靶向载体-磷脂缀合物转让专利
申请号 : CN201310052906.3
文献号 : CN103204911B
文献日 : 2015-04-01
发明人 : P.比萨 , S.沙尔卡维 , H.范 , B.拉米 , P.南加潘 , R.K.皮莱 , S.波雄 , B.宋 , R.E.斯温森
申请人 : 布拉科瑞士有限公司
摘要 :
本发明提供具有高KLDR结合亲和力的肽载体和制备此载体的方法。肽载体可与磷脂缀合，并包含在超声造影剂组合物中。此超声造影剂尤其可用于治疗和诊断方法，例如使含KDR组织成像以及评价和治疗与肿瘤病症相关的血管生成过程。本发明也提供用于大规模生产高纯度二聚体和单体肽磷脂缀合物以及用于形成缀合物的前体物质的方法。本发明还提供用于大规模生产含有非常低水平的TFA的高纯度肽磷脂缀合物的方法。
权利要求 :
1.一种制备具有低水平的TFA的肽磷脂缀合物的方法，所述方法包括以下步骤：将肽二聚体的TFA盐经阴离子交换转变为乙酸盐；和
使肽二聚体与磷脂缀合。
2. 权利要求1的方法，其中所述肽包括Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK[Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDP GGGK(-Adoa-Adoa-Glut-K)-NH2环(2-12)二硫化物]-NH2环(6-13)二硫化物。
3. 权利要求1的方法，其中所述磷脂是DSPE-PEG2000-NH2。
4. 一种制备具有低水平的TFA的肽-磷脂缀合物的方法，所述方法包括洗脱出大小排阻柱中的肽磷脂缀合物和TFA离子。
5. 权利要求4的方法，其中所述洗脱在碳酸氢铵存在下进行。
6. 权利要求4的方法，其中所述肽磷脂缀合物包含DSPE-PEG2000-NH2。
7. 权利要求4的方法，其中所述肽二聚体包含Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK[Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDP GGGK(-Adoa-Adoa-Glut-K)-NH2环(2-12)二硫化物]-NH2环(6-13)二硫化物。
8. 权利要求4的方法，其中所述肽-磷脂缀合物包含选自以下的单体：SEQ ID NO.2、Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK[K(ivDde)]-NH2环(6-13)二硫化物、Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK(Adoa-Adoa)-NH2环(2-12)二硫化物和SEQ ID NO. 5。
说明书 :
靶向载体-磷脂缀合物
[0001] 本申请是2006年12月8日提交的题为“靶向载体-磷脂缀合物”的国家申请号为200680052279.1(PCT/US2006/061793)的发明专利申请的分案申请。
[0002] 相关申请
[0003] 本申请要求2006年7月25日申请的美国临时申请号60/833,342和2005年12月9日申请的美国临时申请号60/749,240的优先权和权益，所述每个临时申请的内容都通过引用结合到本文中。
技术领域
[0004] 本发明涉及靶向载体-磷脂缀合 物(targeting vector-phospholipidconjugate)，尤其是靶向肽-磷脂缀合物，其可用于治疗性和诊断性组合物；以及制备它们的方法。本发明包括靶向超声造影剂，尤其是包含此靶向载体-磷脂缀合物的靶向微泡。
背景技术
[0005] 血管生成，即新血管的形成，不仅在胚胎发育以及正常组织生长和修复过程中发生，而且涉及雌性生殖周期、怀孕的建立和维持以及伤口和骨折的恢复。除了发生在正常个体中的血管生成之外，血管生成事件涉及许多病理过程，尤其是肿瘤生长和转移，以及其中血管增殖增加的其它病症，例如糖尿病性视网膜病、银屑病和关节病。另外，血管生成对于将肿瘤由增生转变为肿瘤生长很重要。因此，抑制血管生成已成为活跃的癌症治疗研究领域。
[0006] 一般认为，肿瘤诱导的血管生成取决于肿瘤细胞产生促血管生成生长因子，该生长因子战胜了趋向于保持现有血管静止和稳定的其它力量。这些促血管生成物质或生长因子中最佳表征的是血管内皮生长因子(VEGF)(Cohen等，FASEBJ.，13：9-22(1999))。 VEGF由多种细胞类型响应于低氧和某些其它刺激天然产生。许多肿瘤也产生大量的VEGF，和/或诱导邻近的基质细胞产生VEGF(Fukumura等，Cell，94：715-725(1998))。VEGF也称为VEGF-A，其作为121、145、165、189和206个氨基酸的5种不同剪接异构体(splice isoform)合成。VEGF121和VEGF165是产生的主要形式，尤其是在肿瘤中(参见Cohen等，1999，出处同上)。与VEGF165不同，VEGF121没有由VEGF基因的外显子6和7编码的基础结构域，且不结合发夹或胞外基质。在本段落中提及的每个参考文献都整体在此引入作为参考。
[0007] VEGF家族成员主要通过结合受体酪氨酸激酶起作用。一般而言，受体酪氨酸激酶为糖蛋白，具有能够结合一种或多种特异性生长因子的胞外结构域、跨膜结构域(通常为α螺旋)、近膜结构域(其中受体可通过例如磷酸化进行调节)、酪氨酸激酶结构域(受体的催化组分)以及在许多受体中涉及酪氨酸激酶底物的识别和结合的羧基末端尾。已知有3个结合VEGF的内皮细胞特异性受体酪氨酸激酶：VEGFR-1(FIt-1)、VEGFR-2(KDR或FIk-1)和VEGFR-3(Flt4)。FIt-1和KDR(也称为VEGFR-2或FIk-1，在本文可互换使用)已被鉴定为主要的高亲和力VEGF受体。尽管FIt-1对VEGF具有较高亲和力，但KDR表现出更丰富的内皮细胞表达(Bikfalvi等，J.Cell.Physiol.，149：50-59(1991))。而且，一般认为KDR支配血管生成反应，并因此引起人们极大的治疗和诊断兴趣(参见Cohen等，1999，出处同上)。KDR表达在血管生成性血管中被高度上调，尤其是在诱导强血管生成反应的肿瘤中(Veikkola等，Cancer Res.，60：203-212(2000))。在纯合KDR敲除小鼠胚胎中完全没有血管发育凸显了KDR在血管生成中的关键性作用(Folkman等，Cancer Medicine，第5版(B.C.Decker Inc.；Ontario，Canada，2000)，第132-152页)。
[0008] KDR(激酶结构域区)的成熟形式由1336个氨基酸组成。KDR的糖基化形式可在SDS-PAGE凝胶上迁移，其表观分子量 约为205kDa。KDR在其胞外结构域中含有7个免疫球蛋白样结构域，其中前3个在VEGF结合中最重要(Cohen等，1999，出处同上)。VEGF自身为能够同时结合2个KDR分子的同二聚体。结果为2个KDR分子在结合和自身磷酸化时被二聚化，变得活性增加很多。增加的激酶活性又启动了介导VEGF的KDR特异性生物作用的信号转导途径。
[0009] 因此，不仅是KDR的VEGF结合活性在体内对血管生成很关键，而且检测内皮细胞上的KDR上调的能力或检测VEGF/KDR结合复合物的能力对检测或监测血管生成应当极为有益。
[0010] 众所周知，含气超声造影剂(gas filled ultrasound contrast agent)是用于回波描记术的特别有效的超声反射体。这些超声造影剂包括例如含气微囊泡，例如含气微泡和含气微球。含气微泡是特别优选的超声造影剂。(在本文公开内容中，术语“微泡”具体地指由磷脂围绕或稳定的气泡)。例如，将载液中的含空气或含气微泡的混悬液注射到活体的血流中将大大地增强超声回声成像，因此有助于显现内部解剖学结构。血管和内脏的成像可对医学诊断(例如用于检测肿瘤、心血管疾病和其它疾病)起到很大的帮助作用。
[0011] 对于诊断和治疗目的，将对期望靶表现出高亲和力的靶向载体组合物(例如KDR或VEGF/KDR复合物)掺入含气超声造影剂中应当特别有益。例如，靶向载体-磷脂缀合物，尤其是靶向肽-磷脂缀合物，可用于制备靶向含气超声造影剂。另外，获得用于大规模生产高度纯化形式的这种靶向载体-磷脂缀合物的方法应特别有益。这些组合物和方法应使得可以生产出用于诊断或治疗应用的组合物，例如将报告部分、抗肿瘤剂或血管生成抑制剂精确靶向靶点。
[0012] 发明概述
[0013] 本发明提供靶向载体-磷脂缀合物，尤其是靶向肽-磷脂缀合物，其可用于制备含气超声造影剂。在一个优选的实施方案中，靶向肽-磷脂缀合物包括表现出高KDR结合亲和力的靶向肽，因此成为用于血管生成过程成像的造影剂的有用组分。
[0014] 本发明还提供单体和二聚体肽磷脂缀合物(在本文也称为脂肽)，其可用于制备含气超声造影剂，尤其可用于制备靶向KDR并可以用于血管生成过程成像的超声造影剂。
[0015] 本发明还提供用于大规模生产高度纯化的单体和二聚体肽磷脂缀合物、尤其是具有高KDR结合亲和力的单体和二聚体肽磷脂缀合物的方法和工艺。
[0016] 本发明还提供用于大规模生产高度纯化的、具有三氟乙酸(TFA)水平最低的二聚体肽磷脂缀合物的方法和工艺。
[0017] 本发明还提供用于合成高纯度的单体肽的方法以及由多个肽亚单位构建肽磷脂缀合物的方法。
[0018] 本发明还提供以高亲和力结合KDR或VEGF/KDR复合物的单体肽，以及合成和使用这些单体肽的方法。
[0019] 本发明还提供由这些靶向载体-磷脂缀合物制备的靶向超声造影剂。这些靶向超声造影剂可用于使携带靶的组织成像。在一个优选的实施方案中，靶向超声造影剂是靶向微泡，靶向载体-磷脂缀合物包括表现出高KDR结合亲和力的靶向肽，因此成为用于使携带KDR的组织成像、尤其是用于肿瘤成像和血管生成过程成像的造影剂的有用组分。还提供制备和使用这些靶向超声造影剂的方法。
[0020] 附图简述
[0021] 图1图示了一种用于由线性肽单体(2)生产单体肽磷脂缀合物(1)的方法。
[0022] 图2图示了单体肽磷脂缀合物(1)，包括对KDR具有高 结合亲和力的肽。
[0023] 图3图示了一种用于由肽单体生产前体二聚体肽(16)的方法。
[0024] 图4图示了一种用于将图1所示的前体二聚体肽与DSPE-PEG2000-NH2缀合以形成含有以高亲和力结合KDR的肽的二聚体肽磷脂缀合物(11)的方法。
[0025] 图5图示了二聚体肽-磷脂缀合物(11)，含有以高亲和力结合KDR的肽。
[0026] 图6图示了一种用于生产具有TFA水平最低的二聚体肽-磷脂缀合物(例如(21))的方法。
[0027] 图7图示了另一种用于生产具有TFA水平最低的二聚体肽-磷脂缀合物(例如(21))的方法。
[0028] 图8图示了另一种用于生产具有TFA水平最低的二聚体肽-磷脂缀合物的方法。
[0029] 图9图示了另一种对KDR具有高结合亲和力的代表性单体肽(32)。
[0030] 图10图示了另一种包含示于图9的单体肽的单体肽-磷脂缀合物(31)。
[0031] 图11A-C显示了通过在造影剂中使用二聚体肽-磷脂缀合物(11)(示于图5)在下列情况下所获得的图像：1)基线(图11A)；2)在25分钟后(图11B)；和3)在扣除基线和游离循环气泡之后(图11C)。
[0032] 图12A-C显示了通过在造影剂中使用单体磷脂肽缀合物(1)(示于图2)在下列情况下所获得的图像：基线(图12A)、在25分钟后(图12B)以及在扣除基线和游离循环气泡之后(图12C)。
[0033] 发明详述
[0034] 申请人出乎意料地发现了可用于生产靶向超声造影剂 并具有优越的KDR结合效力的肽磷脂缀合物。这些化合物中有两种为含有以高亲和力结合KDR的线性肽单体的单体肽磷脂缀合物，而另一种为含有两个不同的单体亚单位的二聚体肽磷脂缀合物，每个单体均结合KDR。另外，业已发现了用于大规模生产这些缀合物和前体物质的纯化形式的高效方法。这些方法包括生产具有TFA水平最低的二聚体肽磷脂缀合物。
[0035] 所述磷脂可选自：磷脂酰乙醇胺和修饰磷脂酰乙醇胺。特别优选的磷脂包括通过将亲水聚合物与其连接而修饰的磷脂酰乙醇胺。经修饰的磷脂酰乙醇胺的实例为用聚乙二醇(PEG)修饰的磷脂酰乙醇胺(PE)，简称为“PE-PEG”，即磷脂酰乙醇胺中的亲水乙醇胺部分连接可变分子量(例如从300道尔顿到5000道尔顿)的PEG分子，例如DPPE-PEG、DSPE-PEG、DMPE-PEG或DAPE-PEG。优选DSPE-PEG2000、DSPE-PEG3400、DPPE-PEG2000和DPPE-PEG3400，特别优选DSPE-PEG2000。值得注意的是，可以使用磷脂的盐形式，例如三甲基铵盐、四甲基铵盐、三乙基铵盐、钠盐等。
[0036] 这些化合物可掺入到含气超声造影剂中，例如含气微泡，以形成提供极佳的含靶组织成像的造影剂。在一个优选的实施方案中，将含有以高亲和力结合KDR的靶向肽的靶向载体-磷脂缀合物掺入靶向微泡中。如本文所述，这些靶向微泡选择性定位于具有KDR的组织，允许这些组织成像，尤其允许肿瘤成像和血管生成过程成像，包括允许那些与肿瘤发展相关的过程成像。
[0037] 单体缀合物
[0038] 一般描述
[0039] 表1提供了对图1、2、9和10中显示的识别标记的描述。
[0040] 表1
[0041]
[0042] 如图1和图2所示，单体肽磷脂缀合物(1)N-乙酰-L-精氨酰-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺酰-L-天冬氨酰-L-色氨酰-L-色氨酰-L-天冬氨酰-L-异亮氨酰-L-谷氨酰-L-亮氨酰-L-丝氨酰-L-甲硫氨酰-L-丙氨酰-L-天冬氨酰-L-谷氨酰胺酰-L-亮氨酰-L-精氨酰-L-组氨酰-L-丙氨酰-L1-苯丙氨酰-L-亮氨酰-L-丝氨酰-甘氨酰-甘
氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-{N6-[1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇氨基羰基氧基-(PEG2000)-氨基戊二酰]}-L-赖氨酰胺，是一种磷脂缀合物。该缀合物也称为Ac-RAQDWYYDEILSMADQLRHAFLSGGGGGK(DSPE-PEG2000-NH-Glut)-NH2(SEQ ID NO.1)和Ac-Arg-Ala-Gln-Asp-Trp-Tyr-Tyr-Asp-Glu-Ile-Leu-Ser-Met-Ala-Asp-Gln-Leu-Arg-His-Ala-Phe-Leu-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Lys(DSPE-PEG2000-NH-Glut)-NH2。它含有29个氨基酸的线性肽单体(2)N-乙酰-L-精氨酰-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺酰-L-天冬氨酰-L-色氨酰-L-色氨酰-L-天冬氨酰-L-异亮氨酰-L-谷氨酰-L-亮氨酰-L-丝氨酰-L-甲硫氨酰-L-丙氨酰-L-天冬氨酰-L-谷氨酰胺酰-L-亮氨酰-L1-精氨酰-L-组氨酰-L-丙氨酰-L-苯丙
氨酰-L-亮氨酰-L-丝氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-L-赖氨酰胺，
也称为Ac-RAQDWYYDEILSMADQLRHAFLSGGGGGK-NH2(SEQ ID NO.2)和Ac-Arg-Ala-Gln-Asp-Trp-Tyr-Tyr-Asp-Glu-Ile-Leu-Ser-Met-Ala-Asp- Gln-Leu-Arg-His-Ala-Phe-Leu-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Lys-NH2。此新的肽单体以高亲和力结合KDR。应当理解的是，单体肽磷脂缀合物(1)和线性肽单体(2)的类似物和衍生物也包括在本发明范围之内。
氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-{N6-[1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇氨基羰基氧基-(PEG2000)-氨基戊二酰]}-L-赖氨酰胺，是一种磷脂缀合物。该缀合物也称为Ac-RAQDWYYDEILSMADQLRHAFLSGGGGGK(DSPE-PEG2000-NH-Glut)-NH2(SEQ ID NO.1)和Ac-Arg-Ala-Gln-Asp-Trp-Tyr-Tyr-Asp-Glu-Ile-Leu-Ser-Met-Ala-Asp-Gln-Leu-Arg-His-Ala-Phe-Leu-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Lys(DSPE-PEG2000-NH-Glut)-NH2。它含有29个氨基酸的线性肽单体(2)N-乙酰-L-精氨酰-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺酰-L-天冬氨酰-L-色氨酰-L-色氨酰-L-天冬氨酰-L-异亮氨酰-L-谷氨酰-L-亮氨酰-L-丝氨酰-L-甲硫氨酰-L-丙氨酰-L-天冬氨酰-L-谷氨酰胺酰-L-亮氨酰-L1-精氨酰-L-组氨酰-L-丙氨酰-L-苯丙
氨酰-L-亮氨酰-L-丝氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-L-赖氨酰胺，
也称为Ac-RAQDWYYDEILSMADQLRHAFLSGGGGGK-NH2(SEQ ID NO.2)和Ac-Arg-Ala-Gln-Asp-Trp-Tyr-Tyr-Asp-Glu-Ile-Leu-Ser-Met-Ala-Asp- Gln-Leu-Arg-His-Ala-Phe-Leu-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Lys-NH2。此新的肽单体以高亲和力结合KDR。应当理解的是，单体肽磷脂缀合物(1)和线性肽单体(2)的类似物和衍生物也包括在本发明范围之内。
[0043] 图10提供了另一单体肽磷脂缀合物(31)N-乙酰-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺酰-L-天冬氨酰-L-色氨酰-L-酪氨酰-L-酪氨酰-L-天冬氨酰-L-谷氨酰-L-异亮氨
酰-L-亮氨酰-L-丝氨酰-L-甲硫氨酰-L-丙氨酰-L-天冬氨酰-L-谷氨酰-L-亮氨
酰-L-精氨酰-L-组氨酰-L-丙氨酰-L-苯丙氨酰-L-亮氨酰-L-丝氨酰-甘氨酰-甘
氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-{N6-[1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇氨基羰基氧基-(PEG2000)-氨基戊二酰]}-L-赖氨酸-酰胺即磷脂缀合物的结构。该缀合物也称为Ac-AQDWYYDEILSMADQLRHAFLSGGGGGK(DSPE-PEG2000-NH-Glut)-NH2(SEQ ID NO.4)和 Ac-Arg-Ala-Gln-Asp-Trp-Tyr-Tyr-Asp-Glu-Ile-Leu-Ser-Met-Ala-Asp-Gln-Leu-Arg-His-Ala-Phe-Leu-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Lys(DSPE-PEG2000-NH-Glut)-NH2。如图9所示，该缀合物含有28个氨基酸的线性肽单体(32)N-乙酰-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺酰-L-天冬氨酰-L-色氨酰-L-酪氨酰-L-酪氨酰-L-天冬氨酰-L-谷氨酰-L-异亮氨酰-L-亮
