重组单纯疱疹病毒、其制备方法及应用

摘要

本发明是有关于一种重组单纯疱疹病毒及其制备方法，其是将含有ICP4基因的单纯疱疹病毒基因组中的ICP4基因启动子替换为人端粒酶逆转录酶启动子hTERTp或其它肿瘤特异性启动子，本发明还提供了该重组单纯疱疹病毒在制备治疗肿瘤药物中的应用；本发明还提供了另一种重组单纯疱疹病毒，其是在前述重组单纯疱疹病毒基因组中插入荧光蛋白表达盒；前一种重组单纯疱疹病毒相对于现有的单纯疱疹病毒，能更有效地选择性地在人肿瘤细胞内生长繁殖，而不在人正常细胞中繁殖，从而更有效地杀伤癌细胞，保护正常细胞；本发明的另一种重组单纯疱疹病毒，其能在肿瘤细胞内发光，可更快速、准确、灵敏并广谱地实现肿瘤的早期诊断以及肿瘤转移的诊断。

权利要求

1.一种重组单纯疱疹病毒，其特征在于将含有ICP4基因的单纯疱疹病毒基因组中的ICP4基因启动子替换为人端粒酶逆转录酶启动子hTERTp，并且所述重组单纯疱疹病毒的制备方法包括以下步骤：用人端粒酶逆转录酶启动子hTERTp取代含有ICP4基因的单纯疱疹病毒中的ICP4基因启动子，构建该重组单纯疱疹病毒HSV-hTERTp_ICP4：(1)构建穿梭质粒pICP4del-hTERTp_ICP4和pICP4del-eGFP：a.用BHK细胞培养该含有ICP4基因的单纯疱疹病毒，并纯化其基因组DNA；

b.扩增ICP4基因上游侧翼序列：以步骤a中所得病毒基因组DNA为模板，用以下ICP4USf正向引物和ICP4USr反向引物：ICP4USf正向引物：CCCTCCAGACGCACCGGAGTCGGGGG

ICP4USr反向引物：AAGTCGACTCTAGAGGATCGATCTCTGACCTGAGATTGGCGGCACTGAGGTA扩增出ICP4基因上游侧翼序列；

扩增ICP4基因下游侧翼序列：以步骤a中所得病毒基因组DNA为模板，用以下ICP4DSf正向引物和ICP4USr反向引物：ICP4DSf正向引物：AAAAGTCGACCTGCAGGCATGCTAACGAGGAACGGGCAGGGGGCICP4DSr反向引物：AAAAAAGCTTGCATGCCCACGTGCGCGGGGCCAGACGGGCT扩增出ICP4基因下游侧翼序列；

将上下游侧翼序列克隆到pSP73质粒上，构建pICP4del及pICP4del-eGFP质粒：将SalI酶切的前述扩增出的ICP4基因的上游侧翼序列及SalI/HindIII双酶切的前述扩增出的ICP4基因的下游侧翼序列混合并连接到pSP73的EcoRV/HindIII位点，得到pICP4del；用EcoRI/XhoI从pcDNA3.1-eGFP切下CMV启动子控制的eGFP表达盒，经T4 DNA聚合酶补平末端后插入到pICP4del的EcoRV位点，得到pICP4del-eGFP；

c.分三次PCR扩增出ICP4基因中三段序列：首先，使用以下引物：

ICP4-1st正向引物：TTTTTTGAATTCATGGCGTCGGAGAACAAGCAGCGCCICP4-1st反向引物：TGGAGCCACCCCATGGCCTCCGCGT

ICP4-2nd正向引物：CGACGCCGCGCAGCAGTACGCCCTG

ICP4-2nd反向引物：CGGCGGGGGCGGGCCCGGCGCACCG

ICP4-3rd正向引物：CCTCATGTTTGACCCGCGGGCCCTG

ICP4-3rd反向引物：TTTTTTCTCGAGTTACAGCACCCCGTCCCCCTCGAAC以步骤a中所得病毒基因组DNA为模板，分别扩增出三段基因片段ICP4-1st、ICP4-2nd和ICP4-3rd，而后分别将该三段基因片段插入pSP73质粒的EcoRV位点构建出以下三种质粒：pSP73-ICP4-1st、pSP73-ICP4-2nd、pSP73-ICP4-3rd，从该三种质粒中用EcoRI和BsrGI剪切出ICP4-1st、用BsrGI和nd rdPvuI剪切出ICP4-2 及用PvuI和XhoI剪切出ICP-3 待用；

d.从含人端粒酶逆转录酶启动子hTERTp的质粒中用NruI和HindIII切下hTERTp片段，取代从pcDNA3-NHN上用NruI和HindIII切除的CMV启动子，得到质粒pcDNA3-NHN-hTERTp，其中，pcDNA3-NHN是在pcDNA3的NheI位点插入NheI-HapI-NheI酶切位点序列所得；

st nd rd

e.将步骤c中的该ICP4-1 、ICP4-2 和ICP4-3 混合并连接到步骤d中的该pcDNA3-NHN-hTERTp的EcoRI及XhoI位点，得到质粒pcDNA3-NHN-hTERTp_ICP4；

f.用SalI酶切步骤b中含ICP4基因上下游侧翼序列的质粒pICP4del，并补平末端待用，用PmeI和HpaI从步骤e获得的该质粒pcDNA3-NHN-hTERTp_ICP4剪切出hTERTp_ICP4表达盒片段，并将其与该酶切后待用的pICP4del质粒连接，构建出质粒pICP4del-hTERTp_ICP4；

g.构建BHK-ICP4辅助细胞：用EcoRI和XhoI从步骤e获得的该质粒pcDNA3-NHN-hTERTp_ICP4中酶切出ICP4基因，并克隆到pcDNA3中CMV启动子的下游EcoRI和XhoI位点，得到pcDNA3-CMV-ICP4质粒；将该pcDNA3-CMV-ICP4质粒转染BHK细胞，该pcDNA3-CMV-ICP4质粒DNA可重组到BHK细胞基因组中，使有些BHK重组细胞获得对新霉素的抗性和表达ICP4，用抗菌素G418杀死未重组的BHK细胞，经过几轮的亚克隆筛选，用RT-PCR方法筛选出表达ICP4的BHK-ICP4辅助细胞；

(2)剔除基因组中ICP4基因启动子并插入端粒酶逆转录酶启动子hTERTp启动子：A.用BHK细胞培养该含有ICP4基因的单纯疱疹病毒HSV，并提取病毒基因组DNA；

B.将步骤A中该病毒基因组DNA与步骤(1)b中该质粒pICP4del-eGFP共转入步骤(1)g中该BHK-ICP4辅助细胞内，经同源重组，该质粒pICP4del-eGFP中绿色荧光蛋白表达盒GFP置换了该含有ICP4基因的单纯疱疹病毒HSV的ICP4基因，使得重组病毒的毒斑发绿色荧光，经过几轮的噬斑纯化，挑选绿色荧光毒斑，就能纯化出重组病毒HSV-d4GFP；

