一种启动子及其应用

摘要

本发明提供一种损伤诱导型启动子，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1。该启动子可以用来构建真核表达载体，用于在植物中表达外源基因。本发明对烟草高效诱导型启动子的分离鉴定，能够为烟草生物反应器的研发提供实验和技术支撑。利用高效诱导型启动子，以烟草作为生物反应器，表达疫苗、抗体及其他药用蛋白等，可突破传统农业范畴，延伸到医学领域。

权利要求

1.一种启动子，其特征在于，所述的启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

2.权利要求1所述的启动子在制备真核表达载体中的应用。

3.一种真核表达载体，所述的真核表达载体的启动子为权利要求1所述的启动子。

4.一种在植物中表达外源基因的方法，是将外源目的基因导入权利要求3所述的真核表达载体，转化植物，并通过机械损伤方式来诱导外源基因的表达；其中所述的植物为烟草。

说明书

一种启动子及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于基因工程领域，具体涉及一种启动子及其应用，即一种植物启动子，在损伤胁迫下能够启动调控基因的表达。

背景技术

[0002] 在基因工程研究中，使外源目的基因在受体生物中表达，以提高作物对干旱、盐、碱以及病虫害等环境胁迫的抗性，或提高作物品质及改良作物农艺性状等，已成为目前作物品种改良的一种重要手段。近年来，有关启动子的分离和研究成为国内外研究的热点之一。基因工程的发展为作物抗病虫害研究以及植物生物反应器的研究作出了巨大的贡献。但是，如何控制外源基因定时定量地高效表达，是限制基因工程技术在作物遗传改良方面有效应用的重要因素。除了寻找有效的目的基因之外，寻找有效控制外源基因表达的启动子成为基因工程改良中需要解决的重要问题。使用组成型启动子驱使外源基因表达，不仅造成资源浪费， 还直接影响植株的生长发育及正常的生理代谢，而使用诱导型启动子，不仅不会造成各种资源的浪费，又能增强植物体对外界的抗性，减少对植物生长发育及其他代谢途径的影响 (朱丽萍等, 2010, 遗传 32, 229-234)。因此，研究和利用诱导型启动子，对于研究植物响应各种胁迫的生理机理以及研究农作物的抗逆基因工程都有重要的意义，在基础研究和植物生物技术方面也有着广阔的应用前景。

[0003] 启动子根据其功能和作用方式大致分为组成型启动子、组织特异性启动子和诱导型启动子三种。组成型启动子在所有器官和组织中都能启动基因的持续表达，不具备时空特异性。目前植物中应用最广泛的是来自花椰菜花叶病毒(CaMV)35S 启动子，最新发现的一个组成型启动子是来自冰叶日中花的多聚泛素McUBI1 基因启动子，其在瞬时表达分析中比35S 启动子还要稳定。其它的还有玉米泛素Ubiquitin启动子 (Streatfield等,2004, Transgenic Res 13, 299-312)、水稻RuBQ2 启动子 (Wang等, 2003, Plant Cell Rep 22, 129-134)、水稻SUIⅠ启动子(魏晶等, 2012,华中农业大学学报31, 139-146)等。该类启动子活性较高，但由于其导致外源基因在转基因植物整个生长时期的不同部位表达，影响植物的生长发育和正常生理代谢，有些产物可能造成毒害作用，不利于品质和产量的提高，甚至会导致植物的死亡。因此，为了更好地调控植物基因的表达，特异型启动子和诱导型启动子的研究和应用越来越受到人们重视。

[0004] 组织特异型启动子是指基因只在某些特定的器官或组织中表达，往往具有发育调节的特征，启动区内含有种类、数量不同的顺式作用元件。目前对特异型启动子的分离和研究很广泛，如烟草根特异性TobRB7 启动子(曲波等, 2008, 吉林农业科技学院学报17,9-15)、烟草花药特异性TA29 启动子(黄海泉等, 2012, 江苏农业科学40, 26-28)、烟草叶片特异性rbcS 启动子(孙家利等, 2010, 中国烟草学报16, 80-85)、玉米叶片特异性 PPCA1 启动子(Gowik等, 2004, Plant Cell 16, 1077-1090)、草莓果实特异性GalUR 启动子(Agius等, 2005, J Exp Bot 56, 37-46)等。该类启动子的深入研究有助于阐明植物生长发育和生理代谢的基础理论，而且具有广泛的应用价值。