氨酰-L-丝氨酰-L-甲硫氨酰-L-丙氨酰-L-天冬氨酰-L-谷氨酰-L-亮氨酰-L-精氨
酰-L-组氨酰-L-丙氨酰-L-苯丙氨酰-L-亮氨酰-L-丝氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨
酰-甘氨酰-甘氨酰-L-赖氨酰胺，也称为Ac-AQDWYYDEILSMADQLRHAFLSGGGGGK-NH2(SEQ ID NO.5)和Ac-Ala-Gln-Asp-Trp-Tyr-Tyr-Asp-Glu-Ile-Leu-Ser-Met-Ala-Asp-Gln-Leu-Arg-His-Ala-Phe-Leu-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Lys-NH2。如同时待审的申请-2003年9月11日申请的美国申请号10/661,156中所述，该肽单体以高亲和力结合KDR。应当理解的是，单体肽磷脂缀合物和线性肽单体的类似物和衍生物也包括在本发明范围之内。
酰-L-亮氨酰-L-丝氨酰-L-甲硫氨酰-L-丙氨酰-L-天冬氨酰-L-谷氨酰-L-亮氨
酰-L-精氨酰-L-组氨酰-L-丙氨酰-L-苯丙氨酰-L-亮氨酰-L-丝氨酰-甘氨酰-甘
氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-{N6-[1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇氨基羰基氧基-(PEG2000)-氨基戊二酰]}-L-赖氨酸-酰胺即磷脂缀合物的结构。该缀合物也称为Ac-AQDWYYDEILSMADQLRHAFLSGGGGGK(DSPE-PEG2000-NH-Glut)-NH2(SEQ ID NO.4)和 Ac-Arg-Ala-Gln-Asp-Trp-Tyr-Tyr-Asp-Glu-Ile-Leu-Ser-Met-Ala-Asp-Gln-Leu-Arg-His-Ala-Phe-Leu-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Lys(DSPE-PEG2000-NH-Glut)-NH2。如图9所示，该缀合物含有28个氨基酸的线性肽单体(32)N-乙酰-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺酰-L-天冬氨酰-L-色氨酰-L-酪氨酰-L-酪氨酰-L-天冬氨酰-L-谷氨酰-L-异亮氨酰-L-亮
氨酰-L-丝氨酰-L-甲硫氨酰-L-丙氨酰-L-天冬氨酰-L-谷氨酰-L-亮氨酰-L-精氨
酰-L-组氨酰-L-丙氨酰-L-苯丙氨酰-L-亮氨酰-L-丝氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨
酰-甘氨酰-甘氨酰-L-赖氨酰胺，也称为Ac-AQDWYYDEILSMADQLRHAFLSGGGGGK-NH2(SEQ ID NO.5)和Ac-Ala-Gln-Asp-Trp-Tyr-Tyr-Asp-Glu-Ile-Leu-Ser-Met-Ala-Asp-Gln-Leu-Arg-His-Ala-Phe-Leu-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Lys-NH2。如同时待审的申请-2003年9月11日申请的美国申请号10/661,156中所述，该肽单体以高亲和力结合KDR。应当理解的是，单体肽磷脂缀合物和线性肽单体的类似物和衍生物也包括在本发明范围之内。
[0044] 如本发明实施例所述，用单体肽磷脂缀合物(1)和(31)配制的超声造影剂，例如含气微泡，表现出高KDR结合，该结合使用兔VX2肿瘤的回声检查得以证实。
[0045] 理论上，为利于单体肽磷脂缀合物(1)或(31)的生产，应大量制备线性肽单体(2)或(32)。然后，经接头戊二酸二琥珀酰亚胺酯(DSG)缀合纯化的线性肽单体(2)或(32)与磷脂(例如盐形式的PEG化磷脂，例如DSPE-PEG2000-NH2磷脂铵盐(4))可用于提供单体肽磷脂缀合物(1)或(32)。
[0046] 制备单体肽-磷脂缀合物的方法
[0047] 在制备单体肽磷脂缀合物(1)和(31)时，本发明的方法至少提供以下优势：肽合成收率提高；外消旋程度降低；避免了先前在合成过程中观察到的哌啶酰胺形成；有效纯化肽单体(2)和(32)；开发以较大规模缀合肽单体(2)和(32)的程序；以及开发应使得可以容易地将单体肽磷脂缀合物(1)和(31)与原料DSPE-PEG2000-NH2磷脂铵盐(4)分离开来的纯化方案。
[0048] 可如下所述制备单体肽磷脂缀合物。应当认识到，在单体肽磷脂缀合物合成的此示例性描述中提到的数值为示例性的。
[0049] 线性肽单体可通过SPPS制备。线性肽单体的序列可在Pal-Peg-PS-树脂上作为C-末端甲酰胺构建(取代水平：0.2mmol/g)。肽合成可在 肽合成仪上使用Fmoc化学完成。先前对此方法观察到的问题一直是外消旋、不完全偶联和哌啶酰胺形成，其中每个问题都导致未达到最优得率和纯度。哌啶酰胺形成的急剧下降可通过使用含HOBt(0.1M)的25％哌啶的DMF溶液作为用于脱去Fmoc的试剂来实现。可使用DIC/HOBt作为大部分偶联的活化剂、3小时偶联时间、使用4倍过量的预活化Fmoc-氨基酸、用无水α
DMF(6次)间插洗涤显著降低外消旋。N -Fmoc氨基酸可恰好在其偶联转变之前被溶解，用DIC/HOBt的DMF溶液预活化4分钟，并转移至反应容器。这可以在Sonata设备上如下实现：将固体Fmoc-氨基酸加到该设备的氨基酸容器中，然后给该设备设定好程序，以在该溶液鼓泡的同时序贯加入DMF、HOBt/DMF和 DIC/DMF。
DMF(6次)间插洗涤显著降低外消旋。N -Fmoc氨基酸可恰好在其偶联转变之前被溶解，用DIC/HOBt的DMF溶液预活化4分钟，并转移至反应容器。这可以在Sonata设备上如下实现：将固体Fmoc-氨基酸加到该设备的氨基酸容器中，然后给该设备设定好程序，以在该溶液鼓泡的同时序贯加入DMF、HOBt/DMF和 DIC/DMF。
[0050] 为优化得率，可解决在较长肽的合成过程中树脂的聚集问题，该问题即便在使用最佳偶联试剂时也可为破坏性的。为减少肽组装过程中的聚集，可使用的策略是采用假脯氨酸二肽掺入X-Thr或X-Ser作为二肽代替X和Thr或X和Ser的序贯偶联。对于线性肽单11 12 22 23 Me，Me
体，Leu -Ser 和Leu -Ser 的序贯偶联可被假脯氨酸二肽Fmoc-Leu-Ser(ψ pro)-OH的单次偶联替代。其它优化可通过使用Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH和Fmoc-Gly-Gly-OH代替Fmoc-Gly-OH的顺序偶联而减少偶联次数来实现。-Gly-Gly-OH区段的活化可导致活化的酸性官能团和远端的酰胺官能团环化，得到无活性的二酮哌嗪；这可以时间依赖性方式减少偶联得率。该问题可通过向反应容器中加入Fmoc-Glyn-OH(n＝2、3)并顺序加入HOBt和DIC予以避免；活化的Fmoc-Glyn-OH可被树脂结合的氨基截获，然后发生变为二酮哌嗪的明显环化。采用这些改进，线性肽单体的合成可在Sonata肽合成仪上以10mmol的合成规模完成。
体，Leu -Ser 和Leu -Ser 的序贯偶联可被假脯氨酸二肽Fmoc-Leu-Ser(ψ pro)-OH的单次偶联替代。其它优化可通过使用Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH和Fmoc-Gly-Gly-OH代替Fmoc-Gly-OH的顺序偶联而减少偶联次数来实现。-Gly-Gly-OH区段的活化可导致活化的酸性官能团和远端的酰胺官能团环化，得到无活性的二酮哌嗪；这可以时间依赖性方式减少偶联得率。该问题可通过向反应容器中加入Fmoc-Glyn-OH(n＝2、3)并顺序加入HOBt和DIC予以避免；活化的Fmoc-Glyn-OH可被树脂结合的氨基截获，然后发生变为二酮哌嗪的明显环化。采用这些改进，线性肽单体的合成可在Sonata肽合成仪上以10mmol的合成规模完成。
[0051] 在链延伸后，可从N-末端脱去Fmoc。肽和游离氨基均可被乙酰化。然后，可从树脂上切下肽序列，并使用“试剂B”(TFA∶水∶苯酚∶三异丙基硅烷，88∶5∶5∶2，体积/体积/重量/体积)脱保护4小时。在切割反应后，可通过蒸发挥发物、用乙醚研磨残余物并使用同样的溶剂洗涤由此获得的固体来分离粗肽。在另一个变化中，可按下述步骤使该肽从反应混合物中沉淀出来：向反应混合物中加入乙醚，收集由此形成的固体，再用同样的溶剂洗涤。
[0052] 可如下所述纯化线性肽单体。再者，数值是代表性的。粗线性肽单体(0.5g)可溶解在CH3CN(40mL/g)中，可用水将该溶液稀释至终体积为100mL，然后过滤溶液。可将滤过的溶液加到用10％CH3CN的水溶液(0.1％TFA)平衡的制备型HPLC柱(Waters， MS C18，10μ， 50×250mm)上。在上样后，接着可在1分钟内将洗脱液的组成阶次升至20％CH3CN-水(0.1％TFA)， 可以0.6％/分钟CH3CN(0.1％TFA)至水(0.1％TFA)的速度启动线性梯度，并跑柱50分钟。可在分析型反相C18柱(Waters XTerra MS-C18，10μ， 4.6×50mm)上检查洗脱流分的纯度，可合并和冻干含产物流分(纯度＞95％)。对于每0.5g粗肽的纯化，都始终可以分离出0.12g(24％)线性肽单体，并得到同样得率和纯度的肽。
[0053] 可如下所述实施单体肽磷脂缀合物的合成。数值基准仍是示例性的。合成的最后一步可为磷脂(例如PEG化磷脂，例如DSPE-PEG2000-NH2磷脂铵盐)与线性肽单体的缀合。DSPE-PEG2000-NH2磷脂铵盐(4)的PEG2000部分名义上由45个乙二醇单元组成。然而，应当理解的是，该物质为含PEG物质的分布，其质量中心为含有45个乙烯氧基单元的名义化合物。线性肽单体与DSPE-PEG2000-NH2磷脂铵盐的缀合可如下完成：制备线性肽单体的戊二酸单酰胺单NHS酯，并使其与磷脂铵盐的游离氨基反应。因此，线性肽单体可在DIEA(5当量)存在下与DSG(4当量)的DMF溶液反应30分钟。反应混合物可用乙酸乙酯稀释，这可导致肽戊二酸单酰胺单NHS酯沉淀。可倾析出含有未反应的DSG的上清液，并用乙酸乙酯洗涤中间体肽单NHS酯几次，以除去痕量DSG。质谱数据证实形成的肽单NHS酯为纯净产物。固体单NHS酯可溶解在DMF中，并在DIEA(4当量)存在下与DSPE-PEG2000-NH2磷脂铵盐(0.9当量)反应24小时。可过量使用线性肽单体戊二酸单酰胺单NHS酯，以使磷脂铵盐的消耗最大化，因为游离的磷脂铵盐可使高纯度形式的单体肽磷脂缀合物的分离复杂化。
[0054] 反应混合物可用水(0.1％TFA)和CH3CN-CH3OH(1∶1，体积/体积)(0.1％TFA)的1∶1混合物(约100mL)稀释，再加到反相C2柱( C2，10μ，
50×250mm，流速100mL/分钟)上，该柱可用水(0.1％TFA)和CH3CN-CH3OH(1∶1，
体积/体积)(0.1％TFA)的3∶1混合物洗脱，以除去亲水杂质。然后，产物可使用
CH3CN-CH3OH(1∶1)(0.1％TFA)至水(0.1％TFA)的梯度洗脱(细节参 见实验部分)。可使用ELS检测器，通过反相HPLC对所收集的流分进行分析，ELS检测器允许检测需要的产物以及经常难以分离的DSPE-PEG2000-NH2磷脂，其UV吸光度非常小。这表明单体肽磷脂缀合物和DSPE-PEG2000-NH2磷脂完全分离。可收集含有纯产物的流分，在旋转蒸发器上浓缩(以减少甲醇含量)，冻干，得到单体肽磷脂缀合物(无色固体)。为了制备所需量的单体肽磷脂缀合物，可使用0.5g至1.0g的线性肽单体实施几个轮次。在所有情况下，靶单体肽磷脂缀合物都可以以高得率和纯度(例如得率57-60％和纯度＞99％)分离出来。
50×250mm，流速100mL/分钟)上，该柱可用水(0.1％TFA)和CH3CN-CH3OH(1∶1，
体积/体积)(0.1％TFA)的3∶1混合物洗脱，以除去亲水杂质。然后，产物可使用
CH3CN-CH3OH(1∶1)(0.1％TFA)至水(0.1％TFA)的梯度洗脱(细节参 见实验部分)。可使用ELS检测器，通过反相HPLC对所收集的流分进行分析，ELS检测器允许检测需要的产物以及经常难以分离的DSPE-PEG2000-NH2磷脂，其UV吸光度非常小。这表明单体肽磷脂缀合物和DSPE-PEG2000-NH2磷脂完全分离。可收集含有纯产物的流分，在旋转蒸发器上浓缩(以减少甲醇含量)，冻干，得到单体肽磷脂缀合物(无色固体)。为了制备所需量的单体肽磷脂缀合物，可使用0.5g至1.0g的线性肽单体实施几个轮次。在所有情况下，靶单体肽磷脂缀合物都可以以高得率和纯度(例如得率57-60％和纯度＞99％)分离出来。
[0055] 二聚体缀合物
[0056] 一般描述
[0057] 表2提供了示于图3、4和5的识别标记的描述。
[0058] 表2
[0059]
[0060] 如附图所示，二聚体肽磷脂缀合物(11)乙酰-L-丙氨酰-甘氨酰-L-脯氨酰-L-苏氨酰-L-色氨酰-L-半胱氨酰-L-谷氨酰-L-天冬氨酰-L-天冬氨酰-L-色氨
酰-L-酪氨酰-L-酪氨酰-L-半胱氨酰-L-色氨酰-L-亮氨酰-L-苯丙氨酰-甘氨酰-L-苏氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-L-赖氨酰[乙酰-L-缬氨酰-L-半胱氨酰-L-色氨
酰-L-谷氨酰-L-天冬氨酰-L-丝氨酰-L-色氨酰-甘氨酰-甘氨酰-L-谷氨酰-L-缬
氨酰-L-半胱氨酰-L-苯丙氨酰-L-精氨酰-L-酪氨酰-L-天冬氨酰-L-脯氨酰-甘氨
酰-甘氨酰-甘氨酰-L-赖氨酰(二硬脂酰磷酸乙醇氨基羰基氧基-PEG2000-氨基-8-氨基-3，6-二氧杂辛酰基-8-氨基-3，6-二氧杂辛酰基-戊二酰-L-赖氨酰)酰胺环(2-12)二硫化物]-酰胺环(6-13)二硫化物，由2个结合KDR的单体肽链组成：21个氨基酸的环状二硫化物肽单体(13)乙酰-L-缬氨酰-L-半胱氨酰-L-色氨酰-L-谷氨酰-L-天冬氨酰-L-丝氨酰-L-色氨酰-甘氨酰-甘氨酰-L-谷氨酰-L-缬氨酰-L-半胱氨酰-L-苯丙
氨酰-L-精氨酰-L-酪氨酰-L-天冬氨酰-L-脯氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-L-赖氨
酰(8-氨基-3，6-二氧杂辛酰基-8-氨基-3，6-二氧杂辛酰基)酰胺环(2-12)二硫化物，以及22个氨基酸的环状二硫化物肽单体(12)乙酰-L-丙氨酰-甘氨酰-L-脯氨酰-L-苏氨酰-L-色氨酰-L-半胱氨酰-L-谷氨酰-L-天冬氨酰-L-天冬氨酰-L-色氨酰-L-酪氨酰-L-酪氨酰-L-半胱氨酰-L-色氨酰-L-亮氨酰-L-苯丙氨酰-甘氨酰-L-苏氨酰-甘
氨酰-甘氨酰-甘氨酰-L-赖氨酰胺环状6-13二硫化物，这两条肽链通过戊二酰接头束缚在一起。应当理解的是，二聚体肽磷脂缀合物(11)和环状二硫化物肽单体(12)和(13)的类似物和衍生物也包括在本发明范围之内。
酰-L-酪氨酰-L-酪氨酰-L-半胱氨酰-L-色氨酰-L-亮氨酰-L-苯丙氨酰-甘氨酰-L-苏氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-L-赖氨酰[乙酰-L-缬氨酰-L-半胱氨酰-L-色氨
酰-L-谷氨酰-L-天冬氨酰-L-丝氨酰-L-色氨酰-甘氨酰-甘氨酰-L-谷氨酰-L-缬
氨酰-L-半胱氨酰-L-苯丙氨酰-L-精氨酰-L-酪氨酰-L-天冬氨酰-L-脯氨酰-甘氨
酰-甘氨酰-甘氨酰-L-赖氨酰(二硬脂酰磷酸乙醇氨基羰基氧基-PEG2000-氨基-8-氨基-3，6-二氧杂辛酰基-8-氨基-3，6-二氧杂辛酰基-戊二酰-L-赖氨酰)酰胺环(2-12)二硫化物]-酰胺环(6-13)二硫化物，由2个结合KDR的单体肽链组成：21个氨基酸的环状二硫化物肽单体(13)乙酰-L-缬氨酰-L-半胱氨酰-L-色氨酰-L-谷氨酰-L-天冬氨酰-L-丝氨酰-L-色氨酰-甘氨酰-甘氨酰-L-谷氨酰-L-缬氨酰-L-半胱氨酰-L-苯丙
氨酰-L-精氨酰-L-酪氨酰-L-天冬氨酰-L-脯氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-L-赖氨
酰(8-氨基-3，6-二氧杂辛酰基-8-氨基-3，6-二氧杂辛酰基)酰胺环(2-12)二硫化物，以及22个氨基酸的环状二硫化物肽单体(12)乙酰-L-丙氨酰-甘氨酰-L-脯氨酰-L-苏氨酰-L-色氨酰-L-半胱氨酰-L-谷氨酰-L-天冬氨酰-L-天冬氨酰-L-色氨酰-L-酪氨酰-L-酪氨酰-L-半胱氨酰-L-色氨酰-L-亮氨酰-L-苯丙氨酰-甘氨酰-L-苏氨酰-甘
氨酰-甘氨酰-甘氨酰-L-赖氨酰胺环状6-13二硫化物，这两条肽链通过戊二酰接头束缚在一起。应当理解的是，二聚体肽磷脂缀合物(11)和环状二硫化物肽单体(12)和(13)的类似物和衍生物也包括在本发明范围之内。
[0061] 用二聚体肽磷脂缀合物(11)配制的超声造影剂(例如含气微泡)表现出高KDR结合，该结合使用兔VX2肿瘤的回声检查得以证实。
[0062] 制备二聚体-磷脂缀合物的方法
[0063] 为实现二聚体肽磷脂缀合物(11)的合成，用于此目的的单体最好应当大量制备。然后，可使用戊二酸二琥珀酰亚胺酯作为接头将单体彼此束缚在一起，以形成前体二聚体肽(16)乙酰-L-丙氨酰-甘氨酰-L-脯氨酰-L-苏氨酰-L-色氨酰-L-半胱氨酰-L-谷
氨酰-L-天冬氨酰-L-天冬氨酰-L-色氨酰-L-酪氨酰-L-酪氨酰-L-半胱氨酰-L-色氨酰-L-亮氨酰-L-苯丙氨酰-甘氨酰-L-苏氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-L-赖氨酰
[乙酰-L-缬氨酰-L-半胱氨酰-L-色氨酰-L-谷氨酰-L-天冬氨酰-L-丝氨酰-L-色氨
酰-甘氨酰-甘氨酰-L-谷氨酰-L-缬氨酰-L-半胱氨酰-L-苯丙氨酰-L-精氨酰-L-酪氨酰-L-天冬氨酰-L-脯氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-L-赖氨酰(8-氨基-3，6-二氧杂辛酰基-8-氨基-3，6-二氧杂辛酰基-戊二酰-L-赖氨酰)酰胺环(2-12)二硫化物]-酰胺环(6-13)二硫化物。然后，可又经戊二酸二琥珀酰亚胺酯缀合纯化的前体二聚体肽(16)和DSPE-PEG2000-NH2磷脂铵盐(18)，以便提供目标二聚体肽磷脂缀合物(11)。
氨酰-L-天冬氨酰-L-天冬氨酰-L-色氨酰-L-酪氨酰-L-酪氨酰-L-半胱氨酰-L-色氨酰-L-亮氨酰-L-苯丙氨酰-甘氨酰-L-苏氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-L-赖氨酰
[乙酰-L-缬氨酰-L-半胱氨酰-L-色氨酰-L-谷氨酰-L-天冬氨酰-L-丝氨酰-L-色氨