C、培养步骤B中该HSV-d4GFP病毒，并提取基因组DNA；

D、将步骤C该重组病毒HSV-d4GFP的基因组DNA和步骤(1)f该质粒pICP4del-hTERTp_ICP4的DNA共转入该BHK-ICP4辅助细胞，经同源重组，hTERTp_ICP4表达盒置换了该重组病毒HSV-d4GFP的绿色荧光蛋白GFP表达盒，使新重组病毒的毒斑不发绿色荧光，经过几轮的噬斑纯化，挑选无荧光毒斑，就能纯化出该重组单纯疱疹病毒HSV-hTERTp_ICP4。

2.根据权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其特征在于其微生物保藏号为CGMCC No.6397。

3.根据权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其特征在于该单纯疱疹病毒剔除了ICP34.5基因和ICP47基因中的一种或两种。

4.根据权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其特征在于先剔除该含有ICP4基因的单纯疱疹病毒的ICP34.5基因和ICP47基因中的一种或两种，再以人端粒酶逆转录酶启动子hTERTp替换ICP4基因启动子，或在以人端粒酶逆转录酶启动子hTERTp替换ICP4基因启动子得到该重组单纯疱疹病毒HSV-hTERTp_ICP4后，再剔除该重组单纯疱疹病毒HSV-hTERTp_ICP4的ICP34.5基因和ICP47基因中的一种或两种。

5.根据权利要求1或4所述的重组单纯疱疹病毒，其特征在于以其它肿瘤特异性启动子替代该人端粒酶逆转录酶启动子hTERTp。

6.根据权利要求1或4所述的重组单纯疱疹病毒，其特征在于该方法还包括对所有涉及的质粒进行测序以证实无突变发生的步骤。

7.根据权利要求1或4所述的重组单纯疱疹病毒，其特征在于该绿色荧光蛋白表达盒可由青色荧光蛋白表达盒、红色荧光蛋白表达盒、黄色荧光蛋白表达盒或其它指示蛋白表达盒所替换。

8.一种药物组合物，其特征在于该药物组合物包含权利要求1或2所述的重组单纯疱疹病毒，以及药物可接受的载体或赋形剂。

9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于该药物组合物为注射液，所述注射液包括药学上可接受的载体以及权利要求1至3任一权利要求所述的重组单纯疱疹病毒，每毫升所述注射液中含有102～1010个该重组单纯疱疹病毒。

10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于该药学上可接受的载体为pH值为

4.0～9.0的磷酸缓冲液。

11.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于该注射液还含有保护剂和/或渗透压调节剂；以该注射液为基准，所述保护剂的含量为0.01～30％重量，所述保护剂选自肌醇、山梨醇和蔗糖中的一种或一种以上；每千克该注射液含有200～700毫克所述渗透压调节剂，所述渗透压调节剂为氯化钠和/或氯化钾。

12.权利要求1至3任一权利要求所述的重组单纯疱疹病毒，或8至11任一权利要求所述的药物组合物在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

13.一种重组单纯疱疹病毒，其特征在于在如权利要求1至3任一权利要求所述的重组单纯疱疹病毒基因组中插入荧光蛋白表达盒或其它指示蛋白表达盒。

14.根据权利要求13所述的重组单纯疱疹病毒，其特征在于该荧光蛋白表达盒为绿色荧光蛋白表达盒、青色荧光蛋白表达盒、红色荧光蛋白表达盒、黄色荧光蛋白表达盒及其它指示蛋白表达盒中任一种。

15.权利要求13或14所述的重组单纯疱疹病毒在制备诊断肿瘤的药物中的应用。

16.一种肿瘤诊断试剂盒，其特征在于该肿瘤诊断试剂盒包含如权利要求13或14所述的重组单纯疱疹病毒。

17.根据权利要求16所述的肿瘤诊断试剂盒，其特征在于该肿瘤诊断试剂盒检测的样品选自受试者全血、血浆、淋巴细胞悬浮液、骨髓、胸腔积液或腹腔积液。

18.根据权利要求16所述的肿瘤诊断试剂盒，其特征在于该肿瘤诊断试剂盒还包括：

RPMI-1640培养基、pH为7的红细胞裂解液和pH为7.2～7.4的磷酸缓冲液，其中，所述红细胞裂解液包含0.15M氯化铵、10nM碳酸氢钾和1nM乙二胺四乙酸；或RPMI-1640培养基、比重为1.077～0.001千克/升的聚蔗糖-泛影葡胺和pH为7.2～7.4的磷酸缓冲液。

说明书

重组单纯疱疹病毒、其制备方法及应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种重组单纯疱疹病毒，特别是涉及一种在抗肿瘤活性及肿瘤靶向性上有所改进的单纯疱疹病毒。

背景技术

[0002] 现有技术中已经提出单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)可用于溶瘤法治疗癌症，并通过剔除ICP34.5基因和ICP47基因对单纯疱疹病毒进行改进，使其可选择性地在肿瘤细胞内复制，而不伤害正常细胞，然而这种改进并不能有效地使单纯疱疹病毒特异性地只选择在肿瘤细胞内复制，而是也会有单纯疱疹病毒在某些正常细胞内复制，从而对这些正常细胞造成伤害。如何实现使单纯疱疹病毒特异性地只杀伤肿瘤细胞，而不破坏正常细胞一直是本领域技术人员研究的重点课题。

[0003] 端粒是真核生物染色体末端的一种特殊结构，其作用是维护染色体结构稳定，包括防止染色体末端融合，保护染色体结构基因和避免遗传信息在复制中丢失。端粒酶是由小分子RNA和蛋白质组成的逆转录酶，能利用自身RNA为模板合成端粒DNA，弥补随细胞有丝分裂逐渐缩短的端粒。其有三个主要组成部分：人端粒酶RNA(human telomerase RNA，hTR)、端粒酶相关蛋白(telomerase-as sociated protein，TP1/TLP1)、人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)。端粒酶RNA在大多数细胞中都表达，而人端粒酶逆转录酶是端粒酶的限速成分，仅在端粒酶阳性的细胞中表达，与端粒酶活性相关。尽管一些肿瘤细胞在重组时通过替代性端粒延长(alternative lengthening of telomeres，ALT)机制来维持端粒长度，但仍有85％以上的肿瘤细胞通过上调hTERT来活化端粒酶，而且hTERT仅在极少数正常体细胞中表达。这就为肿瘤治疗提供了一个很好的契机。单纯疱疹病毒表达的感染细胞蛋白(infected cell proteins，ICPs)分为三个等级：初始(immediate early，IE)、早期(early)和晚期(late)。其中IE蛋白是影响病毒复制的关键蛋白，包括：ICP0、ICP4、ICP22、ICP27和ICP47，而其中ICP4是最关键的复制相关蛋白。

[0004] 现已发现多种肿瘤特异性启动子。根据其特点，可分为以下几种：(1)泛肿瘤特异启动子，指在多种肿瘤细胞内发挥其功能的启动子，如hTERT启动子、存活素(survivin)启动子等。(2)组织特异性启动子，如前列腺特异性抗原(PSA)启动子。(3)某些肿瘤特有的启动子，如肝癌细胞特有的甲胎球蛋白(AFP)启动子、上皮细胞肿瘤的癌胚抗原(CEA)启动子等。这些肿瘤特异性启动子已广泛应用于肿瘤基因治疗及肿瘤诊断领域。

