培养基及其应用

摘要

本发明公开了培养基及其应用。其中，该培养基为添加有N2 supplement、维甲酸和BMP-4的DMEM/F12培养基。利用本发明的培养基能够有效地将干细胞诱导为上皮样细胞，进而，将获得的上皮样细胞与动物牙胚的间充质重组、培养及移植后，能够有效地获得牙样结构中的成釉细胞。

权利要求

1.一种用于制备成釉细胞的试剂盒，其特征在于，包括：第一培养基，所述第一培养基含有1重量％的N2supplemen、1μM维甲酸、25ng/mlBMP-4；和第二培养基，所述第二培养基为添加有FBS、谷氨酰胺、非必需氨基酸和青链霉素的高糖DMEM培养基,其中，所述第一培养基和所述第二培养基设置在不同的容器中。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，进一步包括：TM

第三培养基，所述第三培养基为选自mTeSR1 、E8培养基和KSR条件培养基中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第二培养基含有：10重量％的FBS、2mM谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素。

4.一种制备成釉细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：利用权利要求1所述的第一培养基培养干细胞，以便使所述干细胞分化为上皮样细胞，其中，

所述干细胞为选自胚胎干细胞和诱导多能干细胞中的至少之一，其中，所述胚胎干细胞为非人胚胎干细胞；

将所述上皮样细胞与第一动物牙胚的间充质进行重组，并对所得到的重组产物进行培养，以便得到重组组织，其中，利用添加有FBS、谷氨酰胺、非必需氨基酸和青链霉素的高糖DMEM培养基对所述重组产物进行气液面培养，以便得到重组组织；

将所述重组组织在第二动物体内培养预定时间，以便获得成釉细胞，其中，所述预定时间为2-4周。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述诱导多能干细胞衍生自选自皮肤成纤维细胞、牙周膜干细胞和尿液细胞中的至少一种。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述干细胞为衍生自尿液细胞的非整合型诱导多能干细胞。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，利用权利要求1所述的第一培养基培养干细胞5-10天。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，利用权利要求1所述的第一培养基培养干细胞7天。

9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第一动物为胎鼠，所述第二动物为裸鼠。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述第一动物牙胚的间充质是从小鼠磨牙牙胚中通过机械法分离的，其中，

在进行机械法分离之前，利用蛋白酶对所述牙胚进行消化。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶为0.75mg/ml的Dispase。

12.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，将所述重组组织在裸鼠的肾包膜与皮质之间进行所述培养。

13.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述预定时间为3周。

14.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在制备上皮样细胞之前，利用选自TMmTeSR1 、E8培养基和KSR条件培养基中的至少一种对所述干细胞进行培养，其中，在所述干细胞生长至覆盖培养皿底部60-70％时，将培养基更换为权利要求1所述的第一培养基，以便获得上皮样细胞。

说明书

培养基及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物医药领域，具体地涉及培养基及其应用，更具体地，本发明涉及培养基、制备上皮样细胞的方法、用于制备成釉细胞的试剂盒以及制备成釉细胞的方法。

背景技术

[0002] 目前，将干细胞诱导为特异性的组织细胞类型，并用于相应组织病变的治疗，是现阶段众多疾病治疗的新途径。近年来，再生医学及组织工程学领域的研究者，主要以干细胞作为种子细胞，诱导制备特异性的组织细胞类型，从而为临床上细胞、组织或器官的移植治疗提供大量的材料，进而用于糖尿病、帕金森氏病、脊髓损伤、白血病、心肌损伤、肾衰竭、肝硬化等疾病的治疗，并且，目前已取得较大进展。

[0003] 然而，目前口腔再生医学中牙齿再生的重要牙源性细胞尤其是成釉细胞的制备方法仍有待改进。

发明内容

[0004] 本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种制备成釉细胞的方法，以及所需的试剂盒。

[0005] 根据本发明的一个方面，本发明首先提出了一种培养基。根据本发明的实施例，该培养基为添加有N2supplement、维甲酸和BMP-4的DMEM/F12培养基。发明人惊奇地发现，利用本发明的培养基能够有效地将干细胞诱导为上皮样细胞，进而，将获得的上皮样细胞与动物牙胚的间充质重组、培养及移植后，其能够有效地衍生为牙样结构中具有分泌釉质能力的成釉细胞，进而能够有效地用于牙齿再生，从而为相关口腔疾病例如牙齿缺损相关疾病的治疗提供了新思路。