酰-甘氨酰-甘氨酰-L-谷氨酰-L-缬氨酰-L-半胱氨酰-L-苯丙氨酰-L-精氨酰-L-酪氨酰-L-天冬氨酰-L-脯氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-L-赖氨酰(8-氨基-3，6-二氧杂辛酰基-8-氨基-3，6-二氧杂辛酰基-戊二酰-L-赖氨酰)酰胺环(2-12)二硫化物]-酰胺环(6-13)二硫化物。然后，可又经戊二酸二琥珀酰亚胺酯缀合纯化的前体二聚体肽(16)和DSPE-PEG2000-NH2磷脂铵盐(18)，以便提供目标二聚体肽磷脂缀合物(11)。
[0064] 在制备二聚体肽磷脂缀合物(11)时，本发明的方法至少提供以下优势：肽序列自动化链延伸的得率增加；在合成过程中遇到的外消旋程度降低；避免了先前在肽单体(13)合成过程中观察到的哌啶酰胺形成；使用可经受多克级但仍允许有效和实用的样品操作的程序环化(12)和(13)的线性含二半胱氨酸肽前体；有效纯化单体肽(12)和(13)；前体二聚体肽(16)的得率和纯度最大化；开发较大规模缀合前体二聚体肽(16)的程序；以及开发应使得可以容易地将目标二聚体肽磷脂缀合物(11)与磷脂铵盐(18)分离开来的纯化方案。
[0065] 可通过自动化合成肽单体(12)Ac-Ala-Gly-Pro-Thr-Trp-Cys-Glu-Asp-Asp-Trp-Tyr-Tyr-Cys-Trp-Leu-Phe-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys(ivDde)-NH2环(6-13)二硫化物和(13)Ac-Val-Cys-Trp-Glu-Asp-Ser-Trp-Gly-Gly-Glu-Val-Cys-Phe-Arg-Tyr-Asp-Pro-Gly-Gly-Gly-Lys(Adoa-Adoa)-NH2环(2-12)二硫化物，来制备二聚体肽磷脂缀合物(11)，它们使用戊二酸二琥珀酰亚胺酯(DSG)有效偶联，得到ivDde保护的二聚 体，其脱保护和后续与DSPE-PEG2000-NH2偶联也经由戊二酰连接。采用本发明的程序，单体肽可以10mmol规模合成，不复杂，在HPLC纯化后可以得率约20％的和纯度＞95％获得。此方法允许二聚体形成反应和随后与磷脂组分的缀合，提供了以克级实施的二聚体肽磷脂缀合物(11)形成。前体二聚体肽(16)可以常规得率约32％和纯度＞95％得自单体肽。二聚体肽磷脂缀合物(11)可以得率57-60％和纯度＞99％由前体二聚体肽(16)生产。
[0066] 可如下所述制备二聚体肽磷脂缀合物。应当认识到，在二聚体肽磷脂缀合物合成的此代表性描述中提及的数值是代表性的。
[0067] 下面描述的是用于肽单体(12)Ac-Ala-Gly-Pro-Thr-Trp-Cys-Glu-Asp-Asp-Trp-Tyr-Tyr-Cys-Trp-Leu-Phe-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys(ivDde)-NH2环(6-13)二硫化物和肽单体(13)Ac-Val-Cys-Trp-Glu-Asp-Ser-Trp-Gly-Gly-Glu-Val-Cys-Phe-Arg-Tyr-Asp-Pro-Gly-Gly-Gly-Lys(Adoa-Adoa)-NH2环(2-12)二硫化物的固相合成和二硫化物环化的代表性方法。
[0068] 所述肽可在Pal-Peg-PS-树脂上作为其C-末端甲酰胺构建(取代水平：0.2mmol/g)。可在 肽合成仪上，使用Fmoc化学并采用优化的脱保护和偶联方案，以10mmol合成规模完成链延伸。通过研究肽杂质和方案中特定元素的变化对所获得的肽总体得率和纯度的影响，可开发出利用自动化SPSS来优化合成肽。
[0069] 从非优化合成单体肽获得的杂质分析表明，主要问题是外消旋、不完全偶联和哌啶酰胺形成(假定经由中间体天冬氨酰亚胺或戊二酰亚胺中间体)，其中每个问题都导致未达到最优得率和纯度。哌啶酰胺形成的急剧下降可通过使用含HOBt(0.1M)的25％哌啶的DMF溶液作为用于脱去Fmoc的试剂来实现。可使用DIC/HOBt作为大部分偶联的活化剂、3小时偶联时间、使用4倍过量的预活化Fmoc-氨基酸、用无水DMF(6次)间插洗涤显著降α
低外消 旋。N -Fmoc氨基酸可恰好在其偶联转变之前被溶解，用DIC/HOBt的DMF溶液预活化4分钟，并转移至反应容器。这可以在Sonata设备上如下实现：将固体Fmoc-氨基酸加到该设备的氨基酸容器中，然后给该设备设定好程序，以序贯加入DMF、HOBt/DMF和DIC/DMF，并在每次加入后使溶液鼓泡。
低外消 旋。N -Fmoc氨基酸可恰好在其偶联转变之前被溶解，用DIC/HOBt的DMF溶液预活化4分钟，并转移至反应容器。这可以在Sonata设备上如下实现：将固体Fmoc-氨基酸加到该设备的氨基酸容器中，然后给该设备设定好程序，以序贯加入DMF、HOBt/DMF和DIC/DMF，并在每次加入后使溶液鼓泡。
[0070] 为优化得率，可解决在较长肽的合成过程中树脂的聚集问题，该问题即便在使用最佳偶联试剂时也可能是破坏性的。为减少肽组装过程中的聚集，可使用的策略是采用假脯氨酸二肽掺入X-Thr或X-Ser(X是指序列的n-1个氨基酸)作为二肽代替X和Thr或X和Ser的序贯偶联。因此，对于单体(12)Ac-Ala-Gly-Pro-Thr-Trp-Cys-Glu-Asp-Asp-Trp-Tyr-Tyr-Cys-Trp-Leu-Phe-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys(ivDde)-NH2环(6-13)二硫化物，适Me，当保护的Thr和Gly(如上粗体字所示)的序贯偶联可被假脯氨酸二肽Fmoc-Gly-Thr(ψMe
pro)-OH的单次偶联替代。类似地，在单体(13)Ac-Val-Cys-Trp-Glu-Asp-Ser-Trp-Gly-Gly-Glu-Val-Cys-Phe-Arg-Tyr-Asp-Pro-Gly-Gly-Gly-Lys(Adoa-Adoa)-NH2环(2-12)二硫Me，Me
化物的合成中，假脯氨酸二肽Fmoc-Asp(OtBu)-Ser(ψ pro)-OH可用于替代适当保护的Ser和Asp(如上粗体字所示)的序贯偶联。进一步优化可通过使用Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH和Fmoc-Gly-Gly-OH代替Fmoc-Gly-OH的顺序偶联而减少偶联次数来实现。-Gly-Gly-OH区段的活化可导致活化的酸性官能团和远端的酰胺官能团环化，得到无活性的二酮哌嗪；
这可以时间依赖性方式减少偶联得率。该问题可通过向反应容器中加入Fmoc-Glyn-OH(n＝
2、3)并顺序加入HOBt和DIC予以避免；活化的Fmoc-Glyn-OH可被树脂结合的氨基截获，然后发生变为二酮哌嗪的明显环化。在完成链延伸后，可脱去每个肽中的N-端Fmoc保护基，而游离氨基可被乙酰化。
pro)-OH的单次偶联替代。类似地，在单体(13)Ac-Val-Cys-Trp-Glu-Asp-Ser-Trp-Gly-Gly-Glu-Val-Cys-Phe-Arg-Tyr-Asp-Pro-Gly-Gly-Gly-Lys(Adoa-Adoa)-NH2环(2-12)二硫Me，Me
化物的合成中，假脯氨酸二肽Fmoc-Asp(OtBu)-Ser(ψ pro)-OH可用于替代适当保护的Ser和Asp(如上粗体字所示)的序贯偶联。进一步优化可通过使用Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH和Fmoc-Gly-Gly-OH代替Fmoc-Gly-OH的顺序偶联而减少偶联次数来实现。-Gly-Gly-OH区段的活化可导致活化的酸性官能团和远端的酰胺官能团环化，得到无活性的二酮哌嗪；
这可以时间依赖性方式减少偶联得率。该问题可通过向反应容器中加入Fmoc-Glyn-OH(n＝
2、3)并顺序加入HOBt和DIC予以避免；活化的Fmoc-Glyn-OH可被树脂结合的氨基截获，然后发生变为二酮哌嗪的明显环化。在完成链延伸后，可脱去每个肽中的N-端Fmoc保护基，而游离氨基可被乙酰化。
[0071] 假正交保护的衍生物Fmoc-Lys(ivDde)-OH可用于使单体和二聚体肽的C-末端赖氨酸ε-胺选择性无掩蔽，并使它们随后官 能化，这也可以被优化。可使用10％肼的DMF溶液，来脱去每个肽单体C-末端赖氨酸ε-胺上的ivDde基团。然后，可使用4当量的Fmoc氨基酸以及各4当量的DIC和HOBt的DMF溶液，使Fmoc-Adoa(用于单体(13))或Lys(ivDde)(用于单体(12))接在暴露的赖氨酸ε-氨基上，时间长达10小时。在完成合成后，可从树脂上切下肽序列，并使用“试剂B”(TFA∶水∶苯酚∶三异丙基硅烷，88∶5∶5∶2，体积/体积/重量/体积)脱保护4小时。在完成切割反应后，可使肽沉淀出来，用乙醚洗涤，并干燥。
[0072] 下面用于环化线性含二半胱氨酸肽的方法可用于提供最佳的单体肽放大。一般来说，线性二半胱氨酸肽的空气氧化可以约0.5-5mg/mL(对于公开的肽单体，在肽中约为0.18-1.8mM，在半胱氨酸硫醇中约为0.36-3.6mM)进行。为了在显著更高的浓度下起作用，DMSO辅助的二半胱氨酸肽环化允许在低至约50mL的溶液中以良好的得率环化约10g线性肽。因此，在室温下，粗线性二半胱氨酸肽可在95％DMSO-H2O(5mL/g)pH8.5中进行环化。环化进程可通过质谱和HPLC常规跟踪。尽管环化可在约36小时内基本完成，但反应混合物一般可搅拌达48小时。环状二硫化物肽可通过用CH3CN稀释从反应混合物中沉淀出来，所得的灰白色粗固体肽可通过过滤收集。这是从粗环状肽中除去DMSO的简便方法。
[0073] 单体肽(12)Ac-AGPTWC*EDDWYYC*WLFGTGGGK[K(ivDde)]-NH2的纯化和分离可如下*所述完成。值得注意的是，本文使用的符号“C”是指对二硫键作出贡献的半胱氨酸残基。
将0.5g粗肽溶解在达300mL的30％CH3CN的水(0.1％TFA)溶液中的尝试未获成功。因此，作为替代，粗肽(0.5g)可溶解在DMSO(5mL/g)中，该溶液可用20％CH3CN-水稀释至终体积为100mL。该溶液可过滤。滤过的溶液可加到用10％CH3CN(0.1％TFA)的水(0.1％TFA)溶液平衡的制备型HPLC柱(Waters， MS C18，10μ， 50×250mm)
上，该柱可用10％CH3CN(0.1％TFA)的水(0.1％TFA)溶 液洗脱，以从柱子中洗涤出DMSO。
然后，可在1分钟内将洗脱液的组成阶次升至35％CH3CN-水(0.1％TFA)，可以0.5％/分钟CH3CN(0.1％TFA)至水(0.1％TFA)的速度启动线性梯度，并跑柱50分钟。可在分析型反相C18柱(Waters XTerra MS-C18，10μ， 4.6×50mm)上检查洗脱流分的纯度，可合并纯度＞95％的含产物流分后冻干。对于每0.5g粗肽的纯化，均可分离出0.1g(20％)的(12)Ac-AGPTWC*EDDWYYC*WLFGTGGGK[K(ivDde)]-NH2。已发现重复纯化始终得到同样得率和纯度的肽。
将0.5g粗肽溶解在达300mL的30％CH3CN的水(0.1％TFA)溶液中的尝试未获成功。因此，作为替代，粗肽(0.5g)可溶解在DMSO(5mL/g)中，该溶液可用20％CH3CN-水稀释至终体积为100mL。该溶液可过滤。滤过的溶液可加到用10％CH3CN(0.1％TFA)的水(0.1％TFA)溶液平衡的制备型HPLC柱(Waters， MS C18，10μ， 50×250mm)
上，该柱可用10％CH3CN(0.1％TFA)的水(0.1％TFA)溶 液洗脱，以从柱子中洗涤出DMSO。
然后，可在1分钟内将洗脱液的组成阶次升至35％CH3CN-水(0.1％TFA)，可以0.5％/分钟CH3CN(0.1％TFA)至水(0.1％TFA)的速度启动线性梯度，并跑柱50分钟。可在分析型反相C18柱(Waters XTerra MS-C18，10μ， 4.6×50mm)上检查洗脱流分的纯度，可合并纯度＞95％的含产物流分后冻干。对于每0.5g粗肽的纯化，均可分离出0.1g(20％)的(12)Ac-AGPTWC*EDDWYYC*WLFGTGGGK[K(ivDde)]-NH2。已发现重复纯化始终得到同样得率和纯度的肽。
[0074] 肽单体(13)Ac-VC*WEDSWGGEVC*FRYDPGGGK(Adoa-Adoa)-NH2，可按对肽单体(12)的描述进行纯化和分离，只是目标肽可溶解在20％CH3CN(0.1％TFA)的0.1％TFA水溶液(0.5g肽/100mL)中，而不是含有DMSO的稀释液。所得的粗肽溶液可加到用10％CH3CN的水(0.1％TFA)溶液平衡的制备型HPLC柱(Waters， Prep MS C18，10μ，50×250mm，流速100mL/分钟)上。该柱可用10％CH3CN(0.1％TFA)/水(0.1％TFA)以
100mL/分钟洗脱5分钟。然后，可在1分钟内将洗脱液的组成阶次升至30％CH3CN(0.1％TFA)/水(0.1％TFA)，可启动0.5％/分钟CH3CN(0.1％TFA)至水(0.1％TFA)的线性梯度并保持，直至需要的肽从柱中完全洗脱出来。含有产物的流分可在Waters XTerra分析型反相C18柱(10μ， 上进行分析，可合并纯度＞95％的含产物流分后冻干，得到环状二硫化物肽单体(13)(0.12g，得率24％，纯度＞95％)。以此方式可连续纯化10g粗肽单体。
100mL/分钟洗脱5分钟。然后，可在1分钟内将洗脱液的组成阶次升至30％CH3CN(0.1％TFA)/水(0.1％TFA)，可启动0.5％/分钟CH3CN(0.1％TFA)至水(0.1％TFA)的线性梯度并保持，直至需要的肽从柱中完全洗脱出来。含有产物的流分可在Waters XTerra分析型反相C18柱(10μ， 上进行分析，可合并纯度＞95％的含产物流分后冻干，得到环状二硫化物肽单体(13)(0.12g，得率24％，纯度＞95％)。以此方式可连续纯化10g粗肽单体。
[0075] 下面描述的是制备前体二聚体肽(16)Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK[Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK(-Adoa-Adoa-Glut-K)[-NH2环(2-12)二硫化物]-NH2环(6-13)二硫化物的示例性方法。前体二聚体肽的制备可按两步法通过束缚单体肽而完成。首先，可使Ac-AGPTWC*EDDWYYC*WLFGTGGGK-[K(ivDdc)]-NH2(12)在DIEA(5当量)存在下与戊二酸二琥珀酰亚胺酯 (DSG，5当量)的DMF溶液反应30分钟。反应混合物可用乙酸乙酯稀释，这可导致肽的戊二酸单酰胺单NHS酯沉淀。可倾析出含有未反应的DSG的上清液，并可用乙酸乙酯洗涤单NHS酯几次，以除去痕量DSG。质谱数据证实形成的单NHS酯为纯净产物。该单NHS酯可再溶解在DMF中，并在DIEA(5当量)存在下与单体肽Ac-VC*WEDSWGGEVC*FRYDPGGGK(Adoa-Adoa)-NH2(13)反应。HPLC和MS结果表明形成具有ivDde的二聚体，为单一主要产物。可将反应混合物与肼(10％)的DMF溶液搅拌20分钟，脱去在二聚体Lys的ε-胺上的ivDde保护基。然后，溶液可用TFA酸化，用10％CH3CN(0.1％TFA)-水(0.1％TFA)稀释，加到制备型反相C18HPLC柱上，通过乙腈(0.1％TFA)至0.1％TFA水溶液的梯度洗脱进行纯化。为了提供所需量的前体二聚体肽，可使用每种单体肽0.5g至多达1g进行反应。在每种情况下，所需要的前体二聚体肽都可以得率约32％和纯度＞95％分离得到，证实了该程序的再现性和规模化。
[0076] 合成的最后一步可为DSPE-PEG2000-NH2磷脂铵盐(18)与前体二聚体肽的缀合。如前所述，DSPE-PEG2000-NH2的PEG2000部分名义上由45个乙二醇单元组成。然而，应当指出的是，该物质是含PEG物质的分布，其质量中心为含有45个乙烯氧基单元的名义化合物。
[0077] DSPE-PEG2000-NH2与前体二聚体肽的缀合可通过制备前体二聚体的戊二酸单酰胺单NHS酯并使其与磷脂铵盐的游离氨基反应而完成。因此，具有ivDde的前体二聚体肽(16)可在DIEA(5当量)存在下与DSG(4当量)的DMF溶液反应30分钟。和在制备前体二聚体肽时一样，溶液可用乙酸乙酯稀释，以将二聚体戊二酸单酰胺单NHS酯(17)沉淀出来成为固体。上清液可被倾析出去，以除去未反应的DSG。然后，可用乙酸乙酯洗涤固体二聚体肽的戊二酸单酰胺单NHS酯(17)几次，以除去痕量DSG。质谱结果证实形成的肽二聚体戊二酸单酰胺单NHS酯为纯净产物。
[0078] 二聚体戊二酸单酰胺单NHS酯(17)可溶解在DMF-CH2Cl2(8∶2)中，并在DIEA(4当量)存在下与DSPE-PEG2000-NH2磷脂铵盐(0.9当量)反应24小时。可过量使用NHS酯(17)，以使磷脂铵盐的消耗最大化，因为任何游离的磷脂都可使终产物的纯化和分离复杂化。反应混合物可用水(0.1％TFA)-CH3CN-CH3OH(1∶1)(0.1％TFA)(约100mL)稀释，加到反相C4柱 Prep C4，10μ， 50×250mm，流速100mL/分钟)上，该柱可用水(0.1％TFA)-CH3CN-CH3OH(1∶1)(0.1％TFA)溶剂混合物洗脱，以除去亲水杂质。然后，产物可用CH3CN-CH3OH(1∶1)(0.1％TFA)至水(0.1％TFA)的梯度洗脱。可使用ELS检测器，通过反相HPLC对所收集的流分进行分析，ELS检测器允许检测需要的产物以及经常难以分离的DSPE-PEG2000-NH2磷脂铵盐，其UV发色团不太强。这表明二聚体肽磷脂缀合物和DSPE-PEG2000-NH2磷脂铵盐完全分开。可收集含有纯产物的流分，在旋转蒸发器上浓缩(以减少甲醇含量)，冻干，得到二聚体肽磷脂缀合物(无色固体)。
[0079] 为了制备所需量的二聚体肽磷脂缀合物，可使用0.5g至1.0g的前体二聚体肽实施几个轮次。在所有情况下，目标二聚体肽磷脂缀合物都可以以得率57-60％和纯度＞99％分离得到。得自上述连续轮次的大量二聚体肽磷脂缀合物可如下获得：将各个轮次的产物溶解在叔丁醇-乙腈-水(1∶1∶3)中，然后冻干。可对二聚体肽磷脂缀合物的大量样品应用定量评价游离硫醇的Ellman方法；游离硫醇即便有也在检出限以下。氨基酸组成分析得到的结果在可接受的限度内，支持确定的肽衍生物结构。MALDI-TOF质谱分析也支持假定的二聚体肽磷脂缀合物结构。
[0080] 制备具有低水平或可忽略水平的TFA的二聚体-磷脂缀合物的方法
[0081] 本发明还提供用于生产具有非常低水平的TFA的二聚体肽-磷脂缀合物的方法。尽管某些方法在克级上提供了这些缀合物 的合成和纯化，但已在5℃储存冻干物质时或储存缀合物的水溶液时观察到有溶解形式(lyso-version)的缀合物形成。一般认为，溶解型化合物(lyso-compound)经由对二聚体肽-磷脂缀合物中的一种磷脂脂肪酸酯的TFA促进的酸水解而形成。
[0082] 为获得磷脂肽作为具有药学上可接受的抗衡离子的稳定物质，发现了用于获得二聚体肽-磷脂缀合物的高效方法，该方法将二聚体肽-磷脂缀合物的TFA盐或其任何适宜的前体转变为类似的药用乙酸盐。下面提供了这些方法的代表性实施方案。
[0083] 表3提供了对图6、7和8中显示的识别标记的描述。
[0084] 表3