[0005] 若将ICP4启动子替换为hTERT启动子(hTERTp)或其它肿瘤特异性启动子，使新重组单纯疱疹病毒只能在hTERT高表达的肿瘤细胞中表达其早期复制蛋白ICP4，从而进行复制增殖，杀伤肿瘤细胞，有望解决上述技术难题。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于，提供一种重组单纯疱疹病毒，该重组单纯疱疹病毒能选择性地在人肿瘤细胞内生长繁殖，而不在人正常细胞中繁殖，从而杀伤肿瘤细胞，且不伤害正常细胞。

[0007] 本发明的另一目的在于，提供一种上述重组单纯疱疹病毒的制备方法。

[0008] 本发明的再一目的在于，提供一种药物组合物及其在制备治疗癌症的药物中的应用，以及上述重组单纯疱疹病毒在制备治疗癌症的药物中的应用。

[0009] 本发明的另一目的在于，提供另一种重组单纯疱疹病毒、其在制备诊断肿瘤的药物中的应用以及一种肿瘤诊断试剂盒。

[0010] 本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。依据本发明提出的重组单纯疱疹病毒，其是将含有ICP4基因的单纯疱疹病毒基因组中的ICP4基因启动子替换为人端粒酶逆转录酶启动子hTERTp或其它肿瘤特异性启动子。

[0011] 本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术措施进一步实现。

[0012] 前述的重组单纯疱疹病毒，其微生物保藏号为CGMCC No.6397。

[0013] 前述的重组单纯疱疹病毒，其中该单纯疱疹病毒剔除了ICP34.5基因和ICP47基因中的一种或两种。

[0014] 本发明的目的及解决其技术问题还采用以下技术方案来实现。依据本发明提出的一种制备前述重组单纯疱疹病毒的方法，其包括以下步骤：用人端粒酶逆转录酶启动子hTERTp取代含有ICP4基因的单纯疱疹病毒中的ICP4基因启动子，构建该重组单纯疱疹病毒HSV-hTERTp_ICP4：

[0015] (1)构建穿梭质粒pICP4del-hTERTp_ICP4和pICP4del-eGFP：

[0016] a.用BHK细胞培养该含有ICP4基因的单纯疱疹病毒，并纯化其基因组DNA；

[0017] b.扩增ICP4基因上游侧翼序列：以步骤a中所得病毒基因组DNA为模板，用以下ICP4USf正向引物和ICP4USr反向引物：

[0018] ICP4USf正向引物：CCCTCCAGACGCACCGGAGTCGGGGG

[0019] ICP4USr反向引物：AAGTCGACTCTAGAGGATCGATCTCTGACCTGAGATTGGCGGCACTGAGGTA[0020] 扩增出ICP4基因上游侧翼序列；

[0021] 扩增ICP4基因下游侧翼序列：以步骤a中所得病毒基因组DNA为模板，用以下ICP4DSf正向引物和ICP4USr反向引物：

[0022] ICP4DSf正向引物：AAAAGTCGACCTGCAGGCATGCTAACGAGGAACGGGCAGGGGGC[0023] ICP4DSr反向引物：AAAAAAGCTTGCATGCCCACGTGCGCGGGGCCAGACGGGCT[0024] 扩增出ICP4基因下游侧翼序列；

[0025] 将上下游侧翼序列克隆到pSP73质粒上，构建pICP4del及pICP4del-eGFP质粒：将SalI酶切的前述扩增出的ICP4基因的上游侧翼序列及SalI/HindIII双酶切的前述扩增出的ICP4基因的下游侧翼序列混合并连接到pSP73的EcoRV/HindIII位点，得到pICP4del；用EcoRI/XhoI从pcDNA3.1-eGFP切下CMV启动子控制的eGFP表达盒，经T4 DNA聚合酶补平末端后插入到pICP4del的EcoRV位点，得到pICP4del-eGFP；

[0026] c.分三次PCR扩增出ICP4基因中三段序列：首先，使用以下引物：

[0027] ICP4-1st正向引物：TTTTTTGAATTCATGGCGTCGGAGAACAAGCAGCGCC

[0028] ICP4-1st反向引物：TGGAGCCACCCCATGGCCTCCGCGT

[0029] ICP4-2nd正向引物：CGACGCCGCGCAGCAGTACGCCCTG

[0030] ICP4-2nd反向引物：CGGCGGGGGCGGGCCCGGCGCACCG

[0031] ICP4-3rd正向引物：CCTCATGTTTGACCCGCGGGCCCTG

[0032] ICP4-3rd反向引物：TTTTTTCTCGAGTTACAGCACCCCGTCCCCCTCGAAC

[0033] 以步骤a中所得病毒基因组DNA为模板，分别扩增出三段基因片段ICP4-1st、ICP4-2nd和ICP4-3rd，而后分别将该三段基因片段插入pSP73质粒的EcoRV位点构建出以下三种质粒：pSP73-ICP4-1st、pSP73-ICP4-2nd、pSP73-ICP4-3rd，从该三种质粒中用EcoRI和BsrGI剪切出ICP4-1st、用BsrGI和PvuI剪切出ICP4-2nd及用PvuI和XhoI剪切出ICP-3rd待用；

[0034] d.从含人端粒酶逆转录酶启动子hTERTp的质粒中用NruI和HindIII切下hTERTp片段，取代从pcDNA3-NHN上用NruI和HindIII切除的CMV启动子，得到质粒pcDNA3-NHN-hTERTp，其中，pcDNA3-NHN是在pcDNA3的NheI位点插入NheI-HapI-NheI酶切位点序列所得；

[0035] e.将步骤c中的该ICP4-1st、ICP4-2nd和ICP4-3rd混合并连接到步骤d中的该pcDNA3-NHN-hTERTp的EcoRI及XhoI位点，得到质粒pcDNA3-NHN-hTERTp_ICP4；

[0036] f.用SalI酶切步骤b中含ICP4基因上下游侧翼序列的质粒pICP4del，并补平末端待用，用PmeI和HpaI从步骤e获得的该质粒pcDNA3-NHN-hTERTp_ICP4剪切出hTERTp_ICP4表达盒片段，并将其与该酶切后待用的pICP4del质粒连接，构建出质粒pICP4del-hTERTp_ICP4；

[0037] g.构建BHK-ICP4辅助细胞：用EcoRI和XhoI从步骤e获得的该质粒pcDNA3-NHN-hTERTp_ICP4中酶切出ICP4基因，并克隆到pcDNA3中CMV启动子的下游EcoRI和XhoI位点，得到pcDNA3-CMV-ICP4质粒；将该pcDNA3-CMV-ICP4质粒转染BHK细胞，该pcDNA3-CMV-ICP4质粒DNA可重组到BHK细胞基因组中，使有些BHK重组细胞获得对新霉素的抗性和表达ICP4，用抗菌素G418杀死未重组的BHK细胞，经过几轮的亚克隆筛选，用RT-PCR方法筛选出表达ICP4的BHK-ICP4辅助细胞；