[0006] 根据本发明的另一方面，本发明还提出了一种制备上皮样细胞的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：利用前述的培养基培养干细胞，以便使该干细胞分化为上皮样细胞，其中，该干细胞为选自胚胎干细胞和诱导多能干细胞的至少之一，其中，所述胚胎干细胞为非人胚胎干细胞。根据本发明的实施例，利用本发明的制备上皮样细胞的方法，能够有效地制备获得上皮样细胞，并且获得的上皮样细胞能够有效地与动物牙胚的间充质重组，进而经培养及移植后，能够有效地获得牙样结构中具有分泌釉质能力的成釉细胞。

[0007] 根据本发明又一方面，本发明还提供了一种用于制备成釉细胞的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括：第一培养基，该第一培养基为前面所述的培养基；和第二培养基，该第二培养基为添加有FBS、谷氨酰胺、非必需氨基酸和青链霉素的高糖DMEM培养基,其中，该第一培养基和第二培养基设置在不同的容器中。根据本发明的实施例，本发明的试剂盒能够有效地用于牙样结构中具有分泌釉质能力的成釉细胞的制备。

[0008] 根据本发明的再一方面，本发明还提供了一种制备成釉细胞的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：根据前述的制备上皮样细胞的方法，制备上皮样细胞；将该上皮样细胞与第一动物牙胚的间充质进行重组，并对所得到的重组产物进行培养，以便得到重组组织；将该重组组织植入第二动物体内并维持预定时间，以便获得成釉细胞。发明人惊奇地发现，利用本发明的制备成釉细胞的方法，能够有效地制备获得牙样结构中具有分泌釉质能力的成釉细胞，进而能够有效地用于牙齿再生，从而为相关口腔疾病的治疗提供了新思路。

[0009] 在本发明的又一方面，本发明还提出了干细胞在制备成釉细胞中的用途。另外，发明人发现所得到的包含成釉细胞的产品具有牙状结构。因而，本发明还提出干细胞在制备牙状结构中的用途。根据本发明的实施例，该牙状结构或者成釉细胞是在哺乳动物中进行移植干细胞的培养物或者衍生物而实现的。根据本发明的实施例，可以采用的哺乳动物包括但不限于小鼠、大鼠、猪、狗和猴。根据本发明的实施例，首先将干细胞诱导形成上皮细胞状细胞，再进行移植。根据本发明的实施例，可以采用的干细胞可以为非人胚胎干细胞，也可以为诱导多能干细胞。根据本发明的实施例，所采用的诱导多能干细胞是从尿液细胞、皮肤成纤维细胞和牙周膜干细胞的至少一种获得的。

[0010] 本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

[0011] 本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

[0012] 图1显示了根据本发明一个实施例的制备成釉细胞的方法的流程示意图；

[0013] 图2显示了根据本发明的一个实施例，制备上皮样细胞时，干细胞向上皮样细胞诱导分化过程中各阶段的形态结构及免疫荧光检测结果；

[0014] 图3显示了根据本发明的一个实施例，制备成釉细胞时，将上皮样细胞与鼠源牙胚间充质的重组组织移植于裸鼠肾包膜下后的观察及检测结果；

[0015] 图4显示了根据本发明的一个实施例，利用诱导多功能干细胞制备成釉细胞时，各阶段的观察及检测结果；

[0016] 图5显示了根据本发明的一个实施例，利用诱导多功能干细胞制备获得的牙样结构(包括成釉细胞)的人特异性标记分子主要组织相容性复合体一类分子(HLA-I)的免疫组化检测结果。

具体实施方式

[0017] 下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

[0018] 需要说明的是，成釉细胞是最重要的牙源性细胞之一，其对于牙再生至关重要。这是因为：牙及其支持组织是从上下颌突和额鼻突的外胚层发育而来，牙的发育是一个长期、复杂的生物学过程，包括细胞与细胞、上皮与间充质的相互作用，细胞分化、形态发生、组织矿化和牙萌出。在胚胎发育过程中，牙板向深层的结缔组织内伸延，在其最末端细胞增生，进一步发育成牙胚。其中，牙胚有三部分组成：①成釉器，起源于口腔外胚层，形成釉质；②牙乳头，起源于外胚层间充质，形成牙髓和牙本质；③牙囊，起源于外胚层间充质，形成牙骨质、牙周膜和固有牙槽骨。牙胚的发生是口腔上皮和外胚间充质相互作用的结果。而由上皮发生发育而来的成釉器的发育是一个连续的过程，可分为三个时期：蕾状期、帽状期和钟状期。在钟状期，上皮细胞团分化为形态和功能各不相同的细胞成分，这时细胞分化为四层：外釉上皮层、内釉上皮层、星网状层和中间层。随着成釉器的进一步发育，内釉细胞开始分化为成釉细胞(ameloblast)，该细胞呈高柱状，高达40μm，直径4-5μm。细胞与中间层细胞以桥粒相连。在成釉细胞分泌釉质开始前，成釉细胞的细胞器重新定位，即细胞核远离基底膜；高尔基复合体体积增大，从细胞的近端向基底膜端移动，大部分位于细胞核的侧面和细胞体的中部；粗面内质网数量明显增加，细胞分泌能力增强；线粒体集中在细胞的邻近中间层的一端，少数分散在细胞其他部位。釉质形成包括两阶段：即成釉细胞分泌有机基质，并立即部分矿化，这一阶段完成后，釉质进一步矿化，与此同时大部分有机基质和水被吸收。成釉细胞在釉质形成过程中，发挥着不可替代的重要作用。