[0085]
[0086] 其中m、n、x、y、z随冻干条件的不同而变化。
[0087] 现在参考图6和7，在某些实施方案中，杂二聚体肽(27)的单体肽组分，即TFA盐化合物(22)和(25)，使用阶梯梯度的乙酸铵在大孔磺酸阳离子交换树脂AG MP-50上进行离子交换层析，以将它们转变为它们的乙酸盐。然后，这两个肽单体乙酸盐(23)和(26)可通过戊二酰接头束缚而形成为乙酸盐的二聚体(27)。使用线性梯度法并采用各含10mM NH4OAc的CH3CN/H2O，通过C-18制备型HPLC纯化(27)的粗二聚体乙酸盐，得到纯的二聚体乙酸盐(27)。此二聚体与DSPE-PEG2000-NH2(29)缀合并通过C-3制备型HPLC使用CH3CN/H2O/NH4OAc最终纯化粗混合物，得到为乙酸盐的化合物(21)。
[0088] 更具体地说，化合物(22)、(25)和(27)全都具有侧链羧酸和氨基。可使用一种大孔阳离子交换树脂AGMP-50，使得肽可以完全穿过树脂，并利用其碱性(氨基和胍基)开发肽的固定化。肽的TFA盐可吸附至AG MP-50柱(磺酸形式)，该柱可用水洗涤，然后根据肽的溶解度，用NH4OAc在0或30％CH3CN/H2O中的阶梯梯度进行洗脱。所述肽可以约600mM NH4OAc洗脱，然后，可获得纯形式的肽的乙酸盐形式。IC氟分析和CE TFA抗衡离子分析都一致表明所述肽中的TFA含量非常低。
[0089] 优选方法还包括将最终的肽重溶解/重冻干几次，以除去残余的NH4OAc。否则，所述肽中存在的残余痕量NH4OAc可在DIEA存在下产生游离氨。这可以导致在随后的由单体(23)和(26)制备(27)或者由(27)的乙酸盐制备最终的磷脂-肽缀合物(21)中形成不需要的肽-Glut-酰胺作为主要产物。
[0090] 现在参考图7，另一个实施方案提供通过在大孔磺酸阳离子交换树脂AG MP-50上进行离子交换层析，将二聚体(27)的TFA盐转变为其类似乙酸盐。此二聚体乙酸盐然后可与DSPE-PEG2000-NH2缀合，接着使用CH3CN/H2O/NH4OAC通过C-3制备型柱纯化粗物质，得到为乙酸盐的最终化合物(21)。
[0091] 尽管上述方法以及图6和7中的方法提供了极佳的结果，但是，第二种方法的优势是需要较少的步骤。其它细节见下面的实施例部分。
[0092] 转到图8，另一个实施方案利用磷脂-肽缀合物(21)和TFA离子之间的大小差异提供了用于生产TFA含量最少的二聚体缀合物的方法。在该实施方案中，在碳酸氢铵缓冲液存在下，21·nTFA加合物可从大小排阻柱上洗脱下来。起初，可在Zorbax C-3柱上，使用乙腈至水的线性梯度，通过制备型HPLC使粗21·nTFA不含溶解型化合物。两相都可以用10mM乙酸铵缓冲。如分析型HPLC所示，这提供了溶解型化合物的分离。
[0093] 为进一步减少TFA的量，可将所得材料加到SephadexG-25柱上，再用碳酸氢铵水溶液洗脱。洗脱液可通过HPLC监测。可合并含产物流分后冻干，得到基本上不含TFA但具有高回收率的所需物质(21)。其它细节见下面的实施例部分。
[0094] 本文所述的单体和二聚体肽磷脂缀合物可掺入到超声造影剂如含气微囊泡中。所述含气微囊泡包括例如含气微泡、含气微球、含气微囊等。在一个优选实施方案中，肽磷脂缀合物可掺入到含有含气微泡的超声造影剂中。由磷脂和磷脂缀合物制备含气微泡的方法是本领域技术人员已知的。例如，本发明的微泡可通过任一个以下专利中所述方法制备：EP554213、WO04/069284、美国专利第5,413,774号、美国专利第5,578,292号、EP744962、EP682530、美国专利第5,556,610号、美国专利第5,846,518号、美国专利第6,183,725号、EP474833、美国专利第5,271,928号、美国专利第5,380,519号、美国专利第5,531,980号、美国专利第5,567,414号、美国专利第5,658,551号、美国专利第5,643,553号、美国专利第5,911,972号、美国专利第6,110,443号、美国专利第6,136,293号、EP619743、美国专利第5,445,813号、美国专利第5,597,549号、美国专利第5,686,060号、美国专利第
6,187,288号和美国专利 第5,908,610号，这些专利整体在此引入作为参考。特别优选在WO04/069284中公开的方法。
6,187,288号和美国专利 第5,908,610号，这些专利整体在此引入作为参考。特别优选在WO04/069284中公开的方法。
[0095] 适宜的磷脂包括甘油与一个或两个分子的脂肪酸(相同的或不同的)和磷酸的酯，其中磷酸残基又与亲水基团键合，例如胆碱、丝氨酸、肌醇、甘油、乙醇胺等基团。磷脂中存在的脂肪酸一般为长链脂肪酸，通常含有12-24个碳原子，优选含有14-22个碳原子，可为饱和的，或者可含有一个或多个不饱和的。适宜的脂肪酸的实例为月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山萮酸、油酸、亚油酸和亚麻酸。磷脂的单酯在本领域已知为磷脂的“溶解”形式(“lyso”form)。
[0096] 磷脂的其它实例为磷脂酸(即甘油-磷酸与脂肪酸的二酯)、鞘磷脂(即其中具有脂肪酸的甘油二酯的残基被神经酰胺链置换的那些磷脂酰胆碱类似物)、心磷脂(即1，3-二磷脂酰甘油与脂肪酸的酯)、神经节苷脂、脑苷脂等。
[0097] 本文使用的术语磷脂包括可单独使用或作为混合物使用的天然、半合成或合成制备的产物。
[0098] 天然磷脂的实例为天然卵磷脂(磷脂酰胆碱(PC)衍生物)，例如通常为大豆或蛋黄卵磷脂。半合成磷脂的实例为天然卵磷脂的部分或完全氢化衍生物。
[0099] 合成磷脂的实例为例如二月桂酰-磷脂酰胆碱(“DLPC”)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(“DMPC”)、二棕榈酰-磷脂酰胆碱(“DPPC”)、二花生四烯酰磷脂酰胆碱(“DAPC”)、二硬脂酰-磷脂酰胆碱(“DSPC”)、1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱(“MPPC”)、1-棕榈酰-2-肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(“PMPC”)、1-棕榈酰-2-硬脂酰磷脂酰胆碱(“PSPC”)、1-硬脂酰-2-棕榈酰-磷脂酰胆碱(“SPPC”)、二油酰磷脂酰胆碱(“DOPC”)、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(乙基-DSPC)、二月桂酰-磷脂酰甘油(“DLPG”)及其碱金属盐、二花生四烯酰磷脂酰甘油(“DAPG”)及其碱金属盐、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油 (“DMPG”)及其碱金属盐、二棕榈酰-磷脂酰甘油(“DPPG”)及其碱金属盐、二硬脂酰磷脂酰甘油(“DSPG”)及其碱金属盐、二油酰磷脂酰甘油(“DOPG”)及其碱金属盐、二肉豆蔻酰磷脂酸(“DMPA”)及其碱金属盐、二棕榈酰磷脂酸(“DPPA”)及其碱金属盐、二硬脂酰磷脂酸(“DSPA”)、二花生四烯酰磷脂酸(“DAPA”)及其碱金属盐、二肉豆蔻酰磷脂酰-乙醇胺(“DMPE”)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(“DPPE”)、二硬脂酰磷脂酰-乙醇胺(“DSPE”)、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸(“DMPS”)、二花生四烯酰磷脂酰丝氨酸(“DAPS”)、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸(“DPPS”)、二硬脂酰磷脂酰丝氨酸(“DSPS”)、二油酰磷脂酰丝氨酸(“DOPS”)、二棕榈酰鞘磷脂(“DPSP”)和二硬脂酰鞘磷脂(“DSSP”)。
[0100] 适宜的磷脂还包括通过使亲水聚合物与其连接而修饰的磷脂。经修饰的磷脂的实例为用聚乙二醇(PEG)修饰的磷脂酰乙醇胺(PE)，简称“PE-PEG”，即磷脂酰乙醇胺中的亲水乙醇胺部分连接可变分子量(例如从300道尔顿到5000道尔顿)的PEG分子，例如DPPE-PEG、DSPE-PEG、DMPE-PEG或DAPE-PEG(其中DAPE为1，2-二花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)，其组成中还可以包含其它的两亲化合物，包括例如脂肪酸，例如棕榈酸、硬脂酸、花生四烯酸或油酸；甾醇，例如胆固醇，或甾醇与脂肪酸或与糖酸的酯；甘油或甘油酯，包括甘油三棕榈酸酯、甘油二硬脂酸酯、甘油三硬脂酸酯、甘油二肉豆蔻酸酯、甘油三肉豆蔻酸酯、甘油二月桂酸酯、甘油三月桂酸酯、甘油二棕榈酸酯；叔或季烷基铵盐，例如1，2-二硬脂酰-3-三甲基铵-丙烷(DSTAP)、1，2-二棕榈酰-3-三甲基铵-丙烷(DPTAP)及其混合物和组合。
[0101] 优选地，所述制剂含有至少一种带有总净电荷的组分，例如磷脂酸、PE-PEG、棕榈酸、硬脂酸、乙基-DSPC或DSTAP，优选摩尔量低于约50％。特别优选的制剂可包括两种或更多种以下组分的混合物：DSPC、DPPG、DPPA、DSPE-PEG1000、DSPE-PEG2000、棕榈酸和硬脂酸。某些优选的磷脂和制剂在实施例 中有描述。可使用本文公开的或本领域技术人员已知的任何气体；但优选惰性气体，例如SF6或全氟化碳，如CF4、C3F8和C4F10，，其任选地与空气、氮气、氧气或二氧化碳等其它气体混合。
[0102] 可使用已知方法，例如冷冻干燥或喷雾干燥粗磷脂在适宜溶剂中的溶液，或使用以下文献中所述的方法，由磷脂制备本发明的优选微泡混悬液：EP554213、WO04/069284、美国专利第5,413,774号、美国专利第5,578,292号、EP744962、EP682530、美国专利第5,556,610号、美国专利第5,846,518号、美国专利第6,183,725号、EP474833、美国专利第
5,271,928号、美国专利第5,380,519号、美国专利第5,531,980号、美国专利第5,567,414号、美国专利第5,658,551号、美国专利第5,643,553号、美国专利第5,911,972号、美国专利第6,110,443号、美国专利第6,136,293号、EP619743、美国专利第5,445,813号、美国专利第5,597,549号、美国专利第5,686,060号、美国专利第6,187,288号和美国专利第
5,908,610号，所述专利整体在此引入作为参考。优选地，如国际专利申请WO04/069284中所公开的，可制备包含磷脂(例如DSPC和/或DSPA)的微乳状液，所述磷脂与冻干保护剂(例如糖、糖醇、聚二元醇及其混合物，如后文详述所示)和任选的其它两亲物质(例如硬脂酸)混合，分散在水乳状液和水不混溶有机溶剂的乳状液中。优选的有机溶剂在水中的溶解度为1.0g/L以下，优选低于约0.01g/L，包括例如戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、
1-戊烯、2-戊烯、1-辛烯、环戊烷、环己烷、环辛烷、1-甲基-环己烷、苯、甲苯、乙苯、1，2-二甲苯、1，3-二甲苯、二丁醚和二异丙酮、氯仿、四氯化碳、2-氯-1-(二氟甲氧基)-1，1，2-三氟乙烷(恩氟烷)、2-氯-2-(二氟甲氧基)-1，1，1-三氟乙烷(异氟烷)、四氯-1，1-二氟乙烷、全氟戊烷、全氟己烷、全氟庚烷、全氟壬烷、全氟苯、全氟萘烷、甲基全氟丁醚、甲基全氟异丁醚、乙基全氟丁醚、乙基全氟异丁醚及其混合物。本发明的肽-磷脂缀合物可与磷脂一起混合在微乳状液中，形成微囊泡包 囊。优选地，首先制备肽-磷脂缀合物和PE-PEG(例如DSPE-PEG2000)的水性混悬液，然后将其与含有磷脂和冻干保护剂的水性混悬液-有机乳状液混合在一起。优选在加热(例如约40℃至80℃)时进行混合。
5,271,928号、美国专利第5,380,519号、美国专利第5,531,980号、美国专利第5,567,414号、美国专利第5,658,551号、美国专利第5,643,553号、美国专利第5,911,972号、美国专利第6,110,443号、美国专利第6,136,293号、EP619743、美国专利第5,445,813号、美国专利第5,597,549号、美国专利第5,686,060号、美国专利第6,187,288号和美国专利第
5,908,610号，所述专利整体在此引入作为参考。优选地，如国际专利申请WO04/069284中所公开的，可制备包含磷脂(例如DSPC和/或DSPA)的微乳状液，所述磷脂与冻干保护剂(例如糖、糖醇、聚二元醇及其混合物，如后文详述所示)和任选的其它两亲物质(例如硬脂酸)混合，分散在水乳状液和水不混溶有机溶剂的乳状液中。优选的有机溶剂在水中的溶解度为1.0g/L以下，优选低于约0.01g/L，包括例如戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、
1-戊烯、2-戊烯、1-辛烯、环戊烷、环己烷、环辛烷、1-甲基-环己烷、苯、甲苯、乙苯、1，2-二甲苯、1，3-二甲苯、二丁醚和二异丙酮、氯仿、四氯化碳、2-氯-1-(二氟甲氧基)-1，1，2-三氟乙烷(恩氟烷)、2-氯-2-(二氟甲氧基)-1，1，1-三氟乙烷(异氟烷)、四氯-1，1-二氟乙烷、全氟戊烷、全氟己烷、全氟庚烷、全氟壬烷、全氟苯、全氟萘烷、甲基全氟丁醚、甲基全氟异丁醚、乙基全氟丁醚、乙基全氟异丁醚及其混合物。本发明的肽-磷脂缀合物可与磷脂一起混合在微乳状液中，形成微囊泡包 囊。优选地，首先制备肽-磷脂缀合物和PE-PEG(例如DSPE-PEG2000)的水性混悬液，然后将其与含有磷脂和冻干保护剂的水性混悬液-有机乳状液混合在一起。优选在加热(例如约40℃至80℃)时进行混合。
[0103] 在通过分散在水性载体中形成微泡混悬液之前，使冻干或喷雾干燥的磷脂粉末与空气或其它气体接触。当与水性载体接触时，其结构已被破坏的粉末状磷脂将形成片状化或层状化部分，这些部分将使分散在其中的气体的微泡稳定。该方法允许生产即便在长期储存时也稳定的微泡混悬液，仅仅将无水的层状化磷脂(其已在所需气体下储存)溶解就可获得，无需振摇或任何其它剧烈搅拌。
[0104] 或者，可如例如WO97/29783中所公开的，通过以高速搅拌将气体悬浮在水性溶液中制备微泡。微泡的其它制备方法公开于WO2004/069284，该文献在此引入作为参考，其包括在磷脂存在下在水性介质中制备有机溶剂的乳状液，随后在任选的洗涤和/或过滤步骤之后将所述乳状液冻干。在实施例中公开了某些优选的制备方法。
[0105] 用于制备含气微泡的制剂最好还可以含有冻干添加剂，例如具有冷冻保护作用和/或冻干保护作用的物质，和/或填充剂，例如氨基酸，如甘氨酸；碳水化合物，例如糖，如蔗糖、甘露醇、麦芽糖、海藻糖、葡萄糖、乳糖或环糊精，或多糖，例如葡聚糖；或聚二元醇，例如聚乙二醇(例如PEG-4000)。
[0106] 任何这些超声组合物都还应尽可能地与血液等渗。因此，在注射前，可向任何上述超声造影剂混悬液中加入少量等渗剂。等渗剂是医学上常用的生理溶液，它们包括盐水溶液(0.9％NaCl)、2.6％甘油溶液、5％葡萄糖溶液等。另外，超声组合物可以包括药学上可接受的标准添加剂，包括例如乳化剂、粘度调节剂、冷冻保护剂、冻干保护剂、填充剂等。
[0107] 任何生物相容性气体都可以用于本发明的超声造影 剂。本文使用的术语“气体”包括在正常人体温度下基本上呈气体形式的任何物质(包括混合物)。所述气体因此可以包括例如空气、氮气、氧气、CO2、氩气、氙气或氪气、氟化气体(包括例如全氟化碳、SF6、SeF6)；低分子量的烃(例如含有1-7个碳原子)，例如烷烃，例如甲烷、乙烷、丙烷、丁烷或戊烷，环烷烃，例如环丙烷、环丁烷或环戊烷，烯烃，例如乙烯、丙烯、丙二烯或丁烯，或者炔烃，例如乙炔或丙炔，和/或它们的混合物。然而，优选氟化气体。氟化气体包括含有至少一个氟原子的物质，例如SF6、氟利昂(含有一个或多个碳原子和氟原子的有机化合物，即CF4、C2F6、C3F8、C4F8、C4F10、CBrF3、CCl2F2、C2ClF5和CBrClF2)和全氟化碳。术语全氟化碳是指只含有碳和氟原子的化合物，尤其包括饱和的、不饱和的和环状全氟化碳。通常优选的饱和全氟化碳具有式CnFn+2，其中n为1-12，优选2-10，最优选3-8，甚至更优选3-6。适宜的全氟化碳包括例如CF4、C2F6、C3F8C4F8、C4F10、C5F12、C6F2、C7F14、C8F18和C9F20。最优选地，所述气体或混合气体包括SF6或选自以下的全氟化碳：C3F8C4F8、C4F10、C5F2、C6F12、C7F14、C8F18，特别优选C4F10。另参见WO97/29783、WO98/53857、WO98/18498、WO98/18495、WO98/18496、WO98/18497、WO98/18501、WO98/05364、WO98/17324。在一个优选实施方案中，所述气体包括C4F10或SF6，其任选地与空气、氮气、氧气或二氧化碳混合。
[0108] 在某些情况下，可能需要包括气体物质的前体(例如能够在体内转变为气体的物质，通常称为“气体前体”)。优选地，气体前体和其产生的气体是生理上可接受的。气体前体可为pH活化的、光活化的、温度活化的，等等。例如，某些全氟化碳可用作温度活化的气体前体。这些全氟化碳，例如全氟戊烷，具有在室温(或生产和/或储存该物质的温度)以上但在体温以下的液相/气相转变温度；因此它们经历相移，并在人体内转变为气体。
[0109] 如上所述，气体可以包括混合气体。以下组合是特别 优选的混合气体：气体(A)和(B)的混合物，其中气体(B)(以0.5-41％(体积)的量存在，分子量大于80道尔顿，并为氟化气体)和(A)中的至少一种选自空气、氧气、氮气、二氧化碳及其混合物，混合物的余量为气体A。
[0110] 除非其包含已知需要特定储存条件的超极化气体，否则冻干产品可储存和运输，而不需要对其环境进行温度控制，具体地说，其可以提供给医院和医师，用于现场配制为即用的给药混悬液，无需这些用户具有特定的储存设备。优选地，在这种情况下，其可以双组分药盒的形式提供，该药盒可装有两个独立的容器或双室容器。在前一种情况下，优选地，该容器为常规的隔膜密封小瓶，其中装有步骤b)的冻干残余物的小瓶用隔膜密封，可使用任选的预灌装注射器通过该隔膜注射载液。在此情况下，然后还使用用作第二种组分的容器的注射器注射造影剂。在后一种情况下，优选地，双室容器为双室注射器，一旦冻干物被重配，则适宜地混合或轻轻地振荡，该容器可直接用于注射造影剂。在这两种情况下，均提供用于将足够的气泡形成能量引入或允许应用于容器内容物的方法。然而，如上所述，在本发明的稳定造影剂中，气体微泡的尺寸基本上与施加到重配干燥产品的搅拌能量无关。因此，一般只需要轻轻用手摇动就可产生微泡尺寸均一的可再制产品。
[0111] 本领域一般技术人员会意识到，其它能够以无菌方式混合干粉和水溶液的两室重配系统也在本发明的范围之内。在这类系统中，如果水相可介于水不溶性气体和环境之间，则特别有利于延长产品的保存期。在形成造影剂所需的物质(例如在重配过程中连接至磷脂的靶向配体)在容器中已经不存在时，可与药盒的其它组分一起包装，优选为适于与药盒的其它组分简便组合的形式或容器。