[0038] (2)剔除基因组中ICP4基因启动子并插入端粒酶逆转录酶启动子hTERTp启动子：

[0039] A.用BHK细胞培养该含有ICP4基因的单纯疱疹病毒，并提取病毒基因组DNA；

[0040] B.将步骤A中该病毒基因组DNA与步骤(1)b中该质粒pICP4del-eGFP共转入步骤(1)g中该BHK-ICP4辅助细胞内，经同源重组，该质粒pICP4del-eGFP中绿色荧光蛋白GFP表达盒置换了该含有ICP4基因的单纯疱疹病毒HSV的ICP4基因，使得重组病毒的毒斑发绿色荧光，经过几轮的噬斑纯化，挑选绿色荧光毒斑，就能纯化出重组病毒HSV-d4GFP；

[0041] C、培养步骤B中该HSV-d4GFP病毒，并提取基因组DNA；

[0042] D、将步骤C该重组病毒HSV-d4GFP的基因组DNA和步骤(1)f该质粒pICP4del-hTERTp_ICP4的DNA共转入该BHK-ICP4辅助细胞，经同源重组，hTERTp_ICP4表达盒置换了该重组病毒HSV-d4GFP的绿色荧光蛋白表达盒GFP，使新重组病毒的毒斑不发绿色荧光，经过几轮的噬斑纯化，挑选无荧光毒斑，就能纯化出该重组单纯疱疹病毒HSV-hTERTp_ICP4。

[0043] 本发明的目的及解决其技术问题还采用以下技术措施进一步实现。

[0044] 前述的重组单纯疱疹病毒的制备方法，其中先剔除该含有ICP4基因的单纯疱疹病毒的ICP34.5基因和ICP47基因中的一种或两种，再以人端粒酶逆转录酶启动子hTERTp替换ICP4基因启动子；或在以人端粒酶逆转录酶启动子hTERTp替换ICP4基因启动子得到该重组单纯疱疹病毒HSV-hTERTp_ICP4后，再剔除该重组单纯疱疹病毒HSV-hTERTp_ICP4的ICP34.5基因和ICP47基因中的一种或两种。

[0045] 前述的重组单纯疱疹病毒的制备方法，其中以其它肿瘤特异性启动子替代该人端粒酶逆转录酶启动子hTERTp。

[0046] 前述的重组单纯疱疹病毒的制备方法，其中该方法还包括对所有涉及的质粒进行测序以证实无突变发生的步骤。

[0047] 前述的重组单纯疱疹病毒的制备方法，其中该绿色荧光蛋白表达盒可由青色荧光蛋白表达盒、红色荧光蛋白表达盒、黄色荧光蛋白表达盒或其它指示蛋白表达盒所替换。

[0048] 本发明的目的及解决其技术问题还采用以下技术方案来实现。依据本发明提出的药物组合物，其中该药物组合物包含前述的重组单纯疱疹病毒，以及药物可接受的载体或赋形剂。

[0049] 本发明的目的及解决其技术问题还采用以下技术措施进一步实现。

[0050] 前述的药物组合物，其中该药物组合物为注射液，所述注射液包括药学上可接受的载体以及前述的重组单纯疱疹病毒，每毫升所述注射液中含有102～1010个该重组单纯疱疹病毒。

[0051] 前述的药物组合物，其中该药学上可接受的载体为pH值为4.0～9.0的磷酸缓冲液。

[0052] 前述的药物组合物，其中该注射液还含有保护剂和/或渗透压调节剂；以该注射液为基准，所述保护剂的含量为0.01～30％(重量)，所述保护剂选自肌醇、山梨醇和蔗糖中的一种或一种以上；每千克该注射液含有200～700毫克所述渗透压调节剂，所述渗透压调节剂为氯化钠和/或氯化钾。

[0053] 本发明的目的及解决其技术问题还采用以下技术方案来实现。依据本发明提出的前述的重组单纯疱疹病毒，或前述的药物组合物在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

[0054] 本发明的目的及解决其技术问题还采用以下技术方案来实现。依据本发明提出的另一种重组单纯疱疹病毒，其是在前述的重组单纯疱疹病毒基因组中插入荧光蛋白表达盒。

[0055] 本发明的目的及解决其技术问题还采用以下技术措施进一步实现。

[0056] 前述的另一种重组单纯疱疹病毒，其中该荧光蛋白表达盒为绿色荧光蛋白表达盒、青色荧光蛋白表达盒、红色荧光蛋白表达盒、黄色荧光蛋白表达盒及其它指示蛋白表达盒中任一种。

[0057] 本发明的目的及解决其技术问题还采用以下技术方案来实现。依据本发明提出的前述的另一种重组单纯疱疹病毒在制备诊断肿瘤的药物中的应用。

[0058] 本发明的目的及解决其技术问题还采用以下技术方案来实现。依据本发明提出的一种肿瘤诊断试剂盒，其中该肿瘤诊断试剂盒包含前述的另一种重组单纯疱疹病毒。

[0059] 本发明的目的及解决其技术问题还采用以下技术措施进一步实现。

[0060] 前述的肿瘤诊断试剂盒，其特征在于该肿瘤诊断试剂盒检测的样品选自受试者全血、血浆、淋巴细胞悬浮液、骨髓、胸腔积液或腹腔积液。

[0061] 前述的肿瘤诊断试剂盒，其特征在于该肿瘤诊断试剂盒还包括：RPMI-1640培养基、pH为7的红细胞裂解液和pH为7.2～7.4的磷酸缓冲液，其中，所述红细胞裂解液包含0.15M氯化铵、10nM碳酸氢钾和1nM乙二胺四乙酸；或RPMI-1640培养基、比重为1.077～
0.001千克/升的聚蔗糖-泛影葡胺和pH为7.2～7.4的磷酸缓冲液。

[0062] 本发明与现有技术相比具有明显的优点和有益效果。借由上述技术方案，本发明重组单纯疱疹病毒、其制备方法及应用可达到相当的技术进步性及实用性，并具有产业上的广泛利用价值，其至少具有下列优点：

[0063] (1)本发明的重组单纯疱疹病毒相对于现有的疱疹病毒而言，能更有效地选择性地在人肿瘤细胞内生长繁殖，而不在人正常细胞中繁殖，从而更有效地杀伤癌细胞，保护正常细胞；

[0064] (2)本发明的另一种重组单纯疱疹病毒，其是在前一种重组单纯疱疹病毒基因组中插入了荧光蛋白表达盒，其能在肿瘤细胞内发光，所以可更快速、准确、灵敏并广谱地实现肿瘤的早期诊断以及肿瘤转移的诊断。

[0065] 本发明获得的重组单纯疱疹病毒的分类命名为I型单纯疱疹病毒，拉丁文学名为Herpes Simplex Virus Type 1，于2012年8月14日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.6397。被保藏的生物材料oHSV1-hTERTp_ICP4株，其株号的含义为：oHSV1指I型单纯疱疹病毒17+株(HSV1)；hTERTp_ICP4指以人端粒酶逆转录酶启动子hTERTp替换ICP4基因启动子。