[0019] 为此，本发明提出了培养基及其应用，用于制备牙样结构中具有分泌釉质能力的成釉细胞，进而，能够将制备获得的成釉细胞有效地应用于牙齿再生，从而为相关口腔疾病的治疗提供了新思路。

[0020] 制备上皮样细胞的培养基及方法

[0021] 根据本发明的一个方面，本发明首先提出了一种培养基。根据本发明的实施例，该培养基为添加有N2supplement、维甲酸和BMP-4的DMEM/F12培养基。其中，根据本发明的实施例，上述培养基中各成分的含量不受特别限制，只要能够将干细胞成功诱导为上皮样细胞即可。根据本发明的一些具体示例，本发明的培养基含有1重量％的N2supplement、1μM维甲酸、25ng/ml BMP-4。由此，利用本发明的培养基能够有效地将干细胞诱导为上皮样细胞。

[0022] 其中，需要说明的是，在本文中所使用的术语“N2supplement”是指N2补充剂，“BMP-4”指骨成型蛋白4，“DMEM/F12培养基”是指DMEM培养基与F12培养基按照1：1比例混合所制备的培养基。

[0023] 发明人惊奇地发现，利用本发明的培养基能够有效地将干细胞诱导为上皮样细胞，进而，将获得的上皮样细胞与动物牙胚的间充质重组、培养及移植后，能够有效地获得牙样结构中具有分泌釉质能力的成釉细胞，进而，能够将制备获得的成釉细胞有效地应用于牙齿再生，从而为相关口腔疾病的治疗提供了新思路。

[0024] 进一步，根据本发明的另一方面，本发明还提出了一种制备上皮样细胞的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：利用前述的培养基培养干细胞，以便使该干细胞分化为上皮样细胞，其中，该干细胞为选自胚胎干细胞和诱导多能干细胞的至少之一，其中，所述胚胎干细胞为非人胚胎干细胞。根据本发明的实施例，利用本发明的制备上皮样细胞的方法，能够有效地制备获得上皮样细胞，并且获得的上皮样细胞能够有效地与动物牙胚的间充质重组，进而经培养及移植后，能够有效地获得成釉细胞。

[0025] 根据本发明的实施例，在本发明的制备上皮样细胞的方法中，诱导多能干细胞的来源不受特别限制。根据本发明的一些具体示例，诱导多能干细胞可以衍生自选自皮肤成纤维细胞、牙周膜干细胞和尿液细胞的至少一种。根据本发明的一些实施例，干细胞为衍生自尿液细胞的非整合型诱导多能干细胞。根据本发明的另一些实施例，干细胞为衍生自尿液细胞，由病毒系统诱导获得的诱导多能干细胞。由此，能够高效地制备上皮样细胞。

[0026] 制备成釉细胞的试剂盒及方法

[0027] 根据本发明又一方面，本发明提供了一种用于制备成釉细胞的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括：第一培养基，该第一培养基为前面所述的培养基；和第二培养基，该第二培养基为添加有FBS、谷氨酰胺、非必需氨基酸和青链霉素的高糖DMEM培养基，其中，该第一培养基和第二培养基设置在不同的容器中。根据本发明的实施例，本发明的试剂盒能够有效地用于成釉细胞的制备。其中，需要说明的是，在本文中所使用的术语“FBS”是指胎牛血清。

[0028] 根据本发明的实施例，本发明的用于制备成釉细胞的试剂盒可以进一步包括：第TM三培养基，该第三培养基为选自mTeSR1 、E8培养基和KSR条件培养基的至少一种。由此，能够有效地提高诱导上皮样细胞的效率，进而能够有效提高制备成釉细胞的效率。