[0112] 不需要特定的容器、小瓶或连接系统；本发明可使用常规容器、小瓶和适配器。唯一的要求是塞子和容器之间的良好密封。因此，密封质量成为首要考量的问题；密封完整性的任何减低 都可能使不需要的物质进入小瓶。除了确保无菌之外，真空保留度对于环境压力或减压下封塞的产品是必需的，以确保安全和正确的重配。塞子可为化合物或基于合成橡胶的多组分配方，例如聚(异丁烯)橡胶或丁基橡胶。
[0113] 在超声应用中，例如可给予由磷脂稳定的微泡制成的造影剂，给予剂量使得注射磷脂的量在0.1-200μg/kg体重的范围内，优选约0.1-30μg/kg。
[0114] 可用于本发明的超声成像技术包括已知技术，例如彩色多普勒、能量多普勒、多普勒幅度、刺激性声成像以及二维或三维成像技术。成像可以谐波(共振频率)或基谐模式进行，优选第二谐波。
[0115] 本发明的超声造影剂还可以用于多种治疗性成像方法。术语治疗性成像在其含义中包括用于治疗患者的疾病的任何方法，其包括使用造影成像剂(例如用于将治疗剂递送到选定的受体或组织)，并在体外和/或体内能够发挥或负责发挥生物学作用。治疗性成像最好可与含气微囊泡的受控的局部破坏相关联，例如利用高声压(通常高于一般用于非破坏性诊断成像方法的声压)超声爆裂。此受控的破坏例如可用于治疗血凝块(一种也称为超声溶栓的技术)，任选地与适宜治疗剂的局部释放组合。或者，所述治疗性成像可包括由于在细胞水平由微囊泡的局部爆裂诱导的瞬时膜穿透而将治疗剂递送到细胞中。该技术可用于例如将遗传物质有效递送到细胞中；任选地，药物可与遗传物质组合局部递送，由此允许对患者进行联合药物/遗传治疗(例如对癌症治疗而言)。
[0116] 术语“治疗剂”在其含义中包括可用于任何治疗用途(例如用于治疗患者的疾病的方法)的任何物质、组合物或颗粒，以及在体外和/或体内能够发挥或负责发挥生物学作用的任何物质。治疗剂因此包括能够用于治疗(包括诊断、预防、缓解、疼痛减轻或治愈)患者的任何病理状况(包括疾病、不适、病灶或损伤)的任何化合 物或物质。治疗剂的实例为药物、药剂、生物活性剂、细胞毒性剂、化疗剂、放疗剂、蛋白质、天然或合成肽(包括寡肽和多肽)、维生素、类固醇和遗传物质，包括核苷、核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸和质粒。
[0117] 材料与分析方法
[0118] 用于反应、层析纯化和HPLC分析的溶剂为来自VWRCorporation(West Chester，PA)的E.Merck Omni级溶剂。N-甲基吡咯烷酮(NMP)和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)得自Pharmco Products Inc.(Brookfield，CT)，为肽合成级或低水/无胺的生物技术级质量。哌啶(测序级，重蒸馏99+％)和三氟乙酸(TFA)(分光光度级或测序级)得自Sigma-Aldrich Corporation(Milwaukee，WI) 或 得 自 Fluka Chemical Division of Sigma-Alrich Corporation。N，N′-二异丙基碳二亚胺(DIC)、苯酚(99％)、N，N-二异丙基乙胺(DIEA)和三异丙基硅烷(TIS)购自Sigma-Aldrich Corporation。Fmoc-保护的氨基酸、假脯氨酸Me，Me Me，Me二肽、Fmoc-Asp(O-tBu)-Ser(ψ pro)-OH和Fmoc-Gly-Thr(ψ pro)-OH以及N-羟基苯并三唑(HOBt)得自Novabiochem(San Diego，CA)。Fmoc-8-氨基-3，6-二氧杂辛酸(Adoa)得自NeoMPS Corp(San Diego，CA)或Suven Life Sciences(Hyderabad，India)。戊二酸二琥珀酰亚胺酯(DSG)和1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸-乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)2000]铵盐、[DSPE-PEG2000-NH2]分别得自Pierce Chemical Co.(Rockford，TL.)和Litpids(Alabaster，AL)。通过与Fmoc-OSu反应由相应的三甘氨酸或二
甘氨酸自行制备Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH和Fmoc-Gly-Gly-OH。AG MP-50离子交换树脂得自Bio-Rad(Hercules，CA)。
甘氨酸自行制备Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH和Fmoc-Gly-Gly-OH。AG MP-50离子交换树脂得自Bio-Rad(Hercules，CA)。
[0119] 一 般 使 用 Shimadzu LC-10AT VP双 泵 梯 度 系 统，采 用 Waters XTerra MS-C184.6×50mm柱(粒径：5μ；孔径 和梯度或等度洗脱系统，使用水(0.1％TFA)作为洗脱剂A以及CH3CN (0.1％TFA)或CH3CN-CH3OH(1∶1，体积/体积)(0.1％TFA)作为洗脱剂B，获得分析型HPLC数据。化合物的检测使用UV于220nm和254nm
完成。磷脂-PEG-肽衍生物的纯度在YMC C-4(5μM， 4.6×250mm)柱上或在
Zorbax300SB-C3(3.5μM； 3×150mm)柱上使用SEDEX55光散射检测器(LSD)和UV
检测器进行测定。
完成。磷脂-PEG-肽衍生物的纯度在YMC C-4(5μM， 4.6×250mm)柱上或在
Zorbax300SB-C3(3.5μM； 3×150mm)柱上使用SEDEX55光散射检测器(LSD)和UV
检测器进行测定。
[0120] 制备型HPLC在装备配有制备流动池的SPD-10AV UV检测器的Shimadzu LC-8A双泵梯度系统上进行。一般来说，根据化合物特征将含有粗肽的溶液加到反相C18、C4或C3柱上，所述柱使用第三个泵连接至制备型Shimadzu LC-8A双泵梯度系统。在将粗产物混合物的溶液加到制备型HPLC柱后，反应溶剂和用作稀释剂的溶剂，例如DMF或DMSO，以低有机相组成由该柱洗脱下来。然后，使用洗脱液B至洗脱液A的梯度洗脱液洗脱所需产物。基于根据分析型HPLC和质谱分析确定的它们的纯度，合并含有产物的流分。冻干合并的流分，得到所需产物。
[0121] 在Yale University，New Haven，CT的Keck生物技术资源实验室进行氨基酸组成分析。质谱数据得自MScan Inc.(606Brandywine Parkway，West Chester，PA19380)，或用Agilent LC-MSD1100质谱仪自行获得。为了选择产物流分和表征目的，质谱值通常使用API-ES以负离子模式获得。一般而言，目标肽的分子量约为3000；质谱通常表现出-双重或三重负电荷离子质谱值，而不是[M-H]。这些一般用于在HPLC纯化过程中选择收集并合并的流分，得到纯肽。在某些情况下，流分在质谱中表现出归属于[M-2H]/2+57或[M-2H]/2+114的主峰。这些峰源于形成每分子肽一分子或两分子三氟乙酸的加合物。在通过比较MS结果和HPLC纯度以及冻干过程小心收集流分后，将少量分离的蓬松固体溶解在水中(0.5mg/mL)，并用一滴N-甲基-D-葡糖胺水溶液(约0.5M)处理。通过HPLC和MS分析该溶液的纯化肽的最终纯度结果。在N-甲基-D-葡糖胺存在下，肽溶液在质谱中未表现出[M-2H]/2+57或[M-2H]/2+114的质量值峰， 相反观察到预期的[M-2H]/2或[M-3H]/3峰。
[0122] 下面的非限制性实施例提供了有关用于获得大量高度纯化形式的单体和二聚体肽磷脂缀合物的有效方法的其他细节。这些非限制性实施例还描述了包含这些单体和二聚体肽磷脂缀合物的代表性靶向微泡的制备方法。这些实施例还描述了这些靶向微泡在静态结合测试中对KDR转染细胞的用途以及在动态结合测试中对rhVEGF-R2/Fc嵌合蛋白的用途。这些实施例还描述了在兔VX2肿瘤模型中评价含有KDR结合脂肽的超声造影剂。实施例
[0123] 下面的实施例1-2涉及示于图2的单体肽磷脂缀合物。此化合物的合成方法见图1。尽管这些实施例更具体地涉及合成示于图2的化合物的方法，但可使用类似方法制备示于图10的单体肽磷脂缀合物和示于图9的线性肽单体(32)以及其它单体肽-磷脂缀合物。
另外，同时待审的美国申请第10/661,156号(2003年9月11日申请)记载了肽单体的制备方法，该申请整体在此引入作为参考。
另外，同时待审的美国申请第10/661,156号(2003年9月11日申请)记载了肽单体的制备方法，该申请整体在此引入作为参考。
[0124] 实施例1
[0125] 线性肽单体(2)Ac-RAQDWYYDEILSMADQLRHAFLSGGGGGK-NH2(SEQ ID NO.2)Ac-Arg-Ala-Gln-Asp-Trp-Tyr-Tyr-Asp-Glu-Ile-Leu-Ser-Met-Ala-Asp-Gln-Leu-Arg-His-Ala-Phe-Leu-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Lys-NH2；N-乙酰-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺酰-L-天冬氨酰-L-色氨酰-L-酪氨酰-L-酪氨酰-L-天冬氨酰-L-谷氨酰-L-异亮氨酰-L-亮氨酰-L-丝氨酰-L-甲硫氨酰-L-丙氨酰-L-天冬氨酰-L-谷氨酰-L-亮氨酰-L-精氨
酰-L-组氨酰-L-丙氨酰-L-苯丙氨酰-L-亮氨酰-L-丝氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨
酰-甘氨酰-甘氨酰-L-赖氨酰胺的固相合成(SPPS)和纯化
酰-L-组氨酰-L-丙氨酰-L-苯丙氨酰-L-亮氨酰-L-丝氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨
酰-甘氨酰-甘氨酰-L-赖氨酰胺的固相合成(SPPS)和纯化
[0126] 如下合成线性肽单体(2)：采用已建立的自动化方案，在 肽合成仪上，使用Fmoc-Pal-Peg-PS树脂(0.2mmol/g)、Fmoc-保护的氨基酸和DIC介导的在DMF中的HOBt酯活 化。通过SPPS法，在Fmoc-Pal-Peg-PS树脂上，以分步方式合成肽序列，通常为10mmol规模。氨基酸偶联用4倍过量的每种氨基酸以及DIC-HOBt试剂对的DMF溶液进行。
[0127] 在典型的氨基酸偶联中，每克树脂使用5mL无水DMF。基于使用的树脂计算的DMF总体积在用于溶液制备的氨基酸、HOBt和DIC之间分配。例如，对于包含50g(10mmol规模)树脂的合成，计算的250mL DMF体积在氨基酸(150mL)、HOBt(50mL)和DIC(50mL)之间分配。在 合成仪上的氨基酸容器中装入固体无水氨基酸(相对于树脂4倍过量)。在偶联步骤开始时，使用设备的软件连续地传递选定体积的DMF(用于稀释氨基酸)和HOBt(4当量)的DMF溶液以及DIC(4当量)的DMF溶液，通过通入氮气启动混合，进行4分钟。这用于预活化氨基酸，并确保混合物的所有组分完全溶解。在活化后，软件介导活化的Fmoc-氨基酸溶液向装有树脂的反应容器转移。在转移完成后，搅拌容器3小时，同时周期性通入氮气。在3小时偶联时间后，用DMF(5mL/g，6次)彻底洗涤树脂，用含有HOBt(0.1M)的25％哌啶的DMF(5mL/g)溶液进行Fmoc基团的切割(2×10分钟)。用
DMF(5mL/g，6次)彻底洗涤树脂，以确保在制备中从树脂中完全除去哌啶，用以保证氨基酸偶联。就Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH和Fmoc-Gly-Gly-OH而言，在氨基酸瓶中不进行预活化，以便在如本文论述的活化时间当中使二酮哌嗪的形成减至最低。因此，在这两种情况下，将氨基酸、HOBt和DIC的溶液序贯加入反应容器，并以“原位”活化实施偶联方法。
DMF(5mL/g，6次)彻底洗涤树脂，以确保在制备中从树脂中完全除去哌啶，用以保证氨基酸偶联。就Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH和Fmoc-Gly-Gly-OH而言，在氨基酸瓶中不进行预活化，以便在如本文论述的活化时间当中使二酮哌嗪的形成减至最低。因此，在这两种情况下，将氨基酸、HOBt和DIC的溶液序贯加入反应容器，并以“原位”活化实施偶联方法。
[0128] 在完成链延伸之后，按标准方式脱去N-末端氨基酸的Fmoc基团，接着用DMF进行标准洗涤(参见上文)。然后，通过用新鲜制备的乙酰化混合物(0.5M乙酸酐、0.125M DIEA和0.015MHOBt的DMF溶液，6mL/g树脂)处理2×20分钟给N-末端氨基酸加帽。在完成肽合成后，用切割混合物‘试剂B’(TFA∶水∶苯酚∶三异丙基硅烷，88∶5∶5∶2，体积/体积/重量/体积)(10mL/g树脂)处理树脂4 小时。除去挥发物，由此获得的膏状物用乙醚研磨，得到固体，再用乙醚洗涤(3次)，间插离心(以压紧悬浮固体，以便允许上清液倾析)，然后真空干燥，得到所需要的肽，为灰白色固体。10mmol规模的线性肽单体(2)合成得到33.82g(理论值的103％)粗肽。超过理论收率最有可能是源于潮湿和残余的溶剂。
[0129] 线性肽单体(2)Ac-RAQDWYYDEILSMADQLRHAFLSGGGGGK-NH2(SEQ ID NO.2)；Ac-Arg-Ala-Gln-Asp-Trp-Tyr-Tyr-Asp-Glu-Ile-Leu-Ser-Met-Ala-Asp-Gln-Leu-Arg-His-Ala-Phe-Leu-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Lys-NH2；N-乙酰-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺酰-L-天冬氨酰-L-色氨酰-L-酪氨酰-L-酪氨酰-L-天冬氨酰-L-谷氨酰-L-异亮氨酰-L-亮氨酰-L-丝氨酰-L-甲硫氨酰-L-丙氨酰-L-天冬氨酰-L-谷氨酰-L-亮氨酰-L-精氨
酰-L-组氨酰-L-丙氨酰-L-苯丙氨酰-L-亮氨酰-L-丝氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨
酰-甘氨酰-甘氨酰-L-赖氨酰胺的纯化
酰-L-组氨酰-L-丙氨酰-L-苯丙氨酰-L-亮氨酰-L-丝氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨
酰-甘氨酰-甘氨酰-L-赖氨酰胺的纯化
[0130] 将约0.5g部分的粗线性肽单体(2)溶解在最少量CH3CN(约20mL)中。用水将溶液体积调整至约100mL，使用第三个泵将溶液加到反相C18制备型柱(Waters，MS C18，10μ， 50×250mm，流速100mL/分钟)上，该柱已用10％CH3CN的水溶液
(0.1％TFA)预平衡。该柱在样品溶液上样的过程中不用平衡洗脱液洗脱。在样品溶液加到该柱后，在1分钟内将洗脱液的组成阶次升至20％CH3CN-水(0.1％TFA)，以0.6％/分钟CH3CN(0.1％TFA)至水(0.1％TFA)的速率开始线性梯度，并保持50分钟。使用220nm的UV作为产物洗脱液的指示器手动收集流分(15mL)。所收集的流分在Waters XTerra分析型反相C-18柱(5μ颗粒，孔径 上进行分析，合并纯度＞95％的含产物流分后冻干，得到相应的纯线性肽单体(2)。通常，0.5g粗产物(2)的纯化得到0.12g(得率24％)所需产物(纯度＞95％)。
(0.1％TFA)预平衡。该柱在样品溶液上样的过程中不用平衡洗脱液洗脱。在样品溶液加到该柱后，在1分钟内将洗脱液的组成阶次升至20％CH3CN-水(0.1％TFA)，以0.6％/分钟CH3CN(0.1％TFA)至水(0.1％TFA)的速率开始线性梯度，并保持50分钟。使用220nm的UV作为产物洗脱液的指示器手动收集流分(15mL)。所收集的流分在Waters XTerra分析型反相C-18柱(5μ颗粒，孔径 上进行分析，合并纯度＞95％的含产物流分后冻干，得到相应的纯线性肽单体(2)。通常，0.5g粗产物(2)的纯化得到0.12g(得率24％)所需产物(纯度＞95％)。
[0131] 实施例2
[0132] 单体肽磷脂缀合物(1)Ac-RAQDWYYDEILSMADQLRHAFLSGGGGGK(DSPE-PEG2000-NH-Glut)-NH2(SEQ ID NO.1)；Ac-Arg-Ala-Gln-Asp-Trp-Tyr-Tyr-Asp-Glu-Ile-Leu-Ser-Met-Ala-Asp-Gln-Leu-Arg-His-Ala-Phe-Leu-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Lys-(DSPE-PEG2000-NH-Glut)-NH2；N-乙酰-L-精氨酰-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺酰-L-天冬氨酰-L-色氨酰-L-色氨酰-L-天冬氨酰-L-异亮氨酰-L-谷氨酰-L-亮氨酰-L-丝氨酰-L-甲硫氨
酰-L-丙氨酰-L-天冬氨酰-L-谷氨酰胺酰-L-亮氨酰-L-精氨酰-L-组氨酰-L-丙氨
酰-L-苯丙氨酰-L-亮氨酰-L-丝氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-L-赖氨酰胺的制备
酰-L-丙氨酰-L-天冬氨酰-L-谷氨酰胺酰-L-亮氨酰-L-精氨酰-L-组氨酰-L-丙氨
酰-L-苯丙氨酰-L-亮氨酰-L-丝氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-L-赖氨酰胺的制备
[0133] 通过将肽单体(2)的戊二酸单酰胺单NHS酯(3)与DSPE-PEG2000-NH2磷脂铵盐(4)缀合来制备单体肽磷脂缀合物(1)Ac-RAQDWYYDEILSMADQLRHAFLSGGGGGK(DSPE-PEG2000-NH-Glut)-NH2(SEQ ID NO.1)。
[0134] 边搅拌边将无水二甲基甲酰胺(7.5mL)、戊二酸二琥珀酰亚胺酯(DSG，0.25g，0.75mmol)和二异丙基乙胺(0.10g，0.78mmol)序贯装入配有磁力搅拌棒和隔膜帽的圆底烧瓶。在2分钟时间段内将固体线性肽单体(2)(0.5g，0.152mmol)分批加入上述溶液中；
然后于室温搅拌该溶液30分钟。用无水乙酸乙酯将反应混合物稀释至约50mL；这导致中间体单NHS酯(3)-肽单体(2)的戊二酸单酰胺单NHS酯沉淀。离心溶液，以使单NHS酯(3)沉淀出来，为无色固体。将含有过量DSG的上清液从压紧的固体单NHS酯(3)中倾出，再将该酯分散在乙酸乙酯中，离心后再多清洗2次，以除去剩余的痕量DSG。将由此获得的固体中间体单NHS酯(3)溶解在无水DMF(10.0mL)中；加入二异丙基乙胺(0.10g，0.78mmol)；
搅拌混合物。
然后于室温搅拌该溶液30分钟。用无水乙酸乙酯将反应混合物稀释至约50mL；这导致中间体单NHS酯(3)-肽单体(2)的戊二酸单酰胺单NHS酯沉淀。离心溶液，以使单NHS酯(3)沉淀出来，为无色固体。将含有过量DSG的上清液从压紧的固体单NHS酯(3)中倾出，再将该酯分散在乙酸乙酯中，离心后再多清洗2次，以除去剩余的痕量DSG。将由此获得的固体中间体单NHS酯(3)溶解在无水DMF(10.0mL)中；加入二异丙基乙胺(0.10g，0.78mmol)；