[0066] 上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其他目的、特征和优点能够更明显易懂，以下特举较佳实施例，并配合附图，详细说明如下。

附图说明

[0067] 图1为本发明实施例1将野生型单纯疱疹病毒17+毒株的基因组中的ICP4基因启动子替换为人端粒酶逆转录酶启动子hTERTp的方法步骤示意图。

[0068] 图2显示实施例1制备的重组单纯疱疹病毒oHSV1-hTERTp_ICP4与野生型单纯疱疹病毒(17+)感染正常细胞(人成纤维细胞)的对比实验结果。

[0069] 图3显示实施例2制备的重组单纯疱疹病毒oHSV1-d34.5-d47-hTERTp_ICP4与现有技术中只剔除了野生型单纯疱疹病毒基因组的ICP34.5基因和ICP47基因的病毒(oHSV1-d34.5-d47)感染正常人白细胞的对比实验结果

[0070] 图4A-图4F显示重组单纯疱疹病毒oHSV1-hTERTp_ICP4对肝癌、肺癌、头颈鳞癌、黑色素瘤、结肠癌和前列腺癌的杀伤作用试验结果(MOI＝1)。

具体实施方式

[0071] 为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及较佳实施例，对依据本发明提出的重组单纯疱疹病毒、其制备方法及应用其具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如后。

[0072] 本发明提供了一种重组单纯疱疹病毒，其中，该重组疱疹病毒是将含有ICP4基因的单纯疱疹病毒基因组中的ICP4基因启动子替换为人端粒酶逆转录酶启动子hTERTp或其它肿瘤特异性启动子。该含有ICP4基因的单纯疱疹病毒可为野生型单纯疱疹病毒、剔除了野生型单纯疱疹病毒基因组中任何基因片段(除了ICP4基因和ICP4基因启动子)的病毒，但不局限于此，可为本领域技术人员利用常规技术对其进行变化所得的任何含有ICP4基因的单纯疱疹病毒。

[0073] 更具体地，本发明提供了一种重组单纯疱疹病毒，其微生物保藏号为CGMCC No.6397。

[0074] 优选地，该单纯疱疹病毒剔除了ICP34.5基因和ICP47基因中的一种或两种，剔除ICP34.5基因(神经毒基因)，可使溶瘤病毒更安全；而剔除ICP47基因，以促进免疫应答及增强溶瘤活性。优选剔除ICP34.5和ICP47两种基因。

[0075] 本发明还提供了一种制备所述重组单纯疱疹病毒的方法，其中该方法包括以下步骤：用人端粒酶逆转录酶启动子hTERTp取代含有ICP4基因的单纯疱疹病毒基因组中的ICP4基因启动子，构建该重组单纯疱疹病毒HSV-hTERTp_ICP4：

[0076] (1)构建穿梭质粒pICP4del-hTERTp_ICP4和pICP4del-eGFP：

[0077] a.用BHK细胞培养该含有ICP4基因的单纯疱疹病毒，并纯化其基因组DNA；

[0078] b.扩增ICP4基因上游(US)侧翼序列(FlankingRegion，简称FLR)：以步骤a中所得病毒基因组DNA为模板，用以下ICP4USf正向引物和ICP4USr反向引物：

[0079] ICP4USf正向引物：CCCTCCAGACGCACCGGAGTCGGGGG

[0080] ICP4USr反向引物：AAGTCGACTCTAGAGGATCGATCTCTGACCTGAGATTGGCGGCACTGAGGTA[0081] 扩增出ICP4基因上游侧翼序列；

[0082] 扩增ICP4基因下游(DS)侧翼序列：以步骤a中所得病毒基因组DNA为模板，用以下ICP4DSf正向引物和ICP4USr反向引物：

[0083] ICP4DSf正向引物：AAAAGTCGACCTGCAGGCATGCTAACGAGGAACGGGCAGGGGGC[0084] ICP4DSr反向引物：AAAAAAGCTTGCATGCCCACGTGCGCGGGGCCAGACGGGCT[0085] 扩增出ICP4基因下游侧翼序列；

[0086] 将上下游侧翼序列克隆到pSP73质粒上，构建pICP4del及pICP4del-eGFP质粒：将SalI酶切的前述扩增出的ICP4基因的上游侧翼序列及SalI/HindIII双酶切的前述扩增出的ICP4基因的下游侧翼序列混合并连接到pSP73的EcoRV/HindIII位点，得到pICP4del；用EcoRI/XhoI从pcDNA3.1-eGFP切下CMV启动子控制的eGFP表达盒，经T4 DNA聚合酶补平末端后插入到pICP4del的EcoRV位点，得到pICP4del-eGFP；

[0087] c.分三次PCR扩增出ICP4基因中三段序列：首先，使用以下引物：

[0088] ICP4-1st正向引物：TTTTTTGAATTCATGGCGTCGGAGAACAAGCAGCGCC

[0089] ICP4-1st反向引物：TGGAGCCACCCCATGGCCTCCGCGT

[0090] ICP4-2nd正向引物：CGACGCCGCGCAGCAGTACGCCCTG

[0091] ICP4-2nd反向引物：CGGCGGGGGCGGGCCCGGCGCACCG

[0092] ICP4-3rd正向引物：CCTCATGTTTGACCCGCGGGCCCTG

[0093] ICP4-3rd反向引物：TTTTTTCTCGAGTTACAGCACCCCGTCCCCCTCGAAC

[0094] 以步骤a中所得病毒基因组DNA为模板，分别扩增出三段基因片段ICP4-1st、ICP4-2nd和ICP4-3rd，而后分别将该三段基因片段插入pSP73质粒的EcoRV位点构建出以下三种质粒：pSP73-ICP4-1st、pSP73-ICP4-2nd、pSP73-ICP4-3rd，从该三种质粒中用EcoRI和BsrGI剪切出ICP4-1st、用BsrGI和PvuI剪切出ICP4-2nd及用PvuI和XhoI剪切出ICP-3rd待用；

[0095] d.从含人端粒酶逆转录酶启动子hTERTp的质粒中用NruI和HindIII切下hTERTp片段，取代从pcDNA3-NHN上用NruI和HindIII切除的CMV启动子，得到质粒pcDNA3-NHN-hTERTp，其中，pcDNA3-NHN是在pcDNA3的NheI位点插入NheI-HapI-NheI酶切位点序列所得；

[0096] e.将步骤c中的该ICP4-1st、ICP4-2nd和ICP4-3rd混合并连接到步骤d中的该pcDNA3-NHN-hTERTp的EcoRI及XhoI位点(该三种基因片段ICP4-1st、ICP4-2nd和ICP4-3rd的连接次序是由其端位序列与该pcDNA3-NHN-hTERTp的EcoRI及XhoI位点的序列所决定的，其可自动进行匹配连接)，得到质粒pcDNA3-NHN-hTERTp_ICP4；