[0029] 根据本发明的实施例，在本发明的试剂盒中，第二培养基的各成分的含量不受特别限制。根据本发明的一些具体示例，按照重量百分比，第二培养基含有：10重量％的FBS、2mM谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素。由此，能够有效地提高制备成釉细胞的效率。

[0030] 根据本发明的再一方面，本发明还提供了一种制备成釉细胞的方法。根据本发明的实施例，参照图1，本发明的制备成釉细胞的方法可以包括以下步骤：

[0031] S100：制备上皮样细胞

[0032] 首先，根据前述的制备上皮样细胞的方法，制备上皮样细胞。具体地，根据本发明的实施例，可以利用前面所述的本发明的培养基培养干细胞5-10天，优选7天。由此，能够使干细胞分化为上皮样细胞，从而能够高效地制备获得上皮样细胞。其中，根据本发明的实施例，干细胞的种类不受特别限制。根据本发明的具体示例，干细胞可以为选自胚胎干细胞和诱导多能干细胞的至少之一，其中，所述胚胎干细胞为非人胚胎干细胞。由此，制备上皮样细胞需时少，效率高。

[0033] 此外，根据本发明的另一些实施例，在制备上皮样细胞之前，可以利用选自TMmTeSR1 、E8培养基和KSR条件培养基的至少一种对干细胞进行培养，其中，在该干细胞生长至覆盖培养皿底部60-70％时，将培养基更换为本发明的添加有N2supplement、维甲酸和BMP-4的DMEM/F12培养基，以便获得上皮样细胞。

[0034] S200：将上皮样细胞与第一动物牙胚的间充质进行重组及培养，以便获得重组组织

[0035] 即，将获得的上皮样细胞与第一动物牙胚的间充质进行重组，并对所得到的重组产物进行培养，以便得到重组组织。其中，根据本发明的实施例，获得第一动物牙胚的间充质的方法不受特别限制。根据本发明的具体示例，第一动物牙胚的间充质是从小鼠磨牙牙胚中通过机械法分离的，其中，在进行机械法分离之前，利用蛋白酶对该牙胚进行消化。由此，能够有效地获得第一动物牙胚的间充质。其中，对牙胚进行消化所采用的蛋白酶的种类也不受特别限制，根据本发明的实施例，所采用的蛋白酶可以为0.75mg/ml的Dispase。根据本发明的实施例，将获得的上皮样细胞与第一动物牙胚的间充质进行重组的方法也不受特别限制。根据本发明的一些具体示例，将上皮样细胞与第一动物牙胚的间充质进行重组可以进一步包括：采用蛋白酶例如Dispase将小鼠磨牙牙胚进行消化分离，以便获得第一动物牙胚的间充质；将所述上皮样细胞形成的皮片切割成同间充质大小后，移植于所述第一动物牙胚的间充质上，形成重组的组织块(重组牙胚)，然后于37℃下培养过夜。由此，对所得到的重组产物进行培养后即可有效地获得重组组织。

[0036] 另外，根据本发明的实施例，对所得到的重组产物进行培养的方法也不受特别限制。根据本发明的一些具体示例，可以利用添加有FBS、谷氨酰胺、非必需氨基酸和青链霉素的高糖DMEM培养基对所得到的重组产物进行气液面培养，以便得到重组组织。其中，根据本发明的另一些实施例，添加有FBS、谷氨酰胺、非必需氨基酸和青链霉素的高糖DMEM培养基中含有10重量％的FBS、2mM谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素。此外，在本文中所使用的术语“气液面培养”具体包括：先将支架网置于培养皿内，然后将重组产物置于支架网上，并向其中加入适量所需培养基，使培养皿内的培养基液面高度刚好没过支架但不没过重组产物，从而实现重组产物的气液面培养。

[0037] S300：将重组组织植入第二动物体内并维持预定时间，以便获得成釉细胞[0038] 根据本发明的实施例，第一动物和第二动物的种类不受特别限制。根据本发明的一些实施例，可以采用生物医学领域常用的模式动物作为第一动物和第二动物。根据本发明的一些具体示例，第一动物为胎鼠，第二动物为裸鼠，由此，能够有效地制备高质量的成釉细胞。

[0039] 根据本发明的实施例，将重组组织植入第二动物体内的位置不受特别限制。根据本发明的一些具体示例，可以将重组组织植入裸鼠的肾包膜与皮质之间。由此，能够通过肾皮质构建重组产物的营养环境，从而促进重组组织的生长发育。