搅拌混合物。
[0135] 此时，将DSPE-PEG2000-NH2磷脂铵盐(4)(0.38g，0.14mmol，0.9当量)悬浮在单独烧瓶中的无水二氯甲烷(2mL)中，加入三氟乙酸(2滴)，以使磷酸二酯氧质子化，这促进磷脂铵盐在二氯甲烷中的溶解。然后，在旋转蒸发器上蒸发澄清溶液以除去挥发物，进一步真空干燥。
[0136] 将固体磷脂铵盐(4)溶解在DMF(5mL)中，并转移至单NHS酯(3)的搅拌溶液中，于室温搅拌所得混合物24小时。用CH3OH和CH3CN-水(1∶1，体积/体积)的
1∶1混合物将反应混合物稀释至100mL，过滤不溶物。将一半滤过溶液加到反相C2制备型柱 C2，10μ， 50×250mm)上，该柱已用水(0.1％TFA)和
CH3OH-CH3CN(1∶1，体积/体积，0.1％TFA)的3∶1(体积/体积)混合物以100mL/分钟流速预平衡。值得注意的是，该柱在样品上样过程中不用平衡洗脱液洗脱。在加载样品溶液后，用平衡洗脱液洗柱子，直至洗脱出DMF塞流。在9分钟内将洗脱液的组成阶次升至
70％CH3OH-CH3CN(1∶1，0.1％TFA)，开始0.75％/分钟CH3OH-CH3CN(1∶1，0.1％TFA)至水(0.1％TFA)的线性梯度，并跑柱40分钟。使用UV(220nm)作为产物洗脱液的指示器收集流分(15mL)。使用220nm的UV和蒸发光散射检测器(ELSD)，在分析型HPLC系统(柱：
YMC C-4，5μ， 4.6×250mm)上检查流分的纯度。使用后一检测器(ELSD)来检测
DSPE-PEG2000-NH2磷脂铵盐(4)，其在220nm的UV吸光度非常低。合并纯度＞98％且没有DSPE-PEG2000-NH2磷脂铵盐(4)的含产物流分，在旋转蒸发器上浓缩，以减少CH3OH含量。
然后，用10％CH3CN的水溶液稀释浓缩溶液，直至形成微弱的絮状沉淀。冻干所得溶液，得到为无色固体的单体肽磷脂缀合物(1)。如上所述纯化第二部分的粗单体肽磷脂缀合物(1)。
目标单体肽磷脂缀合物(1)的合并产量为0.40g(得率47％)。
1∶1混合物将反应混合物稀释至100mL，过滤不溶物。将一半滤过溶液加到反相C2制备型柱 C2，10μ， 50×250mm)上，该柱已用水(0.1％TFA)和
CH3OH-CH3CN(1∶1，体积/体积，0.1％TFA)的3∶1(体积/体积)混合物以100mL/分钟流速预平衡。值得注意的是，该柱在样品上样过程中不用平衡洗脱液洗脱。在加载样品溶液后，用平衡洗脱液洗柱子，直至洗脱出DMF塞流。在9分钟内将洗脱液的组成阶次升至
70％CH3OH-CH3CN(1∶1，0.1％TFA)，开始0.75％/分钟CH3OH-CH3CN(1∶1，0.1％TFA)至水(0.1％TFA)的线性梯度，并跑柱40分钟。使用UV(220nm)作为产物洗脱液的指示器收集流分(15mL)。使用220nm的UV和蒸发光散射检测器(ELSD)，在分析型HPLC系统(柱：
YMC C-4，5μ， 4.6×250mm)上检查流分的纯度。使用后一检测器(ELSD)来检测
DSPE-PEG2000-NH2磷脂铵盐(4)，其在220nm的UV吸光度非常低。合并纯度＞98％且没有DSPE-PEG2000-NH2磷脂铵盐(4)的含产物流分，在旋转蒸发器上浓缩，以减少CH3OH含量。
然后，用10％CH3CN的水溶液稀释浓缩溶液，直至形成微弱的絮状沉淀。冻干所得溶液，得到为无色固体的单体肽磷脂缀合物(1)。如上所述纯化第二部分的粗单体肽磷脂缀合物(1)。
目标单体肽磷脂缀合物(1)的合并产量为0.40g(得率47％)。
[0137] 下面的实施例3-5涉及示于图5的二聚体肽磷脂缀合物。二聚体缀合物的示例性合成方法见图3、4、6、7和8。
[0138] 实施例3
[0139] 单体肽(12)Ac-AGPTWC*EDDWYYC*WLFGTGGGK[K(ivDde)]-NH2和(13)Ac-VC*WEDSWGGEVC*FRYDPGGGK(Adoa-Adoa)-NH2的固相合成(SPPS)、环化和纯化
[0140] 通过已 建立的 自动化 方案，在 肽合成 仪上，使 用Fmoc-Pal-Peg-PS树脂(0.2mmol/g)、Fmoc-保护的氨基酸和DCI介导的在DMF中的HOBt酯活化，合成线性肽。通过SPPS方法，在Fmoc-Pal-Peg-PS树脂上，以分步方式合成肽序列，通常为10mmol规模。用4倍过量的每种氨基酸以及DIC-HOBt试剂的DMF溶液进行氨基酸偶联。
[0141] 在典型的顺序氨基酸偶联中，每克树脂使用5mL无水DMF。基于使用的树脂计算的DMF总体积在用于溶液制备的氨基酸、HOBt和DIC之间分配。例如，对于包含50g树脂的合成，计算的250mL DMF体积在氨基酸(150mL)、HOBt(50mL)和DIC(50mL)之间分配。在肽合成仪上的氨基酸容器中装入固体无水氨基酸(相对于树脂4倍过量)。在偶联步骤开始时，连续地传递选定体积的DMF和HOBt(4当量)的DMF溶液以及DIC(4当量)的DMF溶液，在每次传递后通过通入氮气进行混合。在最后一次试剂传递后，通过通入氮气启动混合，进行4分钟。这用于预活化氨基酸，并确保混合物的所有组分完全溶解。
[0142] 在活化后，将活化的Fmoc-氨基酸溶液转移至装有树脂的反应容器。在转移完成后，搅拌容器3小时，同时周期性通入氮气。在3小时偶联时间后，用DMF(5mL/g，6次)彻底洗涤树脂，用含有HOBt(0.1M)的25％哌啶的DMF溶液(5mL/g)进行Fmoc基团的切割(2×10分钟)。用DMF(5mL/g，6次)彻底洗涤树脂，以确保在制备中从树脂中完全除去哌啶，用以保证氨基酸偶联。就Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH和Fmoc-Gly-Gly-OH而言，在氨基酸瓶中不进行预活化，以便在如本文论述的活化时间当中使二酮哌嗪的形成减至最低。因此，在这两种情况下，将氨基酸、HOBt和DIC的溶液序贯加入反应容器，并以“原位”活化实施偶联方法。在完成链延伸之后，按标准方式脱去N-末端氨基酸的Fmoc基团，接着用DMF进行标准洗涤(参见上文)。然后，通过用新鲜制备的乙酰化混合物(0.5M 乙酸酐、0.125M DIEA和0.015M HOBt的DMF溶液，6mL/g树脂)处理2×20分钟给N-末端氨基酸加帽。
[0143] 首先用新鲜制备的10％肼的DMF溶液(5mL/g树脂-2×10分钟)脱去ε-氨基上的ivDde基团，而完成单体肽(根据需要具有Fmoc-Adoa或Fmoc-Lys(ivDde))的C-末端赖氨酸部分ε-氨基的官能化。为添加Fmoc-Adoa或Fmoc-Lys(ivDde)，把偶联时间增加至10小时。在完成肽合成后，用切割混合物‘试剂B’(TFA∶水∶苯酚∶三异丙基硅烷，
88∶5∶5∶2，体积/体积/重量/体积)(10mL/g树脂)处理树脂4小时。真空蒸发挥
发物之后，用乙醚研磨膏状物，得到固体，通过过滤收集，再用乙醚洗涤，干燥。10mmol规模的(12)Ac-AGPTWC*EDDWYYC*WLFGTGGGK[K(ivDde)]-NH2合成得到30g(理论值的103％)粗肽。就(13)Ac-VC*WEDSWGGEVC*FRYDPGGGK(Adoa-Adoa)-NH2而言，10mmol规模的合成得到
28g(理论值的107％)粗肽。超过理论得率最有可能是源于潮湿和残余的溶剂。
88∶5∶5∶2，体积/体积/重量/体积)(10mL/g树脂)处理树脂4小时。真空蒸发挥
发物之后，用乙醚研磨膏状物，得到固体，通过过滤收集，再用乙醚洗涤，干燥。10mmol规模的(12)Ac-AGPTWC*EDDWYYC*WLFGTGGGK[K(ivDde)]-NH2合成得到30g(理论值的103％)粗肽。就(13)Ac-VC*WEDSWGGEVC*FRYDPGGGK(Adoa-Adoa)-NH2而言，10mmol规模的合成得到
28g(理论值的107％)粗肽。超过理论得率最有可能是源于潮湿和残余的溶剂。
[0144] 线性二半胱氨酸肽环化为环状二硫化物肽
[0145] 通过DMSO辅助的氧化，使用DMSO/水(95/5，体积/体积)，由相应的线性二半胱氨酸肽制备环状二硫化物肽。将粗线性肽溶解在广口烧杯中的溶剂混合物(5mL/g)中，通过分批加入固体N-甲基-D-葡糖胺将溶液的pH调节至8.5。所得的混合物于室温搅拌36小时。然后，用乙腈(50mL/g)稀释该溶液，混合物搅拌2分钟。固体环状二硫化物肽通过过滤收集，用乙醚洗涤，并干燥。
[0146] 单体肽的纯化
[0147] 肽单体(12)Ac-AGPTWC*EDDWYYC*WLFGTGGGK[K(ivDde)]-NH2；Ac-Ala-Gly-Pro-Thr-Trp-Cys-Glu-Asp-Asp-Trp-Tyr-Tyr-Cys-Trp-Leu-Phe-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys[Lys(ivDde)]-NH2环(6-13)二硫化物
[0148] 将约0.5g部分的粗环状二硫化物肽单体(12)溶解在最 少量DMSO(约3mL)中。用20％CH3CN-水将溶液体积调整至约100mL，使用第三个泵将溶液加到反相C18制备型柱(Waters， Prep MS C18，10μ， 50×250mm，流速100mL/分钟)上，该柱已
用10％CH3CN的水溶液(0.1％TFA)预平衡。在样品溶液上样的过程中，停止制备型HPLC系统中的平衡洗脱液流动。在样品溶液上柱后，再启动梯度HPLC系统中的平衡洗脱液流动，用10％CH3CN-水(0.1％TFA)洗脱该柱，直至洗脱出DMSO。然后，在1分钟内将洗脱液的组成阶次升至35％CH3CN-水(0.1％TFA)，此后，启动0.5％/分钟速率的CH3CN(0.1％TFA)至水(0.1％TFA)的线性梯度，并保持50分钟。使用220nm的UV作为产物洗脱的指示器手动收集流分(15mL)。所收集的流分在Waters XTerra分析型反相C-18柱(5μ颗粒，孔径 上进行分析，合并纯度＞95％的含产物流分后冻干，得到相应的环状二硫化物肽单体(12)。通常，0.5g粗肽单体(12)的纯化得到0.1g(得率20％)所需产物(纯度＞
95％)。
用10％CH3CN的水溶液(0.1％TFA)预平衡。在样品溶液上样的过程中，停止制备型HPLC系统中的平衡洗脱液流动。在样品溶液上柱后，再启动梯度HPLC系统中的平衡洗脱液流动，用10％CH3CN-水(0.1％TFA)洗脱该柱，直至洗脱出DMSO。然后，在1分钟内将洗脱液的组成阶次升至35％CH3CN-水(0.1％TFA)，此后，启动0.5％/分钟速率的CH3CN(0.1％TFA)至水(0.1％TFA)的线性梯度，并保持50分钟。使用220nm的UV作为产物洗脱的指示器手动收集流分(15mL)。所收集的流分在Waters XTerra分析型反相C-18柱(5μ颗粒，孔径 上进行分析，合并纯度＞95％的含产物流分后冻干，得到相应的环状二硫化物肽单体(12)。通常，0.5g粗肽单体(12)的纯化得到0.1g(得率20％)所需产物(纯度＞
95％)。
[0149] 肽单体(13)Ac-VC*WEDSWGGEVC*FRYDPGGGK(Adoa-Adoa)-NH2；Ac-Val-Cys-Trp-Glu-Asp-Ser-Trp-Gly-Gly-Glu-Val-Cys-Phe-Arg-Tyr-Asp-Pro-Gly-Gly-Gly-Lys(Adoa-Adoa)-NH2环(2-12)二硫化物
[0150] 按照用于肽单体(2)的HPLC纯化的方法，将溶解在20％CH3CN-水混合物(100mL)中的粗环状二硫化物肽单体(13)Ac-VC*WEDSWGGEVC*FRYDPGGGK(Adoa-Adoa)-NH2(0.5g)加到反相C18制备型柱(Waters， MS C18，50×250mm，10μ颗粒，孔径流速100mL/分钟)上，该柱已用10％CH3CN(0.1％TFA)的水(0.1％TFA)溶液预平衡。在样品溶液上柱的过程中，停止制备型HPLC系统中的平衡洗脱液流动。在样品溶液上柱后，再启动梯度HPLC系统中的平衡洗脱液流动，用10％CH3CN-水(0.1％TFA)洗脱该柱5分钟。然后，在1分钟内将洗脱液的组成阶次升至30％CH3CN(0.1％TFA)-水(0.1％TFA)，启动0.5％/分钟速率的CH3CN (0.1％TFA)至水(0.1％TFA)的线性梯度洗脱，并保持50分钟。使用220nm的UV作为产物洗脱的指示器手动收集流分(15mL)。所述流分在Waters XTerra分析型反相C-18柱(4.6mm内径×50mm，5μ颗粒，孔径 上进行分析，合并纯度＞95％的含产物流分后冻干，得到相应的环状二硫化物肽单体(13)。通常，0.5g粗肽单体(3)的纯化得到0.12g(得率24％)所需产物(纯度＞95％)。
[0151] 实施例4
[0152] 前体二聚体肽(16)Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK[Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK(-Adoa-Adoa-Glut-K)[-NH2环(2-12)二硫化物]-NH2环(6-13)二硫化物；Ac-Ala-Gly-Pro-Thr-Trp-Cys-Glu-Asp-Asp-Trp-Tyr-Tyr-Cys-Trp-Leu-Phe-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys[Ac-Val-Cys-Trp-Glu-Asp-Ser-Trp-Gly-Gly-Glu-Val-Cys-Phe-Arg-Tyr-Asp-Pro-Gly-Gly-Gly-Lys(-Adoa-Adoa-Glut-Lys)]-NH2环(2-12)二硫化物]-NH2环(6-13)二硫化物的制备和纯化
[0153] 如图3所示，将戊二酸二琥珀酰亚胺酯(DSG，0.28g，0.86mmol)溶解在搅拌的无水二甲基甲酰胺(2.0mL)中，一次性加入二异丙基乙胺(0.11g，0.85mmol)。然后，在2分钟的时间段内将固体肽单体(12)Ac-AGPTWC*EDDWYYC*WLFGTGGGK-[K(ivDde)]-NH2(0.50g，0.17mmol)分批加入搅拌的DSG溶液中。在室温搅拌30分钟后，用无水乙酸乙酯将该溶液稀释至约50mL，(其用于沉淀中间体单NHS酯(14))。离心整个混合物，倾析上清液，留下为无色固体的中间体单NHS酯(14)。用乙酸乙酯重悬浮固体；离心含有悬浮的固体单NHS酯(14)的溶液，以分离固体，再倾析上清液。重复此清洗方法2次，以完全除去过量的DSG。
[0154] 将固体单NHS酯(14)溶解在搅拌的无水二甲基甲酰胺(2.0mL)中，加入二异丙基乙胺(0.11g，0.85mmol)。然后，在3分钟时间段内，向搅拌的溶液中分批加入固体肽单体(13)Ac-VC*WEDSWGGEVC*FRYDPGGGK(Adoa-Adoa)-NH2(0.50g，0.19 mmol，1.12当量)，对所得混合物搅拌18小时。通过质谱监测反应；在证实完全消耗了肽单体戊二酸单酰胺单NHS酯(14)之后，加入纯净肼(0.1mL)，以脱去具有ivDde的二聚体(15)的ivDde保护基，并于室温搅拌混合物20分钟。
[0155] 然后，通过滴加TFA酸化溶液，并用10％CH3CN(0.1％TFA)的水(0.1％TFA)溶液稀释混合物至100mL。过滤溶液，以除去颗粒，将一半的澄清溶液加到反相C18制备型柱(Waters， MS C18，10μ，50×250mm，流速100mL/分钟)上，该柱已用10％CH3CN的水(0.1％TFA)溶液预平衡。在样品溶液上柱的过程中，停止制备型HPLC系统中的平衡洗脱液流动。在样品溶液上柱后，再启动梯度HPLC系统中的平衡洗脱液流动，用10％CH3CN-水(0.1％TFA)洗脱该柱，以便将DMF从柱中冲出来。在完成DMF塞流洗脱后，在1分钟内将洗脱液组成增加至20％CH3CN，用0.6％/分钟速率的CH3CN(0.1％TFA)至水(0.1％TFA)的线性梯度继续洗脱。使用220nm的UV作为产物洗脱的指示器收集流分(15mL)。流分在反相C18柱(Waters MS C18，4.6mm内径×50mm，5μ颗粒，孔径 上进行分析，合并纯度＞95％的含产物流分后冻干，得到为无色蓬松固体的前体二聚体肽(16)。以相同方式纯化剩余的粗前体二聚体肽(16)。由0.5g的每种单体肽(12)和(13)获得320mg(总得率33％)的所需二聚体(16)(纯度＞95％)。
[0156] 实施例5
[0157] 结合KDR的二聚体肽磷脂缀合物(11)乙酰-L-丙氨酰-甘氨酰-L-脯氨酰-L-苏氨酰-L-色氨酰-L-半胱氨酰-L-谷氨酰-L-天冬氨酰-L-天冬氨酰-L-色氨酰-L-酪氨酰-L-酪氨酰-L-半胱氨酰-L-色氨酰-1-亮氨酰-L-苯丙氨酰-甘氨酰-L-苏氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-L-赖氨酰[乙酰-L-缬氨酰-L-半胱氨酰-L-色氨酰-L-谷氨
酰-L-天冬氨酰-L-丝氨酰-L-色氨酰-甘氨酰-甘氨酰-L-谷氨酰-L-缬氨酰-L-半胱
氨酰-L-苯丙氨酰-L-精 氨酰-L-酪氨酰-L-天冬氨酰-L-脯氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-L-赖氨酰(二硬脂酰磷酸乙醇胺羰基氧基-PEG2000-氨基-8-氨基-3，6-二氧杂辛酰基-8-氨基-3，6-二氧杂辛酰基-戊二酰-L-赖氨酰)酰胺环(2-12)二硫化物]-酰
胺环(6-13)二硫化物；Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK{Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDP-GGGK[-Adoa-Adoa-Glut-K(DSPE-PEG2000-NH-Glut)]-NH2环(2-12)二硫化物}-NH2环(6-13)二硫化物；Ac-Ala-Gly-Pro-Thr-Trp-Cys-Glu-Asp-Asp-Trp-Tyr-Tyr-Cys-Trp-Leu-Phe-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys{Ac-Val-Cys-Trp-Glu-Asp-Ser-Trp-Gly-Gly-Glu-Val-Cys-Phe-Arg-Tyr-Asp-Pro-Gly-Gly-Gly-Lys[-Adoa-Adoa-Glut-Lys(DSPE-PEG2000-NH-Glut)-]-NH2 环(2-12)二硫化物}-NH2环(6-13)二硫化物的制备
酰-L-天冬氨酰-L-丝氨酰-L-色氨酰-甘氨酰-甘氨酰-L-谷氨酰-L-缬氨酰-L-半胱
氨酰-L-苯丙氨酰-L-精 氨酰-L-酪氨酰-L-天冬氨酰-L-脯氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-L-赖氨酰(二硬脂酰磷酸乙醇胺羰基氧基-PEG2000-氨基-8-氨基-3，6-二氧杂辛酰基-8-氨基-3，6-二氧杂辛酰基-戊二酰-L-赖氨酰)酰胺环(2-12)二硫化物]-酰