[0005] 诱导型启动子是指正常状态下不表达或低表达，受到某些物理或化学信号的刺激，可以大幅度地提高基因的表达水平一类启动子。根据诱导因素，诱导型启动子可分为光诱导型启动子、温度诱导型启动子、损伤诱导型启动子、激素诱导型启动子和真菌诱导型启动子等。其特点是：受到物理或化学因素的诱导；含有多种功能元件，协同增强或降低启动子的活性；部分诱导型启动子同时具有组织特异性启动子的特点。Kasuga 等利用诱导型rd29A 启动子代替CaMV35S 启动子转化拟南芥， 提高了转基因拟南芥的抗旱性，同时减少了组成型过表达造成的植株生长停滞或矮化现象的发生(Narusaka等, 2003, Plant J 34, 137-148)。其他诱导型启动子如水稻质膜CaATPase 启动子受干旱、寒冷、茉莉酸甲酯以及脱落酸的诱导(Huda等, 2013, PLoS One 8)， 辽宁碱蓬甜菜BADH 启动子也是盐诱导性启动子(李秋莉等, 2006, 生物工程学报22, 77-81)；拟南芥RBCS-1A启动子是光诱导型启动子，同时具有组织特异性(习雨琳等, 2012, 作物学报38, 1561-1569)；甘蓝型油菜MAPK7 基因家族及其启动子受高温、损伤及植物激素的诱导(朱斌等,作物学报, 2013)。对于诱导型启动子，目的基因只有在接受诱导信号后才会表达，不仅不会造成各种资源的浪费，又能增强植物体对外界的抗性， 减少对植物生长发育及其他代谢途径的影响。因此，研究和利用诱导型启动子，对于研究植物响应各种胁迫的生理机理以及研究农作物的抗逆基因工程都有重要的意义，在基础研究和植物生物技术方面也有着广阔的应用前景。然而到目前为止，有关烟草损伤诱导表达基因启动子的研究却仍显薄弱和滞后，这也在一定程度上制约了其功能解析与应用探索研究。

发明内容

[0006] 本发明的目的是提供一种启动子及其应用，即一种来源于烟草的，并能在植物中高度表达的损伤诱导型启动子。

[0007] 本发明的一个目的是提供一种损伤诱导型启动子，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

[0008] 本发明的第二个目的是提供一种用于植物转化的损伤诱导型启动子真核表达载体，该载体的启动子是核苷酸序列为SEQ ID NO:1的启动子；该表达载体可使外源目的基因的高效表达。

[0009] 本发明进一步提供了一种在植物中表达外源基因的方法，是用上述重组表达载体，将外源目的基因导入该载体，转化植物，获得的转化植物通过机械损伤可以诱导外源基因的表达。

[0010] 本发明对烟草高效诱导型启动子的分离鉴定，能够为烟草生物反应器的研发提供实验和技术支撑。利用高效诱导型启动子，以烟草作为生物反应器，表达疫苗、抗体及其他药用蛋白等，可突破传统农业范畴，延伸到医学领域。