[0040] 此外，根据本发明的实施例，将重组组织植入第二动物体内后维持的预定时间不受特别限制，在具体实验操作中，以能够成功获得成釉细胞为标准。根据本发明的一些具体实施例，该预定时间可以为2-4周，优选3周。由此，能够有效地获得高质量的成釉细胞。

[0041] 发明人惊奇地发现，利用本发明的制备成釉细胞的方法，能够有效地制备获得成釉细胞，并且获得的成釉细胞能够有效地用于相关口腔疾病的治疗。

[0042] 下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

[0043] 实施例1：上皮样细胞的制备

[0044] 材料：尿液细胞来源的诱导多能干细胞(UC-iPSC)

[0045] 培 养 基：mTeSR1TM 培 养 基 (STEMCELL catalog#05850)； 添 加 有N2supplement(Invitrogen catalog#17502-048)、维 甲 酸 (Sigma catalog#R2625) 和BMP-4(R&D catalog#314-BP-050/CF)的DMEM/F12培养基(Gibco catalog#11330-032)，其中，该培养基含有1重量％的N2supplement、1μM维甲酸、25ng/ml BMP-4。

[0046] 方法步骤：

[0047] 首先，利用Metrigel包被培养板，然后在培养板上接种诱导多能干细胞，并利用TMmTeSR1 培养基对其进行培养，约4-6天传代一次。其中，在传代之前，要采用2mg/ml的Dispase酶将经过培养的H1ESC和UC iPSC消化成小块。

[0048] 待诱导多能干细胞长至皿底60％-70％时，向其中加入添加有N2supplement、维甲酸和BMP-4的DMEM/F12培养基，并且每日全量换液1次，培养7天可见典型上皮样细胞形成，由此，上述干细胞成功分化为上皮样细胞。然后，将培养基更换为DSFM(defined keratinocyte serum-free medium，Invitrogen,Cat.NO.10744-019)继续培养，以观察上皮样细胞的形态变化。

[0049] 其中，图2显示了干细胞向上皮样细胞诱导分化过程中各阶段的形态结构及免疫荧光检测结果。如图2所示，A.显微镜下观察到的人诱导多能干细胞的形态；B.人诱导多能干细胞向上皮样细胞方向诱导分化7天的形态；C.诱导分化7天后所形成的膜状上皮组织样结构；D.诱导分化7天后对分化细胞p63(绿色荧光)和K14(红色荧光)的免疫荧光检测结果；E.诱导分化21天后对分化细胞p63(绿色荧光)和K14(红色荧光)的免疫荧光检测结果。其中，图2A、B中，Bar＝200μm；图2C中，Bar＝2000μm；图2D、E中，Bar＝100μm。其中，在本文中所使用的Bar表示图中标尺。此外，需要说明的是，显微镜下观察到的胚胎干细胞的形态，以及其向上皮样细胞方向诱导分化7天的形态，均与人诱导多能干细胞基本相同。

[0050] 实施例2：成釉细胞的制备

[0051] 材料：实施例1中获得的上皮样细胞；14.5天的ICR胎鼠的磨牙牙胚；裸鼠[0052] 试剂：浓度 为0.75mg/ml 的Dispase(Gibco catalog#17105-041)；添 加 有FBS(PAA catalog#A11-151)、谷氨酰胺(Gibco catalog#25030-081)、非必需氨基酸(Gibco catalog#11140-050)和青链霉素(Hyclone catalog#SV30010)的高糖DMEM培养基(Hyclone catalog#SH30022.01B)，其中，该培养基含有10％FBS、2mM谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素。

[0053] 仪器：立体体式显微镜(ZEISS，SteReo Lumar V12)；正置生物学显微镜ZEISS(Axio Scope A1)

[0054] 方法步骤：

[0055] 1.ICR胎鼠磨牙牙胚间充质的获得

[0056] 机械法分离14.5天ICR胎鼠的磨牙牙胚。具体地，采用浓度为0.75mg/ml的Dispase对该牙胚进行消化后，利用机械法分离获得牙胚的上皮组织与间充质组织。

[0057] 2.重组组织的获得

[0058] 将实施例1中获得的上皮样细胞与前述获得的ICR胎鼠磨牙牙胚间充质进行重组，即：将上皮样细胞形成的皮片切割成同间充质大小后，移植于ICR胎鼠磨牙牙胚间充质上，形成重组的组织块(重组牙胚)然后于37℃下培养过夜，以便获得重组产物；然后，利用上述添加有FBS、谷氨酰胺、非必需氨基酸和青链霉素的高糖DMEM培养基对重组产物进行气液面培养24h，以便得到重组组织。