胺环(6-13)二硫化物；Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK{Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDP-GGGK[-Adoa-Adoa-Glut-K(DSPE-PEG2000-NH-Glut)]-NH2环(2-12)二硫化物}-NH2环(6-13)二硫化物；Ac-Ala-Gly-Pro-Thr-Trp-Cys-Glu-Asp-Asp-Trp-Tyr-Tyr-Cys-Trp-Leu-Phe-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys{Ac-Val-Cys-Trp-Glu-Asp-Ser-Trp-Gly-Gly-Glu-Val-Cys-Phe-Arg-Tyr-Asp-Pro-Gly-Gly-Gly-Lys[-Adoa-Adoa-Glut-Lys(DSPE-PEG2000-NH-Glut)-]-NH2 环(2-12)二硫化物}-NH2环(6-13)二硫化物的制备
[0158] 如图4所示，可通过将前体二聚体肽(16)Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK[Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK(-Adoa-Adoa-Glut-K)[-NH2环(2-12)二硫化物]-NH2环(6-13)二硫化物和DSPE-PEG2000-NH2磷脂铵盐(18)缀合来制备结合KDR的二聚体(11)。
[0159] 在3分钟的时间段内，边搅拌边向戊二酸二琥珀酰亚胺酯(DSG，0.15g，0.46mmol)和二异丙基乙胺(0.06g，0.47mmol)的无水DMF(3.0mL)溶液中分批加入固体前体二聚体肽(16)(0.5g，0.092mmol)。然后，于室温搅拌该溶液30分钟。用无水乙酸乙酯稀释反应混合物至约50mL；这导致前体二聚体肽(16)的戊二酸单酰胺单NHS酯-二聚体戊二酸单酰胺单NHS酯(17)沉淀。离心该溶液，得到为无色固体的沉淀6(m/z，负离子，1887.3(M-3H)/3，1415.1(M-4H)/4，1131.9(M-5H)/5)。含有过量DSG的上清液乙酸乙酯层从压紧的固体二聚体戊二酸单酰胺单NHS酯(17)倾析出去，该固体再重悬浮在乙酸乙酯中，离心，再多洗涤2次，以除去余下的痕量DSG。将由此获得的固体中间体戊二酸单酰胺单NHS酯二聚体衍生物(17)溶解在无水DMF/CH2Cl2(8∶2，体积/体积)(3.0mL)中；加入二异丙基乙胺(0.06g，
0.47mmol)，并搅拌溶液。
0.47mmol)，并搅拌溶液。
[0160] 此时，将DSPE-PEG2000-NH2磷脂铵盐(18)(0.235g，0.084mmol，0.9当量)悬浮在单独烧瓶的无水二氯甲烷(2mL)中，加入TFA(2滴)，以使磷酸二酯氧质子化，促进磷脂铵盐(18)在二氯甲烷中的溶解。浓缩澄清溶液以除去挥发物，进一步真空干燥。
[0161] 将固体磷脂铵盐(18)溶解在DMF(2mL)中，并转移至戊二酸单酰胺单NHS酯二聚体衍生物(17)的搅拌溶液中，将所得混合物于室温搅拌24小时。用50％CH3OH、25％CH3CN和25％水(1∶1)的溶液稀释反应混合物至约100mL，过滤不溶物。将一半滤过溶液加到反相C4制备型柱 C4，10μ， 50×250mm)上，该柱已用CH3OH和CH3CN(1∶1，0.1％TFA)和水(0.1％TFA)的1∶1混合物以100mL/分钟流速预平衡。在样品溶液上柱的过程中，停止制备型HPLC系统中的平衡洗脱液流动。在样品溶液上样后，再启动平衡洗脱液的流动，洗涤该柱，直至洗脱出DMF塞流。
[0162] 然后在1分钟内将洗脱液的组成阶次升至70％CH3OH-CH3CN(1∶1，0.1％TFA)-水(0.1％TFA)，启动0.75％/分钟CH3OH-CH3CN(1∶1，0.1％TFA)至水(0.1％TFA)的线性梯度。在达到100％B后继续洗脱，以便实现从柱中完整洗脱下产物。使用UV(220nm)作为产物洗脱指示器收集流分(15ml)，在洗脱出主要产物后，继续收集流分达几分钟，以便确保痕量的原料磷脂铵盐(18)的洗脱。使用220nm的UV和蒸发光散射检测器(ELSD)，在分析型HPLC系统(柱：YMC C4，5μM， 4.6×250mm)上检查流分的纯度。使用后一检测器检测DSPE-PEG2000-NH2，其于220nm具有弱发色团。合并纯度＞98％且没有DSPE-PEG2000-NH2磷脂铵盐(8)的含产物流分，并浓缩，以减少CH3OH含量。然后，用10％CH3CN的水溶液稀释该溶液，直至形成微弱的絮状沉淀。冻干所得溶液，得到为无色固体的二聚体肽磷脂缀合物(11)。如上所述纯化第二部分的粗二聚体肽磷脂缀合物(11)。目标二聚体肽磷脂缀合物(11)的合并产量为0.39g(得率57％)。将由不同样品纯化轮次制备的二聚体肽磷脂缀合 物(11)样品合并在一起，溶解在叔丁醇-乙腈-水混合物中再次冻干，得到为无色蓬松固体的二聚体肽磷脂缀合物(11)，进一步真空干燥。
[0163] 下面的实施例6-8涉及示于图5的二聚体肽-磷脂缀合物的制备，其中二聚体缀合物含有非常低水平的TFA。图6-8图解了以下实施例中描述的方法。
[0164] 实施例6
[0165] 经使用戊二酰接头制备具有低TFA水平的二聚体缀合物
[0166] 通过AG MP-50离子交换树脂将(22)、(25)和二聚体肽27·nTFA盐转变为乙酸盐制备(23)、(26)和二聚体肽(27)乙酸盐
[0167] 对于化合物(23)，将AG MP-50离子交换树脂(1.5meq/mL树脂床)悬浮在20％CH3CN/H2O中。将悬浮液装入3×30cm玻璃柱中，最终体积为150mL。将该柱连接至泵和电导表，以17mL/分钟的流速用20％CH3CN/H2O洗涤，直至电导率低于1μs/cm。将化合物(22)(210mg)溶解在20％CH3CN/H2O(80mL)中，将所得溶液上柱。该柱再用同样的洗脱液洗涤，直至其电导率低于1μs/cm。以200mM、400mM、600mM和800mM各250mL施加NH4OAc在20％CH3CN/H2O中的梯度。化合物出现在600mM NH4OAc中。通过HPLC分析各流分，合并含有所述化合物的流分后冻干几次，直至物质重量恒定。获得176mg为白色蓬松固体的纯物质(23)。得率为83.8％。
[0168] 其它的参数和结果如下：HPLC：保留时间：5.6分钟；测定＞98％(面积％)；柱子：Waters XTerra MS-C18，4.6×50mm，5μ颗粒，孔径 洗脱液：A：H2O(0.1％TFA)，B：CH3CN(0.1％TFA)；洗脱：初始条件：15％B，在8分钟内线性梯度15-50％B；流速：3mL/分钟；检测：220nm的UV；质谱：API-ES；模式：负离子；1441.7[M-2H]/2，960.9[M-3H]/3；CE分析(抗衡离子％重量/重量)：TFA估计为0.3％；乙酸盐1.1％。
[0169] 对于化合物(26)，按照用于化合物(23)的相同方法，将300mg肽TFA盐(25)在80mL水中的溶液以17mL/分钟加到150mL AG MP-50柱上，用H2O洗该柱子至电导率为1μs/cm。然后，在上样后再用H2O洗该柱，施加与化合物(23)的离子交换所用一样的NH4OAc水溶液至H2O的相同阶梯梯度。冻干合并流分至恒重，得到200mg为白色蓬松固体的乙酸盐(26)。得率为66.7％。
[0170] 其它的参数和结果如下：HPLC：保留时间：5.6分钟；测定97.0％(面积％)；柱子：Waters XTerra MS-C18，4.6×50mm，5μ颗粒，孔径 洗脱液：A：H2O(0.1％TFA)，B：CH3CN(0.1％TFA)；洗脱：初始条件：15％B，在8分钟内线性梯度15-50％B；流速：3mL/分钟；检测：220nm的UV；质谱：API-ES；模式：负离子；1336.9[M-2H]/2，890.8[M-3H]/3；CE分析(抗衡离子％重量/重量)：TFA估计为0.4％；乙酸盐4.2％；IC分析(F％)：0.26。
[0171] 对于二聚体肽(27)乙酸盐，和用于化合物(23)的方法类似，用30％CH3CN/H2O洗涤AG MP-50柱(100mL湿体积)，直至电导率低于1μs/cm。将化合物(27)的TFA盐(120mg，在80mL的30％CH3CN/H2O中)加到该柱上，用同样的洗脱液洗涤该柱，直至电导率稳定在1μs/cm。和对化合物(23)一样实施NH4OAc30％CH3CN/H2O至30％CH3CN/H2O的阶梯梯度，以约600mM NH4OAc洗脱化合物。冻干合并的流分，然后再冻干几次，直至物质呈现恒重，得到104mg为乙酸盐的纯物质(27)。得率为86.7％。
[0172] 其它的参数和结果如下：HPLC：保留时间：5.2分钟；测定＞99％(面积％)；柱子：Waters XTerra MS-C18，4.6×50mm，5μ颗粒，孔径 洗脱液：A：H2O(0.1％TFA)，B：CH3CN(0.1％TFA)；洗脱：初始条件：20％B，在8分钟内20-60％B的线性梯度；流速：3mL/分钟；检测：220nm的UV；质谱：API-ES；模式：负离子；1816.3[M-3H]/3，
1362.0[M-4H]/4，1089.2[M-5H]/5； CE分析(抗衡离子％重量/重量)：TFA估计为0.2％；
乙酸盐0.15％。
1362.0[M-4H]/4，1089.2[M-5H]/5； CE分析(抗衡离子％重量/重量)：TFA估计为0.2％；
乙酸盐0.15％。
[0173] 由化合物(23)和化合物(26)制备和纯化二聚体肽(27)乙酸盐
[0174] 向戊二酸二琥珀酰亚胺酯(18mg，0.055mmol)的无水DMF(0.1mL)溶液中加入化合物(23)(0.1mg，0.021mmol)在0.2mL无水DMF液滴(pH8，用DIEA中和)中的溶液。于室温搅拌澄清溶液0.5小时。HPLC和MS显示反应完成。真空除去溶剂，加入EtOAc(8mL)，以沉淀中间体(24)。离心混合物，倾析，以除去过量戊二酸酯。再重复此EtOAc洗涤多3次，所得的固体使用干燥的氮气流干燥，然后将其溶解在0.3mL无水DMF中。加入化合物(26)(56mg，0.021mmol)，通过加入DIEA将溶液的pH调节至8。于室温搅拌溶液16小时，此后通过HPLC和MS分析判断反应完成情况。加入30μL等份的NH2NH2，搅拌混合物5分钟，以切下ivDde基团。反应混合物通过HPLC和MS分析，这表明脱去了所有的ivDde基团。
[0175] 在纯化二聚体肽(27)乙酸盐之前，要注意小心地用无TFA的洗脱液、CH3CN/H2O/10mM NH4OAc洗涤整个制备型HPLC系统，包括柱子。然后，将粗反应混合物加到反相C-18制备型柱(Atlantis C-18，5μm颗粒，孔径 30×150mm，流速30mL/分钟)上，用15％B(A：10mM NH4OAc在H2O中的溶液；B：10mMNH4OAc在CH3CN/H2O中的溶液，9/1，体积/体积)预平衡。用同样的洗脱液洗柱子，直至洗脱出DMF塞流。在2分钟内将洗脱液组成增加至25％B，然后在40分钟内阶次升至65％B。流分在分析型反向C-18柱(Waters MS C-18，4.6×50mm，5μm颗粒，孔径 流速3mL/分钟)上进行分析，合并纯度＞95％的含产物流分后冻干，得到25mg为其乙酸盐的二聚体肽(27)，为白色蓬松固体。得率为21.8％。
[0176] 其它的参数和结果如下：HPLC：保留时间：5.2分钟；测定＞99％(面积％)；柱子：Waters XTerra MS-C18，4.6×50mm， 5μ颗粒，孔径 洗脱液：A：H2O(0.1％TFA)，B：CH3CN(0.1％TFA)；洗脱：初始条件：20％B，在8分钟内20-60％B的线性梯度；流速：3mL/分钟；检测：220nm的UV；质谱：API-ES；模式：负离子；[M-3H]/3，1362.0[M-4HJ/4，
1089.2[M-5H]/5；CE分析(抗衡离子％重量/重量)：TFA估计低于0.2％；乙酸盐1.1％。
1089.2[M-5H]/5；CE分析(抗衡离子％重量/重量)：TFA估计低于0.2％；乙酸盐1.1％。
[0177] 实施例7-图7
[0178] 经离子交换树脂制备具有低TFA水平的二聚体肽-磷脂缀合物
[0179] 由二聚体肽(27)乙酸盐制备和纯化为其乙酸盐的磷脂肽缀合物(21)
[0180] 向戊二酸二琥珀酰亚胺酯-DSG(3.7mg，11.3μmol)的无水DMF(0.1mL)溶液中滴加已中和的二聚体肽(27)乙酸盐(15mg，2.75μmol)的无水DMF(0.2mL)溶液。反应溶液于室温搅拌0.5小时。采用Waters XTerra C-18柱的HPLC分析和MS表明反应完成。蒸发溶剂，加入EtOAc(8mL)，以沉淀中间体(28)。离心装有沉淀的中间体(28)的容器，倾析液体层。重复该方法3次，以除去过量的DSG。固体用干燥的氮气流干燥，然后溶解在0.3mL无水DMF中。加入固体形式的DSPE-PEG2000-NH2铵盐(29)(6.5mg，2.33μmol)，将混合物的pH调节至(28)。反应混合物于室温搅拌16小时。通过MS和采用Zorbax300SB-C3柱的HPLC分析混合物，表明反应完成。
[0181] 为使TFA对产物的潜在污染最小化，通过配备使用新的Zorbax300SB-C3柱(21.2×150mm，5μ颗粒)的制备型HPLC纯化粗反应混合物，该柱从未接触过TFA。利用CH3CN/H2O/NH4OAC彻底地预清洗HPLC系统，以除去痕量TFA。将反应混合物加到该柱上，该柱用20％B(A：10mM NH4OAc在H2O中的溶液；B：10mMNH4OAc在CH3CN/H2O中的溶液，9/1体积/体积)以30mL/分钟的流速预平衡。该柱用同样的洗脱液以30mL/分钟洗脱，直至洗脱出DMF塞流。然后，在3分钟内将洗脱液组成增加至40％B，然后在 50分钟内阶次升至90％B。所收集的流分在分析型反相C-3柱(Zorbax300SB-C3，3×150mm，3.5μm颗粒，孔径流速：0.5mL/分钟)上进行分析，其中检测使用220nm的UV和蒸发光散射检测器
(ELSD)完成。合并含有纯产物的流分后冻干。获得6.5mg部分的终产物(21)乙酸盐。得率为33.0％。
(ELSD)完成。合并含有纯产物的流分后冻干。获得6.5mg部分的终产物(21)乙酸盐。得率为33.0％。
[0182] 其它的参数和结果如下：HPLC：保留时间：13.3分钟；测定＞99％(面积％)；柱子：Zorbax300SB-C3，3×150mm，3.5μm，孔径 洗脱液：A：H2O(0.1％TFA)，B：CH3CN/MeOH(0.1％TFA)；洗脱：初始条件：60％B，3分钟内60-90％B的线性梯度；流速：0.5mL/分钟；检测：220nm的UV和ELSD；CE分析(抗衡离子％重量/重量)：％重量TFA：0.3％；％重量乙酸盐0.4％。
[0183] 实施例8-图8
[0184] 使用Zorbax C-3RP制备型HPLC和Sephadex G-25凝胶渗透层析经序贯纯化制备具有低TFA水平的二聚体缀合物
[0185] 使用的材料和用于分析型HPLC系统的条件包括：柱子：Zorbax300SB C-3；3mm内径×150mm；3.5μm颗粒；洗脱液A：H2O(HPLC级，以体积计含有0.1％TFA)；洗脱液B：CH3CN(以体积计0.1％TFA)。洗脱：初始条件：50％B，然后在3分钟内50-90％B的线性梯度，于90％B保持11分钟；流速0.5mL/分钟；检测：220nm的UV。保留时间：(化合物(21))：6.77分钟，保留时间(溶解型的)：4.06分钟。
[0186] 使用制备型Zorbax C-3柱的制备型HPLC从(21)中除去溶解型化合物
[0187] 以30％洗脱液B的浓度加载粗化合物。使用的材料和条件包括：条件：柱子：Waters Zorbax300SB C-3；21.2mm内径×150mm；3.5μm颗粒；洗脱液：洗脱液A：H2O(HPLC级，含10mM NH4OAc)；洗脱液B：CH3CN/H2O，9/1(最终NH4OAc浓度：10 mM)。
[0188] 然后在2分钟内改变洗脱液的组成至45％B，然后在40分钟内用45-100％B的线性梯度洗脱该柱；流速：30mL/分钟；检测：于220nm的UV。
[0189] 将粗化合物(100mg)溶解在25mL30％B溶液中。制备型HPLC系统以30％B平衡。将化合物加到Zorbax C-3柱上。移动相组成在2分钟内阶次升至45％B。使用在40分钟内45-100％B的线性梯度洗脱(21)。洗脱的产物介于26.5-33分钟之间。
[0190] 合并含有(21)的流分后冻干，得到白色蓬松固体，将其溶解在水-乙腈中，然后再冻干。这得到70mg没有溶解型化合物的产物。回收率约为70％。在层析完成后，用95％B以30mL/分钟流速洗涤系统15分钟。然后，用CH3CN/H2O(50/50，没有TFA或缓冲剂)以15mL/分钟流速洗涤该柱30分钟。然后，将该柱储存于室温，以备后用。分析型HPLC证实在分离的物质中没有溶解型化合物。进一步分析证实，在室温5分钟后没有形成溶解型化合物。所述物质仍包含显著量(4.2重量％)的TFA。
[0191] 在Sephadex G-25上通过凝胶渗透层析从(21)中除去TFA
[0192] 用4L50mM碳酸氢铵平衡Sephadex G-25柱(100g树脂，珠子大小20-80μm，总凝胶体积约500mL，柱高：27cm)。然后，将(21)(70mg)溶解在30mL(终体积)的60mM碳酸氢铵的10％乙腈水溶液中。过滤溶液，然后加到Sephadex G-25柱上。该柱用50mM碳酸氢铵缓冲液洗脱，收集流分10mL。所收集的流分通过分析型HPLC(于220nm进行UV检测)进行监测。结果见下表4。
[0193] 表4流分# 体积(mL) 化合物存在情况(根据流分的HPLC分析)
1 10 无
3 10 无
6 10 无
9 10 无
12 10 无
15 10 无
18 10 无
19 10 无
20 10 有
21 10 有
24 10 有
27 10 有
28 10 有
29 10 无
1 10 无
3 10 无
6 10 无
9 10 无
12 10 无
15 10 无
18 10 无
19 10 无
20 10 有
21 10 有
24 10 有
27 10 有
28 10 有
29 10 无
[0194] 合并流分20-28后冻干。所得的冻干物质再溶解在少量水中，溶液冷冻后再冻干，以除去剩余量的碳酸氢铵。所需物质的最终重量为58mg。回收率为83％。
[0195] 为确定TFA被有效除去，对样品的TFA和乙酸根离子进行CE分析。按照前述测定，TFA明显存在于原材料(4.2％)中，但在凝胶渗透步骤后几乎检测不到(0.2％)。未检测到乙酸根离子。
[0196] 通过串联的Zorbax C-3制备型HPLC和Sephadex G-25凝胶渗透层析获得的(21)的分析数据
[0197] 用于收集分析数据的材料和条件包括：氟分析(通过QTI的IC)：751ppm(0.15％TFA重量/重量)；质谱：方法：MALDI-TOF；模式：正离子；检测的平均分子量为8461，观察到典型的PEG2000质量分布曲线。HPLC：系统A：柱子：Zorbax 300SB C-3；3mm内径×150mm；3.5μm颗粒；洗脱液A：水(HPLC级，以体积计含有0.1％TFA)；洗脱液B：乙腈(以体积计含0.1％TFA)。初始条件：50％B；洗脱：在3分钟内50-90％B的线性梯度，于90％B保持11分钟；流速：0.5mL/分钟；检测：于220nm的UV。保留时间：6.77分钟；面积％：99.6％。系统B：柱子：Zorbax300SB C-3；3mm内径×150mm；3.5μm颗粒；洗脱液A：水(HPLC级，以体积计含0.1％TFA)；洗脱液B：乙腈(以体积计含0.1％TFA)。初始条件：