[0097] f.用SalI酶切步骤b中含ICP4基因上下游侧翼序列的质粒pICP4del，并补平末端待用，用PmeI和HpaI从步骤e获得的该质粒pcDNA3-NHN-hTERTp_ICP4剪切出hTERTp_ICP4表达盒片段，并将其与该酶切后待用的pICP4del质粒连接，构建出质粒pICP4del-hTERTp_ICP4；

[0098] g.构建BHK-ICP4辅助细胞：用EcoRI和XhoI从步骤e获得的该质粒pcDNA3-NHN-hTERTp_ICP4中酶切出ICP4基因，并克隆到pcDNA3中CMV启动子的下游EcoRI和XhoI位点，得到pcDNA3-CMV-ICP4质粒；将该pcDNA3-CMV-ICP4质粒转染BHK细胞，该pcDNA3-CMV-ICP4质粒DNA可重组到BHK细胞基因组中，使有些BHK重组细胞获得对新霉素的抗性和表达ICP4，用抗菌素G418杀死未重组的BHK细胞，经过几轮的亚克隆筛选，用RT-PCR方法筛选出表达ICP4的BHK-ICP4辅助细胞；

[0099] (2)剔除基因组中ICP4基因启动子并插入端粒酶逆转录酶启动子hTERTp启动子：

[0100] A.用BHK细胞培养该含有ICP4基因的单纯疱疹病毒，并提取病毒基因组DNA；

[0101] B.将步骤A中该病毒基因组DNA与步骤(1)b中该质粒pICP4del-eGFP共转入步骤(1)g中该BHK-ICP4辅助细胞内，经同源重组，该质粒pICP4del-eGFP中绿色荧光蛋白表达盒GFP置换了该含有ICP4基因的单纯疱疹病毒HSV的ICP4基因，使得重组病毒的毒斑发绿色荧光，经过几轮的噬斑纯化，挑选绿色荧光毒斑，就能纯化出重组病毒HSV-d4GFP(d4表示剔除ICP4基因)；

[0102] C、培养步骤B中该HSV-d4GFP病毒，并提取基因组DNA；

[0103] D、将步骤C该重组病毒HSV-d4GFP的基因组DNA和步骤(1)f该质粒pICP4del-hTERTp_ICP4的DNA共转入该BHK-ICP4辅助细胞，经同源重组，hTERTp_ICP4表达盒置换了该重组病毒HSV-d4GFP的绿色荧光蛋白表达盒GFP，使新重组病毒的毒斑不发绿色荧光，经过几轮的噬斑纯化，挑选无荧光毒斑，就能纯化出该重组单纯疱疹病毒HSV-hTERTp_ICP4。

[0104] 同理，所述重组单纯疱疹病毒的制备方法，其中，可先剔除该含有ICP4基因的单纯疱疹病毒的ICP34.5基因和ICP47基因中的一种或两种，再以人端粒酶逆转录酶启动子hTERTp替换ICP4基因启动子；或在以人端粒酶逆转录酶启动子hTERTp替换ICP4基因启动子得到该重组单纯疱疹病毒HSV-hTERTp_ICP4后，再剔除该重组单纯疱疹病毒HSV-hTERTp_ICP4的ICP34.5基因和ICP47基因中的一种或两种。

[0105] 所述的重组单纯疱疹病毒的制备方法，其中可以其它肿瘤特异性启动子替代该人端粒酶逆转录酶启动子hTERTp，来替换该含有ICP4基因的单纯疱疹病毒中的ICP4基因启动子，完成基因重组。

[0106] 优选地，上述重组单纯疱疹病毒的制备方法还包括对所有涉及的质粒进行测序以证实无突变发生的步骤。对于质粒序列的监控，可以保证整个制备过程的准确性。

[0107] 另外，所述重组单纯疱疹病毒的制备方法中，不局限于只使用绿色荧光蛋白表达盒，还可由青色荧光蛋白表达盒、红色荧光蛋白表达盒、黄色荧光蛋白表达盒及其它指示蛋白表达盒中任一种所替换。

[0108] 本发明还提供了一种药物组合物，其中，该药物组合物前述的重组疱疹病毒，以及药物可接受的载体或赋形剂。优选该药物组合物为注射液，该注射液包括药学上可接受的载体以及前述的重组单纯疱疹病毒，每毫升所述注射液中含有102～1010个该重组单纯疱疹病毒。较优地，其中该药学上可接受的载体为pH值为4.0～9.0的磷酸缓冲液。另外，较优地，该注射液还含有保护剂和/或渗透压调节剂；以该注射液为基准，所述保护剂的含量为0.01～30％(重量)，所述保护剂选自肌醇、山梨醇和蔗糖中的一种或一种以上；每千克该注射液含有200～700毫克所述渗透压调节剂，所述渗透压调节剂为氯化钠和/或氯化钾。

[0109] 上述单纯疱疹病毒与药物组合物可用于制备治疗肿瘤的药物。

[0110] 另外，本发明还提供了另一种重组单纯疱疹病毒，其是在前述重组单纯疱疹病毒基因组中插入荧光蛋白表达盒，该荧光蛋白表达盒可为绿色荧光蛋白表达盒、青色荧光蛋白表达盒、红色荧光蛋白表达盒、黄色荧光蛋白表达盒及其它荧光蛋白表达盒中任一种；由于该荧光蛋白表达盒能在肿瘤细胞内发光，所以可以实现更快速、准确、灵敏并广谱地实现肿瘤的早期诊断以及肿瘤转移的诊断。

[0111] 基于上述在前述重组单纯疱疹病毒基因组中插入荧光蛋白表达盒的另一种重组单纯疱疹病毒，本发明提供了一种肿瘤诊断试剂盒，该肿瘤诊断试剂盒包括前述另一种重组单纯疱疹病毒，该肿瘤诊断试剂盒检测的样品选自受试者全血、血浆、淋巴细胞悬浮液、骨髓、胸腔积液和腹腔积液，该肿瘤诊断试剂盒还包括：RPMI-1640培养基、pH为7的红细胞裂解液和pH为7.2～7.4的磷酸缓冲液，其中，所述红细胞裂解液包含0.15M氯化铵、10nM碳酸氢钾和1nM乙二胺四乙酸；或RPMI-1640培养基、比重为1.077～0.001千克/升的聚蔗糖-泛影葡胺和pH为7.2～7.4的磷酸缓冲液。对于该肿瘤诊断试剂盒的使用方法可采用中国发明专利CN102220292A(公开日：2011年10月19日)中公开的方法。

[0112] 下面结合实施例进一步说明本发明。

[0113] 以下实施例选用I型单纯疱疹病毒毒株常用标准毒株：17+株(Genebank JN555585.1)，为从英国HPA(Health Protection Agency)公司购买。17+株全基因序列已知。如无特别说明，所用酶及质粒均为购买所得。

