缓冲溶液配置成0.33mg/mL的肽段溶液，平行取15μL肽段溶液2份，分别加入浓度为20mmol/L的三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液10μL，然后于50℃反应1小时。冷至室温，向一溶液中加入浓度为
50mmol/L的IPBI50μL，向另一溶液中加入浓度为50mmol/L的IAA50μL，继续于37℃反应
2小时。反应完毕，直接进样进行ESI MS分析，结果显示，肽段MECFG经IAA烷基化后仅带+1价电荷；而肽段经IPBI衍生后，肽段主要带+2价电荷，显著提高了肽段的质谱带电荷数（图4中C图）。

[0064] 实施例12

[0065] 向肽段KEEPPHHEVPESETC中加入浓度为50mmol/L、pH为8.4的Tris-HCl缓冲溶液配置成0.33mg/mL的肽段溶液，平行取15μL肽段溶液2份，分别加入浓度为20mmol/L的三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液10μL，然后于50℃反应1小时。冷至室温，向一溶液中加入浓度为50mmol/L的IPBI50μL，向另一溶液中加入浓度为50mmol/L的IAA50μL，继续于37℃反应2小时。反应完毕，直接进样进行ESI MS分析，结果显示，肽段KEEPPHHEVPESETC经IAA烷基化主要带+3价电荷；而肽段经IPBI衍生后，主要带+4价电荷，并且出现带+5价电荷的肽段谱峰，显著提高了肽段的质谱带电荷数（图4中D图）。

[0066] 实施例13

[0067] 称取1.0mg的过氧化氢酶用浓度为8mol/L的尿素溶液70μL溶解，然后于56℃变性1小时，冷至室温，将变性后的蛋白质用浓度为50mmol/L、pH为8.4的Tris-HCl缓冲溶液稀释成4.8mg/mL，平行取15μL蛋白质溶液两份，分别加入浓度为20mmol/L的三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液10μL，然后于50℃反应1小时。冷至室温，向一溶液中加入浓度为50mmol/L的IPBI50μL，向另一溶液中加入浓度为50mmol/L的IAA50μL，继续于37℃反应
2小时。反应完毕，采用反相色谱除盐，冷冻干燥后加入浓度为60mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液（pH8.3）300μL和3μg的胰蛋白酶，于37℃酶解过夜。取等摩尔IAA烷基化和IPBI衍生的肽段混合点样进行MALDI-TOF MS分析，结果显示，过氧化氢酶经IAA烷基化后只能检测到半胱氨酸肽段LGPNYLQIPVNCPYR；而蛋白质经IPBI衍生后可检测到半胱氨酸肽段LCENIAGHLK和LGPNYLQIPVNCPYR，且肽段LCENIAGHLK为强度最高的一条肽段（图5）。