[0059] 3.成釉细胞的制备

[0060] 将获得的重组组织移植于裸鼠肾包膜下并维持3周，以便获得成釉细胞。具体地，首先将裸鼠进行全身麻醉，然后剪开其背侧皮肤及肌肉，取出肾脏后，机械法挑开肾脏包膜，并将上述获得的重组组织移入该肾脏包膜与皮质之间，缝合伤口后，对裸鼠进行常规饲养。移植3周后，取出肾脏，观察成牙效果，结果见图3和图4。

[0061] 其中，图3是将上皮样细胞与鼠源牙胚间充质的重组组织移植于裸鼠肾包膜下后的观察及检测结果。如图3所示，A.立体式显微镜下观察到的重组组织肾包膜下移植3周后所形成的骨状结构；B.对A进行组织切片和HE染色的结果；C.骨形成蛋白(BSP)的免疫组化检测结果。其中，图3A中，图中标尺(Bar)为2000μm；图3B和图3C中，Bar＝100μm。图4是利用诱导多功能干细胞制备成釉细胞时，各阶段的观察及检测结果。如图
4所示，F-J为人诱导多能干细胞向成釉细胞的诱导分化结果，其中，F.终末牙齿形成的直观图；G.立体式显微镜下观察到的重组组织肾包膜下移植3周后所形成的齿状结构(虚线所圈注部分)；H.对G进行组织切片和HE染色的结果(牙齿的横截面观)；I.H的局部于正置生物学显微镜400倍下的观察结果(箭头所指为成釉细胞)；J.免疫组化染色检测人成釉细胞标记(造釉蛋白)表达的结果(箭头所指为成釉细胞)。其中，图4A、B、F、G中，Bar＝500μm；图4C、H中，Bar＝400μm；图4D、E、I、J中，Bar＝100μm。

[0062] 进一步，将上述于立体式显微镜下观察到的重组组织肾包膜下移植3周后所形成的齿状结构的组织切片(牙齿的横截面观)进行免疫组化染色，以便检测其中人特异性的主要组织相容性复合体I类分子HLA-I的表达，结果见图5。图5显示了利用诱导多功能干细胞制备获得的牙样结构(包括成釉细胞)的人特异性标记分子主要组织相容性复合体一类分子(HLA-I)的免疫组化检测结果。如图5所示，其中，图B、C、D为图A中HLA-I阳性表达的局部放大图，分别突出显示了成釉细胞层(箭头所指为成釉细胞)、成釉细胞层周围的突起状细胞及鳞状上皮细胞的免疫组化检测结果，其中Bar＝200μm。图5所示的人特异性标记分子HLA-I的免疫组化检测结果，进一步证实了所获得的成釉细胞确实是由人源的细胞衍生获得的。

[0063] 由此，表明利用本发明的制备成釉细胞的方法，能够有效地制备获得成釉细胞。

[0064] 实施例3：

[0065] 按照实施例2所述的制备成釉细胞的方法，利用尿液细胞来源的8株不同的诱导多能干细胞克隆株制备成釉细胞，并计算比较各干细胞诱导制备获得成釉细胞的效率，结果见下表1：

[0066] 表1

[0067]诱导多能干细胞克隆株 成牙数/重组组织样品数 成牙比率
vUC1-iPSC-C1 6/42 14.3％
UC1-iPSC-C1 12/50 24％
UC5-iPSC-C1 13/56 23.2％
UC5-iPSC-C2 15/59 25.4％
UC5-iPSC-C3 6/40 15％
UC7-iPSC-C3 12/52 23.1％
UC7-iPSC-C6 7/60 11.7％
UC7-iPSC-C9 17/59 28.8％

[0068] 其中，8株不同的诱导多能干细胞克隆株中，vUC1-iPSC-C1是通过逆转病毒诱导方法获得的诱导多能性干细胞克隆株，其他7株是通过电转重编程质粒诱导方法获得的诱导多能性干细胞克隆株。

[0069] 由上表1可知，iPSC均可成牙；各株iPSC均来自于尿液细胞，但不同株细胞在成牙比率上有所差异。由此表明，利用本发明的制备成釉细胞的方法，采用诱导多能干细胞能够有效地制备获得成釉细胞，且成牙率较高。

[0070] 在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

[0071] 尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。