[0114] 实施例1

[0115] 本实施例为将野生型单纯疱疹病毒17+毒株的基因组中的ICP4基因启动子替换为人端粒酶逆转录酶启动子hTERTp，请参阅图1，步骤为：

[0116] (1)构建穿梭质粒pICP4del-hTERTp_ICP4和pICP4del-eGFP：

[0117] a.用BHK(地鼠肾)细胞(购自ATCC)培养该野生型单纯疱疹病毒17+毒株，并纯化其基因组DNA。

[0118] b.扩增ICP4基因上游侧翼序列：以步骤a中所得17+病毒基因组DNA为模板，用ICP4USf(正向引物：CCCTCCAGACGCACCGGAGTCGGGGG)和ICP4USr(反向引物：AAGTCGACTCTAGAGGATCGATCTCTGACCTGAGATTGGCGGCACTGAGGTA)扩增出ICP4基因上游侧翼序列；

[0119] 扩增ICP4基因下游侧翼序列：以步骤a中所得17+病毒基因组DNA为模板，用ICP4DSf(正向引物：AAAAGTCGACCTGCAGGCATGCTAACGAGGAACGGGCAGGGGGC)和ICP4DSr(反向引物：AAAAAAGCTTGCATGCCCACGTGCGCGGGGCCAGACGGGCT)扩增出ICP4基因下游侧翼序列；

[0120] 将上下游侧翼序列克隆到pSP73质粒(从Promega公司购得)上，构建pICP4del及pICP4del-eGFP质粒：将SalI酶切的前述扩增出的ICP4基因的上游侧翼序列及SalI/HindIII双酶切的前述扩增出的ICP4基因的下游侧翼序列混合并连接到pSP73的EcoRV/HindIII位点，得到pICP4del。序列分析证实该pICP4del质粒无突变。用EcoRI/XhoI从pcDNA3.1-eGFP(从YRGENE购得，北京)切下CMV启动子(巨细胞病毒早期启动子)控制的eGFP表达盒，经T4DNA聚合酶补平末端后插入到pICP4del的EcoRV位点，得到pICP4del-eGFP；

[0121] 表1

[0122]

[0123] c.分三次PCR扩增出ICP4基因中三段序列：首先，使用表1所示的引物，以步骤a中所得17+病毒基因组DNA为模板，分别扩增出三段基因片段ICP4-1st、ICP4-2nd和ICP4-3rd，而后分别将该三段基因片段插入pSP73的EcoRV位点构建出以下三种质粒：pSP73-ICP4-1st、nd rdpSP73-ICP4-2 、pSP73-ICP4-3 。在证实序列无突变后，从该三种质粒中用EcoRI和BsrGI剪切出ICP4-1st、用BsrGI和PvuI剪切出ICP4-2nd及用PvuI和XhoI剪切出ICP-3rd待用；

[0124] d.从含人端粒酶逆转录酶启动子hTERTp的质粒中用NruI和HindIII切下hTERTp片段，取代从pcDNA3-NHN(pcDNA3从Invitrogen公司购得，在pcDNA3的NheI位点插入NheI-HapI-NheI酶切位点序列，构建成pcDNA3-NHN)上用NruI和HindIII切除的CMV启动子，得到质粒pcDNA3-NHN-hTERTp；

[0125] e.将步骤c中的该ICP4-1st、ICP4-2nd和ICP4-3rd混合并连接到步骤d中的该pcDNA3-NHN-hTERTp的EcoRI及XhoI位点，得到质粒pcDNA3-NHN-hTERTp_ICP4；

[0126] f.用SalI酶切含ICP4基因上下游侧翼序列的质粒pICP4del，并补平末端待用，用PmeI和HpaI从步骤e获得的该质粒pcDNA3-NHN-hTERTp_ICP4剪切出hTERTp_ICP4表达盒片段，并将其与该酶切后待用的pICP4del载体连接，构建出质粒pICP4del-hTERTp_ICP4。

[0127] g.构建BHK-ICP4辅助细胞：用EcoRI和XhoI从步骤e获得的该质粒pcDNA3-NHN-hTERTp_ICP4中酶切出ICP4基因，并克隆到pcDNA3中CMV启动的下游EcoRI和XhoI位点，得到pcDNA3-CMV-ICP4质粒；将该pcDNA3-CMV-ICP4质粒转染BHK细胞，该pcDNA3-CMV-ICP4质粒DNA可重组到BHK细胞基因组中，使有些BHK重组细胞获得对新霉素(neomycin)的抗性和表达ICP4。用抗菌素G418杀死未重组的BHK细胞。经过几轮的亚克隆筛选，用RT-PCR方法筛选到表达ICP4的BHK-ICP4辅助细胞。

[0128] (2)剔除基因组中ICP4基因启动子并插入端粒酶逆转录酶启动子hTERTp启动子：

[0129] A.用BHK细胞培养该野生型单纯疱疹病毒17+，并提取病毒基因组DNA；

[0130] B.将步骤A中该病毒基因组DNA与步骤(1)b中该质粒pICP4del-eGFP共转入步骤(1)g中该BHK-ICP4辅助细胞内，经同源重组，该质粒pICP4del-eGFP中绿色荧光蛋白表达盒置换了该含有ICP4基因的单纯疱疹病毒HSV的ICP4基因，使得重组病毒的毒斑发绿色荧光，经过几轮的噬斑纯化，挑选绿色荧光毒斑，就能纯化出重组病毒oHSV1-d4GFP；

[0131] C、培养步骤B中该oHSV1-d4GFP病毒，并提取基因组DNA；

[0132] D、将步骤C该重组病毒oHSV1-d4GFP的基因组DNA和步骤f该质粒pICP4del-hTERTp_ICP4的DNA共转入BHK-ICP4辅助细胞，经同源重组，hTERTp_ICP4表达盒置换了该重组病毒oHSV1-d4GFP的绿色荧光蛋白表达盒GFP，使新重组病毒的毒斑不发绿色荧光，经过几轮的噬斑纯化，挑选无荧光毒斑，就能纯化出该重组单纯疱疹病毒oHSV1-hTERTp_ICP4。

[0133] 所有质粒均经序列分析证实无突变。

[0134] 图2为实施例1制备的该重组单纯疱疹病毒oHSV1-hTERTp_ICP4与野生型单纯疱疹病毒(17+)感染正常细胞(人成纤维细胞)的对比实验结果，在相同感染条件下(用1个病毒感染1个细胞，即MOI＝1，感染24或48小时)，通过该两种病毒对正常细胞(人成纤维细胞)杀伤作用的比较可知，野生型单纯疱疹病毒17+引起了严重的细胞病变并杀死正常细胞(人成纤维细胞)，而该重组单纯疱疹病毒oHSV1-hTERTp_ICP4则对正常细胞无影响。

[0135] 实施例2

[0136] 本实施例与实施例1相似，不同之处为本实施例是将剔除了ICP47基因与ICP34.5基因的野生型单纯疱疹病毒的基因组中的ICP4基因启动子替换为人端粒酶逆转录酶启动子hTERTp，具体步骤如下：