50％B；洗脱：在3分钟内50-90％B的线性梯度，然后在12分钟内阶次升至100％B。流速：0.5mL/分钟；检测：LSD；保留时间：13.98分钟。面积％：99.3％。
50％B；洗脱：在3分钟内50-90％B的线性梯度，然后在12分钟内阶次升至100％B。流速：0.5mL/分钟；检测：LSD；保留时间：13.98分钟。面积％：99.3％。
[0198] 下表5提供了在实施例9-12中所用缩写词的定义以及所涉及材料的来源。
[0199] 表5
[0200]
[0201] *酸性形式，即硬脂酸，可以以本文的任一种微泡制剂使用。
[0202] 实施例9
[0203] 用DSPC/DPPG包囊制备靶向微泡
[0204] 实施例9A
[0205] 在60℃水浴中，将383mg DSPC/DPPG/和示于图5的二聚体肽磷脂缀合物(11)的混合物(摩尔比49.75/49.75/0.5，三种组分分别相当于187.1mg、176.4mg和19.8mg)和PEG-4000(22.6g)溶解在120g叔丁醇中。将溶液装入小瓶中，每瓶0.8ml溶液。样品在-45℃冷冻，再冻干。顶部空间的空气用C4F10/氮气(50/50)混合气体置换，小瓶加盖卷边。每瓶冻干的样品用5mL H2O重配。
[0206] 实施例9B
[0207] 重复实施例9A，只是使用DSPC/DPPG/和示于图10的单体肽磷脂缀合物(31)(摩尔比49.5/49.5/1，三种组分分别相当于182.8mg、172.3mg和28.2mg)的混合物。
[0208] 实施例10
[0209] 用DPPE/DPPG包囊制备靶向微泡
[0210] 实施例10A
[0211] 于60℃，用500μl蒸馏水制备DSPE-PEG1000(0.43mg-0.24μmol)和示于图10的单体肽磷脂缀合物(31)(3.0mg-0.5μmol)的水性混悬液，得到胶束混悬液。
[0212] 于70℃，单独地将DPPE(15.8mg-22.8μmol)和DPPG(4.2mg-5.7μmol)分散在10％甘露醇的蒸馏水(20mL)溶液中达20分钟。然后，将分散液冷却至室温。使用高速匀浆器(PolytronPT3000，轴直径3cm)，将全氟庚烷(1.6mL)在水相中以10500rpm乳化1分钟，得到乳状液。
[0213] 将胶束混悬液加入到乳状液中，边搅拌边将所得混合物于60℃加热1小时。在冷却至室温后(1小时)，将所得乳状液分为在50mL圆底烧瓶中的4mL部分。将乳状液于-45℃冷冻5分钟，以0.2mBar冻干24小时(冻干机Christ Beta1-8K)。
[0214] 在重分配前，使冻干物接触含C4F10/氮气(以体积计50/50)的气体。然后，轻轻用手摇动将冻干的产物分散在2倍初始体积的水中。
[0215] 实施例10B
[0216] 于60℃，用500μl蒸馏水制备DSPE-PEG1000(0.5mg-0.27μmol)和示于图5的二聚体肽磷脂缀合物(11)(5.3mg-0.63μmol)的水性混悬液，得到胶束混悬液。
[0217] 于70℃，单独地将DPPE(15.8mg-22.8μmol)和DPPG(4.2mg-5.7μmol)分散在10％PEG4000的蒸馏水(20mL)溶液中达20分钟。然后，将分散液冷却至室温。使用高速匀浆器(Polytron PT3000，轴直径3cm)，将全氟庚烷(1.6mL)在水相中以10000rpm乳化1分钟，得到乳状液。
[0218] 将胶束混悬液加入到乳状液中，边搅拌边将所得混合物于80℃加热1小时。在冷却至室温后(1小时)，通过离心(200g/10分钟，Sigma离心机3K10)将所得乳状液洗涤1次，以除去过量磷脂。回收分离的沉淀(含有乳化的溶剂微滴)，并用初始体积的10％PEG4000水溶液重悬浮。
[0219] 取所得乳状液加到DIN8R小瓶(1mL/小瓶)中。然后，冷却小瓶至-50℃(Christ Epsilon2-12DS冻干机)，并于-25℃和0.2mBar冻干12小时，最后的干燥步骤为30℃和0.1mBar达7小时。小瓶暴露于含有C4F10/氮气(以体积计35/65)的气体并密封。轻轻用手摇动将冻干产物再分散在2倍初始体积的水中。
[0220] 实施例11
[0221] 用DSPC/DSPA包囊制备靶向微泡
[0222] 实施例11A
[0223] 于60℃，用1mL蒸馏水制备DSPE-PEG1000(2.5mg -1.4μmol)和示于图5的二聚体肽缀合物(11)(7.0mg-0.84μmol)的水性混悬液，得到胶束混悬液。
[0224] 于80℃，单独地将DSPC(16.3mg-20.6μmol)和DSPA(3.7mg-5.15μmol)溶解在环辛烷(1.6mL)中。向该有机相中加入10％PEG4000的水溶液(20mL)，使用高速匀浆器(Polytron PT3000，轴直径3cm)以8000rpm乳化1分钟，得到乳状液。
[0225] 将胶束混悬液与乳状液混合，边搅拌边将所得混合物于80℃加热1小时。在冷却至室温后(1小时)，通过离心(1500g/10分钟，Sigma离心机3K10)将所得乳状液洗涤1次，以除去过量磷脂。回收分离的上清液(含有乳化的溶剂微滴)，并分两次重悬浮在初始体积的10％PEG4000水溶液中。
[0226] 取所得混悬液加到DIN8R小瓶(1mL/小瓶)中。然后，冷却小瓶至-50℃(Christ Epsilon2-12DS冻干机)，并于-25℃和0.2mBar冻干12小时，最后的干燥步骤为30℃和0.1mBar达7小时。小瓶暴露于含有C4F10/氮气(以体积计35/65)的气体并密封。轻轻用手摇动将冻干产物分散在2倍初始体积的水中。
[0227] 实施例11B
[0228] 重复实施例11A，只是使用0.7mg DSPE-PEG2000(0.26μmol)和示于图2的1.6mg单体肽-磷脂缀合物(1)(0.26μmol)来制备胶束混悬液。
[0229] 实施例11C
[0230] 于80℃，将DSPC(16.3mg-20.6μmol)、DSPA(3.7mg-5.15μmol)和示于图1的单体肽磷脂缀合物(1)(1.6mg-0.26μmol)溶解在环辛烷(1.6mL)中。使用高速匀浆器(Polytron PT3000，轴直径3cm)，将该有机相在10％PEG4000水相(20mL)中以8000rpm乳化1分钟，得到乳状液。
[0231] 边搅拌边将所得乳状液于80℃加热1小时。在冷却至室温后(1小时)，用20ml的10％PEG4000水溶液稀释所得乳状液。
[0232] 取乳状液加到DIN8R小瓶(1mL/小瓶)中。然后，冷却小瓶至-50℃(Christ Epsilon2-12DS冻干机)，并于-25℃和0.2mBar冻干12小时，最后的干燥步骤为30℃和0.1mBar达7小时。小瓶暴露于含有C4F10/氮气(以体积计35/65)的气体并密封。轻轻用手摇动将冻干产物分散在2倍初始体积的水中。
[0233] 实施例12
[0234] 用DSPC/硬脂酸盐包囊制备靶向微泡
[0235] 实施例12A
[0236] 于60℃，用660μL蒸馏水制备DSPE-PEG1000(2.5mg-0.9μmol)和示于图5的二聚体磷脂缀合物(11)(2.5mg-0.3μmol)的水性混悬液，得到胶束混悬液。
[0237] 于80℃，单独地将DSPC(18.2mg-23.1μmol)和硬脂酸盐(1.8mg-5.8μmol)溶解在环辛烷(1.6mL)中。向该有机相中加入10％PEG4000的水溶液(20mL)，使用高速匀浆器(Polytron T3000，轴直径3cm)以9000rpm乳化1分钟，得到乳状液。
[0238] 将胶束溶液与乳状液混合，边搅拌边将所得混合物于80℃加热1小时。在冷却至室温后(1小时)，通过离心(1500g/10分钟，Sigma离心机3K10)将所得乳状液洗涤1次，以除去过量磷脂。回收分离的上清液(含有乳化的溶剂微滴)，并分两次重悬浮在初始体积的10％PEG4000水溶液中。
[0239] 取所得混悬液加到DIN8R小瓶(1mL/小瓶)中。然后，冷却小瓶至-50℃(Christ Epsilon2-12DS冻干机)，并于-25℃和0.2mBar冻干12小时，最后的干燥步骤为30℃和0.1mBar达7小时。小瓶暴露于含有C4F10/氮气(以体积计35/65)的气体并密封。轻轻用手摇动将冻干产物分散在2倍初始体积的水中。
[0240] 实施例12B
[0241] 重复实施例12A，只是用相同相对摩尔量的示于图2的单体肽磷脂缀合物(1)替代示于图5的二聚体肽磷脂缀合物(11)。
[0242] 实施例12C
[0243] 重复实施例11C，只是用DSPC(18.2mg-23.1μmol)、硬脂酸钠(1.8mg-5.8μmol)和示于图5的二聚体肽磷脂缀合物(11)(2.2mg-0.26μmol)。用于乳化的搅拌速度固定在9000rpm。在冷却至室温后(1小时)，通过离心(1500g/10分钟，Sigma离心机3K10)将所得乳状液洗涤1次，以除去过量磷脂。回收分离的上清液(含有乳化的溶剂微滴)，并分两次重悬浮在初始体积的10％PEG4000水溶液中。
[0244] 实施例13
[0245] 对KDR转染细胞的静态结合测试
[0246] 质粒生产和纯化
[0247] 将全长KDR克隆到pcDNA6载体中，让质粒在感受态DH5α大肠杆菌中扩增。使用大肠杆菌JM109和来自Quiagen的试剂盒进行质粒扩增和纯化。
[0248] 在 盖玻片上转染293H细胞
[0249] 细胞在24孔板中的涂覆聚-D-赖氨酸的 环形盖玻片上生长。按照脂转染胺(lipofectamine)2000方案(Invitrogen，目录号11668-019)的推荐，使用
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1μgDNA(pc-DNA6-fKDR)/每盖玻片(1.3cm)以0.1mL进行转染。转染在无血清培养基中进行，在2小时后从细胞中去除转染试剂混合物，更换为常规含血清培养基。某些被覆细胞的盖玻片进行模拟转染(没有DNA)。第二天，通过免疫细胞化学评价KDR受体的表达，并进行结合测定。
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1μgDNA(pc-DNA6-fKDR)/每盖玻片(1.3cm)以0.1mL进行转染。转染在无血清培养基中进行，在2小时后从细胞中去除转染试剂混合物，更换为常规含血清培养基。某些被覆细胞的盖玻片进行模拟转染(没有DNA)。第二天，通过免疫细胞化学评价KDR受体的表达，并进行结合测定。
[0250] 气泡结合测定
[0251] 将转染的细胞与重悬浮在50％人血浆的PBS溶液中的KDR靶向微泡温育。为与转8
染细胞温育，使小塑料帽充满含有1.3×10 个气泡的混悬液，用倒置的 盖玻
片加盖，以便使转染细胞接触靶向微泡。室温下温育30分钟后，用镊子夹起盖玻片，用PBS漂洗3次，然后放在显微镜下检查，以评价靶向微泡的结合。
染细胞温育，使小塑料帽充满含有1.3×10 个气泡的混悬液，用倒置的 盖玻
片加盖，以便使转染细胞接触靶向微泡。室温下温育30分钟后，用镊子夹起盖玻片，用PBS漂洗3次，然后放在显微镜下检查，以评价靶向微泡的结合。
[0252] 测定微泡覆盖的表面百分率
[0253] 用数码相机DC300F(Leica)获得图像，使用软件QWin3.1版(Leica Microsystem AG，Basel，Switzerland)确定在成像区域中结合微泡覆盖的表面百分率。获取每个盖玻片的图片。对于实施例9和10中的每个制备物，都重复结合测定至少2次，由此获得所覆盖表面的平均值。在下表6和7中记录了按照以上的实施例9和10制备的微泡的结合活性。
[0254] 如这些表所示，同一种肽在(作为脂肽)纳入不同的磷脂制剂中时可显示出不同的结合活性，形成微泡的稳定包囊。含有本发明的KDR结合脂肽的微泡特异性结合表达KDR的细胞，同时它们不显著结合模拟转染的细胞。
[0255] 实施例14
[0256] 对rh VEGF-R2/Fc嵌合蛋白的动态结合测试
[0257] 涂覆Fc-VEGF-R2的盖玻片的制备
[0258] 按照以下方法用重组人VEGF-R2/Fc嵌合蛋白(R&DSystems)涂覆玻璃盖玻片(直径40mm，Bioptechs Inc.，Butler，PA，USA)。
[0259] 使用特定标记(Dako Pen)，在玻璃盖玻片上划分14×25mm尺寸的表面，将在PBS中为4μg/mL的400μLFc-VEGF-R2溶 液沉积在该表面上。于4℃过夜温育后，吸出溶液，更换为0.5mL1％重量/体积BSA的PBS-0.05％吐温(Tween)80溶液(pH7.4)，并于室温温育3小时。然后，用5ml PBS-0.05％吐温(Tween)80洗涤盖玻片3次。
[0260] 结合测定
[0261] 使用平行平板流动室(FCS2，Bioptech Inc.，Butler，PA，USA)进行靶向气泡的结合研究，所述室的室垫圈厚0.25mm，带有定制的用于上下室倒置的转接器。将涂覆的盖玻片作为流动室的平板插入。使用带有60mL注射器(Terumo)的可调节输注泵(Auto6
AS50输注泵，Baxter，Deerfield，IL，USA)通过流动室汲出微泡(5×10 个气泡/mL，在50％-1
人血浆的PBS溶液中)。将泵流速调节至1mL/分钟，得到需要的剪切流速约为114s 。在
10分钟后，停止流动，使用40倍物镜和连接至倒置Olympus IX50显微镜的CCD单色照相机
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(F-View II，Soft Imaging Systems，Germany)在盖玻片上的不同位置(约0.025mm 的面积上)随机获取图片。
AS50输注泵，Baxter，Deerfield，IL，USA)通过流动室汲出微泡(5×10 个气泡/mL，在50％-1
人血浆的PBS溶液中)。将泵流速调节至1mL/分钟，得到需要的剪切流速约为114s 。在
10分钟后，停止流动，使用40倍物镜和连接至倒置Olympus IX50显微镜的CCD单色照相机
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(F-View II，Soft Imaging Systems，Germany)在盖玻片上的不同位置(约0.025mm 的面积上)随机获取图片。
[0262] 测定每张图片上的微泡数目，对图片总数求平均值，然后将得出的值除以10(得出“斜率”，即每分钟的结合微泡的平均数)。
[0263] 对于实施例11和12的每种制备物，重复4次结合测定，由此获得斜率平均值。
[0264] 斜率代表目标基质上的气泡结合速率。例如，斜率值8表示在10分钟内平均有80个微泡结合在涂覆的盖玻片上。较高的斜率表示在流动条件下气泡结合靶标的能力更好。
[0265] 在下表8和9中，描述了按照以上实施例11和12制备的微泡的结合活性。
[0266] 由这些表可以推断，同一种肽在(作为肽-磷脂缀合物或脂肽)纳入不同的磷脂制剂中时可显示出不同的结合活性，形成微泡 的稳定包囊。
[0267] 表6实施例 KDR 模拟 KDR-模拟
9A 28.6％ 0.4％ 28.3％
9B 28.0％ 0.3％ 27.7％
9A 28.6％ 0.4％ 28.3％
9B 28.0％ 0.3％ 27.7％
[0268] 表7实施例 KDR 模拟 KDR-模拟
10A 23.6％ 0.2％ 23.5％
10B 28.0％ 0.0％ 28.0％
10A 23.6％ 0.2％ 23.5％
10B 28.0％ 0.0％ 28.0％
[0269] 表8实施例 斜率
11A 8.2
11B 8.1
11C 5.8
11A 8.2
11B 8.1
11C 5.8
[0270] 表9实施例 斜率
12A 9.0
12B 8.0
12C 7.8
12A 9.0
12B 8.0
12C 7.8
[0271] 实施例15
[0272] 靶向KDR的超声造影剂的体内评价
[0273] 使用已知的血管生成模型：兔VX2肿瘤模型，在体内评价含有本发明的KDR结合脂肽的超声造影剂结合表达KDR的组织的能力。
[0274] 使用已知的血管生成组织模型检查靶向KDR的超声微泡定位于血管生成组织并提供血管生成组织的图像的能力。将VX2兔癌症顺次移植入重2.5/3kg的新西兰兔(Charles River Laboratories， France)的背肌中。
[0275] 肿瘤匀浆物的制备
[0276] 用手术方法切取肿瘤，放入含有10％胎牛血清、抗生素、1.5mM Glutamax1的McCoy氏培养基中，切成小块，进行漂洗，以去除血液和碎片。然后，将肿瘤块(3-5cm3)放入装有5mL完全培养基的50ml Falcon管中。捣碎肿瘤组织(Polytron)，直至不再观察到固体块。以300g离心浑浊液体5分钟，弃去上清液。每5mL沉淀加入7mL新鲜培养基。
[0277] 肿瘤移植
[0278] 兔子首先接受0.3mL Vetranquil(Acepromazine，Sanofi，肌内注射)，然后用肌内注射 噻拉嗪(Veterinaria AG/Sigma)混合物(50/10mg/mL，0.7mL/kg)麻醉。肌内注射100μl的VX2肿瘤匀浆物。在移植VX2肿瘤后15天，再用相同混合物麻醉动物，外加皮下注射50％乌拉坦(2mL/kg，皮下)(Sigma)，供成像试验用。
[0279] 体内超声成像
[0280] VX2肿瘤成像使用配有L7-4线阵探头的超声成像系统ATL HDI5000装置进行。以高声功率(MI＝0.9)使用B-模式脉冲倒置评价在新血管内皮上表达的KDR受体上的靶向微泡累积。线阵探头固定在直接覆盖移植肿瘤的皮肤上。
[0281] 在使用实施例16或实施例17的制备物进行气泡注射(0.1μL/kg气体)后，停止声波作用，以允许气泡累积25分钟。然后，再以高声功率(MI0.9)启动声波作用，破坏肿瘤中存在的所有气泡。然后，通过记录无声波作用下的20秒累积后获得的信号，评测游离的循环气泡的量。VX2肿瘤成像试验的视频帧用video-capture 捕获，并用Image-Pro Plus2.0软件分析。代表游离循环气泡的图像由在25分钟时获得的图像中扣除，得到代表结合气泡的图像。
[0282] 参考图11(其显示了采用实施例16的制备物的结果)和图12(其显示了采用实施例17的制备物的结果)，图11A和12A显示了气泡注射前的图像(基线)，图11B和12B显示了注射后25分钟肿瘤中的气泡造影滞留；图11C和12C显示了在扣除基线和游离循环气泡后获得的结果，代表本发明的含有KDR脂肽的结合微泡。实施例15-17以及图11和12证实，具有此KDR结合部分的超声造影剂在动物模型中定位于表达KDR(并因此导致血管生成)的组织。
[0283] 实施例16
[0284] 重复实施例12A，只是用DSPE-PEG1000(2.7mg，1.54μmol)替换DSPE-PEG2000，并使用2.5mg(0.31μmol)示于图5的二聚体肽磷脂缀合物(11)。
[0285] 实施例17
[0286] 重复实施例16，只是用相同摩尔量的示于图2的单体磷脂缀合物(1)替换二聚体肽磷脂缀合物。