附图说明

[0011] 图1：本发明的 NtLOX3启动子连接T载体质粒PCR鉴定电泳图；

[0012] 图2：本发明的NtLOX3启动子连接pCAMBIA1301质粒PCR电泳图；

[0013] 图3：本发明的NtLOX3启动子连接pCAMBIA1301酶切鉴定电泳图；

[0014] 图4：本发明的植物表达载体构建示意图；

[0015] 图5：本发明pCAMBIA1301：：NtLOX3-Promoter转化农杆菌PCR鉴定电泳图；

具体实施方式

[0016] 下面结合附图对本发明的方法进行详细的描述，但是以下描述的目的是示例性的，而不是限制本发明的范围。

[0017] 实施例1：烟草脂氧合酶基因NtLOX3启动子的分离

[0018] 1.1、烟草基因组DNA的制备

[0019] 取种植于温室两个月的烟草，取其嫩叶，采用CTAB法提取基因组DNA，经琼脂糖凝胶电泳检测后与-20℃进行保存。

[0020] 1.2 NtLOX3启动子的克隆和序列分析

[0021] 以烟草基因组DNA为模板，上游引物为：GGGGTACCGCCAGGTCTAAGGAAGG(SEQ ID NO：2)，下游引物为：GAAGATCTAATAATAATAGTTCTCTCTTCAATT (SEQ ID NO：3)，通过PCR扩增得到NtLOX3启动子候选区，PCR反应条件为：94℃预变性4min，94℃变性4min，49.3℃退火
45s，72℃延伸2min，共28个循环，4℃保存。将PCR产物连接到pEASY-T1载体，克隆并进行质粒PCR检测（质粒命名为pEASY-T1：：NtLOX3-Promoter）（图1），并测序获得长度为
1847bp的NtLOX3启动子，其序列为SEQ ID NO：1。然后使用PLACE软件（http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/）对启动子序列中的顺式作用元件进行预测分析，发现该启动子含有真核生物启动子的基本保守元件TATA-box和CAAT-box，还含有可能的损伤和MeJA应答元件GT-box(GTGTGCA)、CATG-box(CATG)和W-box(TCACC/T)元件等。并通过转基因试验表明损伤可以诱导该启动子的高水平活性。

[0022] 实施例2：植物损伤诱导型表达载体的构建

[0023] 将pCAMBIA1301载体用Kpn I/BglⅡ酶切后，回收大片段待用。将实施例1中的pEASY-T1：：NtLOX3-Promoter质粒经Kpn I/BglⅡ酶切后，回收长为1847bp的启动子目的片段。在10µl体系中，把目的片段与载体片段用T4 DNA连接酶连接，通过PCR鉴定（图2）和酶切鉴定（图3）来确定为阳性重组子。从而使本发明的启动子取代载体pCAMBIA1301上的CaMV35S启动子，与Gus基因融合，得到表达Gus基因的植物重组表达载体pCAMBIA1301：：NtLOX3-Promoter（图4）。

[0024] 实施例3：鉴定烟草损伤诱导型启动子的活性

[0025] 3.1 农杆菌介导的植物转化

[0026] 通过电击转化法，将在实施例2中构建的表达Gus基因的植物重组表达载体pCAMBIA1301：：NtLOX3-Promoter转化到农杆菌中EHA105中，提取质粒并进行PCR鉴定（图5），确定质粒真正的转入到了农杆菌中。

[0027] 取烟草种子，利用酒精和次氯酸钠消毒后播种到发苗培养基上，等苗子长到0.5cm左右转到移苗培养基上。待叶片长至5-8片叶的时候，选取绿色叶片，进行上述的转入了pCAMBIA1301：：NtLOX3-Promoter的农杆菌侵染，具体就是将28℃培养的农杆菌，OD600=0.8，加入20mg/L的AS（乙酰丁香酮），利用叶盘转化法转化烟草，并通过选择培养基进行筛选。

[0028] 3.2 转基因植株Gus表达活性分析

[0029] 取转基因烟草T1代叶片进行Gus组织化学染色。待转基因烟草植株长至6片左右的叶片时，取一片叶进行伤害处理，将叶片的叶脉以及叶片边缘进行损伤，然后进行Gus组织化学检测。Gus染色液成分为：0.1M磷酸缓冲液，50mM K3Fe(CN)6，50mM K4Fe(CN)6，0.5M Na2EDTA，1%Triton，20mM X-Gluc。将损伤后的叶片于Gus染色液中37℃浸泡过夜，然后用70%的乙醇漂洗，再次加入70%的乙醇脱色，在倒置显微镜下观察染色情况，并拍照记录。

[0030] 结果表明，Gus活性强的显示出很深的蓝色，无蓝色表示Gus活性较低。在未损伤的叶片部位，检测到Gus低水平表达或不表达，而在叶片的损伤部位，NtLOX3启动子驱动Gus有明显的高水平表达，损伤区域显示很深的蓝色。上述结果表明本发明的启动子具有很强的损伤诱导的活性。对其它指示基因的研究也正式本发明筛选的启动子具有损伤诱导的活性。