[0137] (1)提取17+病毒的基因组DNA：用BHK(地鼠肾)细胞培养17+病毒并提取基因组DNA。

[0138] (2)剔除ICP47基因，构建重组病毒oHSV1-d47

[0139] a.扩增ICP47基因上游侧翼序列：以步骤(1)中所得17+病毒基因组DNA为模板，用ICP47USf(正向引物：AAAAGAATTCGATTGGGTTCGATTGGCAATGTTGTCTC)和ICP47USr(反向引物：AAAAACTAGTGATGTCCCGGGTACGACCATCACCCGAG)扩增出ICP47 US FLR。

[0140] b.扩增出ICP47基因下游FLR：以步骤(1)中所得17+病毒基因组DNA为模板，用ICP47DSf(正向引物：AAAAAAGCTTCACGACATGCTCCCCCCCGACGAGC)和ICP47DSr(反向引物：AAAACAGCTGACGCGGAACTAGCGCGGACCGGTCG)扩增出ICP47 DS FLR。

[0141] c.将上下游侧翼序列克隆到pBSK(从Stratagene公司购买)质粒上，构建pdICP47及pdICP47-eGFP质粒：将EcoRI/SpeI双酶切的前述扩增出的ICP47基因的上游侧翼序列、HindIII/SalI双酶切的前述扩增出的ICP47基因的下游侧翼序列及互补的具有Spel/HindIII双酶切位点的连接序列(Linker1 CTAGTGAATTCTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGATATCA；Linker 2 AGCTTGATATCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGAATTCA)进行混合并连接到pBSK的EcoRI/SalI位点，得到pdICP47。用EcoRI/XhoI从pcDNA3.1-EGFP(从YRGENE购得，北京)切下CMV启动子控制的eGFP表达盒，经T4 DNA聚合酶补平末端后插入到pdICP47的EcoRV位点，得到pdICP47-eGFP。

[0142] d.将步骤(1)中所得17+病毒的基因组DNA与pdICP47-eGFP共转染BHK细胞。同源重组后，经过几轮的噬斑纯化，挑选绿色荧光毒斑，就能得到纯的重组病毒oHSV1-d47-GFP。以同样的方法用pdICP47剔除oHSV1-d47-GFP中GFP表达盒，得到oHSV1-d47。

[0143] (3)剔除ICP34.5基因，构建重组病毒oHSV1-d34.5-d47

[0144] A.提取17+病毒的基因组DNA：用BHK细胞培养oHSV1-d47病毒并提取基因组DNA。

[0145] B.扩增ICP34.5基因上游侧翼序列：以步骤(1)所得17+病毒基因组DNA为模板，用ICP34.5USf(正向引物：CTCTGACCTGAGATTGGCGGCACTG)和ICP34.5USr(反向引物：GCGGCCGCAGCGCTGCGGCCGCCGCGGGCGCGCTCCTGACCGCGGG)扩增出ICP34.5US FLR。

[0146] C.扩增ICP34.5基因下游侧翼序列：以步骤(1)所得17+病毒基因组DNA为模板，用ICP34.5DSf(正向引物：GCGGCCGCAGCGCTGCGGCCGCCAGCGCGG CGGGGCCCGGCCAACCA)和ICP34.5DSr(反向引物：TTCTTCCCTCTTCTCCCGCCCTCCA)扩增出ICP34.5下游侧翼序列。

[0147] D.将上下游侧翼序列克隆到pSP72(从Promega购得)质粒上，构建pdICP34.5及pdICP34.5-eGFP质粒：用重叠聚合酶链反应(overlapping PCR)连接ICP34.5上下游侧翼序列，并与用BamHI/Xhol双切并补平的pSP72载体连接，得到pdICP34.5。用EcoRI/XhoI从pcDNA3.1-eGFP切下eGFP表达盒，经T4 DNA聚合酶补平末端后插入到pdICP34.5的AfeI位点，得到pdICP34.5-eGFP。

[0148] E.将步骤(2)所得oHSV1-d47基因组DNA与步骤D所得pdICP34.5-eGFP共转染BHK细胞。同源重组后，经过几轮的噬斑纯化，挑选绿色荧光毒斑，就能得到纯的重组病毒oHSV1-d47-d34.5-GFP。以同样的方法用pdICP34.5剔除oHSV1-d47-d34.5-GFP中GFP表达盒，得到oHSV1-d34.5-d47。

[0149] 之后采用实施例1的方法，用人端粒酶逆转录酶启动子hTERTp取代前述得到的oHSV1-d34.5-d47的ICP4基因启动子，构建重组单纯疱疹病毒oHSV1-d34.5-d47-hTERTp_ICP4。当然，在本实施例中，也可采用现有技术中已知的方法对ICP47基因和ICP34.5基因进行剔除。

[0150] 本实施例中，所有质粒均经序列分析证实无突变。

[0151] 在另一实施例中，也可在实施例1所得该重组单纯疱疹病毒oHSV1-hTERTp_ICP4后，再对其ICP47基因和ICP34.5基因进行剔除。剔除ICP47基因和ICP34.5基因的方法可为实施例2中方法，也可采用现有技术中的其它方法。

[0152] 图3为实施例2制备的该重组单纯疱疹病毒oHSV1-d34.5-d47-hTERTp_ICP4与现有技术中只剔除了野生型单纯疱疹病毒基因组的ICP34.5基因和ICP47基因的病毒(oHSV1-d34.5-d47)感染正常人白细胞的对比实验结果，在相同感染条件下(用1个病毒感染1个细胞，即MOI＝1，感染24小时)，流式检测发现oHSV1-d34.5-d47能感染白细胞(检测值为0.8％)，而该重组单纯疱疹病毒oHSV1-d34.5-d47-hTERTp_ICP4则不感染白细胞(检测值为
0.0％)，由此说明后者临床使用更安全。

[0153] 图4A-图4F为该重组单纯疱疹病毒oHSV1-hTERTp_ICP4对肝癌、肺癌、头颈鳞癌、黑色素瘤、结肠癌和前列腺癌的杀伤作用试验结果(MOI＝1)，其中对照组为野生型单纯疱疹病毒。由该实验结果可知，本发明的重组单纯疱疹病毒oHSV1-hTERTp_ICP4能够杀伤多种肿瘤细胞，具有广谱的抗肿瘤作用。

[0154] 虽然前述两个实施例是以I型单纯疱疹病毒毒株17+株为例，但本发明不局限于17+株，同样也适用于I型单纯疱疹病毒毒株F株、KOS株、JS1株和BLI株等，另外，同样适用于II型单纯疱疹病毒，如HG52株，即适用于含有ICP4基因的任一单纯疱疹病毒。

[0155] 需要说明的是，虽然前述实施例是将单纯疱疹病毒的基因组中的ICP4基因启动子替换为人端粒酶逆转录酶启动子hTERTp，但本发明的范围不局限于人端粒酶逆转录酶启动子hTERTp，其可将含有ICP4基因的单纯疱疹病毒基因组的ICP4启动子替换为本领域技术人员所知悉的其它肿瘤特异性启动子，如：存活素(survivin)启动子、前列腺特异性抗原(PSA)启动子、肝癌细胞特有的甲胎球蛋白(AFP)启动子、上皮细胞肿瘤的癌胚抗原(CEA)启动子等。

[0156] 以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。