能在简单节杆菌中复制并表达甾体类化合物A环1,2位脱氢酶基因的质粒的构建方法及应用

摘要

本发明涉及一种能在简单节杆菌（Arthrobacter Simplex）中复制并高效表达甾体类化合物A环1,2位脱氢酶基因的质粒在构建高效表达甾体化合物A环1,2位脱氢的简单节杆菌工程菌中的应用。本发明质粒能在简单节杆菌里复制并且高效表达甾体类化合物A环1,2位脱氢酶基因，本发明质粒为进一步利用质粒pXJM19通过分子手段改良简单节杆菌提供了依据，具有重要的实用意义。

权利要求

1.一种能在简单节杆菌(Arthrobacter Simplex)中复制并表达甾体类化合物A环1,2位脱氢酶基因的质粒的构建方法，其特征在于：具体步骤如下：⑴以简单节杆菌基因组为模板进行PCR，所需要的引物如下：P3：5′-CCGGAATTC ATGGACTGGGCAGAGGAGTA-3′EcoRI；

P4：5′-CCCAAGCT TCATCGCGCGTCCTCGG-3′HindIII；

反应体系为50μL，配比如下：

其中，P1：5′-CCGGAATTC ATGAGCCATATTCAACGGGAAAC-3′EcoRI；

P2：5′-CCCAAGCTTTTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAAT-3′HindIII；

PCR程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性45s；63℃退火45s；72℃延伸1min30s；30个循环后72℃延伸

10min；4℃保存；

再通过琼脂糖凝胶电泳及切胶回收得到目的基因片段；

⑵构建游离表达载体pXJM19-ksdD

将目的基因通过EcoRI和HindIII双酶切连接在载体pXJM19多克隆位点上，得到重组载体pXJM19-ksdD，所用连接酶为T4DNA连接酶，连接体系为20μL，连接体系如下：目的基因与载体的摩尔浓度之比为3:1～9:1，加入0.2ul连接酶混匀后，在16℃下，过夜反应；

经转化、验证构建成功后，即得能在简单节杆菌中复制并高效表达甾体类化合物A环1,

2位脱氢酶基因的质粒。

2.如权利要求1所述的构建方法构建得到的质粒在构建高效表达甾体化合物A环1,2位脱氢的简单节杆菌工程菌中的应用，所述的构建高效表达甾体化合物A环1,2位脱氢的简单节杆菌工程菌的步骤如下：将冻存的简单节杆菌感受态细胞在冰上溶化后，取按感受态细胞：质粒为1μL：3ng的比例加入质粒pXJM19-ksdD，混合均匀，使用高压脉冲电击转化电击该细胞混合物，电击参数设置为：15kV/cm，25μF，电脉冲结束后，迅速将细胞悬液转移到室温复苏培养基中，振荡培养7～9h，复苏培养基连续稀释后取150μL涂布于含40μg/mL氯霉素的LB琼脂平板上，在培养箱培养24-30小时，在抗性板上长出的菌落，即为高效表达甾体化合物A环1,2位脱氢的简单节杆菌工程菌；

所述的复苏培养基为含有浓度为10-15mg/mL山梨醇的LB培养基。

3.如权利要求2构建的简单节杆菌工程菌在一次性投料的生物转化方面中的应用。

说明书

能在简单节杆菌中复制并表达甾体类化合物A环1,2位脱氢酶

基因的质粒的构建方法及应用

技术领域

[0001] 本发明属于基因工程和微生物发酵领域，涉及一种能在简单节杆菌中复制并高效表达甾体类化合物A环1,2位脱氢酶基因（KsdD）的质粒。技术背景

[0002] 甾体类药物具有重要的生理活性，在临床上有广泛的应用，是仅次于抗生素的第二大类药物。醋酸可的松位C1,2位上导入双键后成醋酸泼尼松，抗炎作用能够提高3-4倍，并且减少由钠滞留而带来的副作用。目前，甾体药物生产中常用的方法有化学合成和微生物转化两种，化学方法进行C1,2位脱氢一般采用二氧化硒法，该方法常使产品中带有少量难以除尽对人体有害的硒，然而微生物转化法具有成本低、对环境温和等优点，越来越受到人们的重视。

[0003] 简单节杆菌(Arthrobacter Simplex)的C1,2位脱氢反应是工业生产醋酸泼尼松及其同系物最有价值的一种反应，也是采用发酵法工业生产甾类药物的典型代表。目前甾体微生物转化主要研究的领域主要在以下几个方面：提高水不溶性底物的溶解度，细胞和酶的固定化以利于酶的重复利用，发展经济有效的产物连续回收方式等用来提高产量。但是，寻找、筛选更优良菌种来提高转化率才是更加长期有效的方法。目前国内在这步反应中仍在使用原始菌株，很少在分子水平上进行深入的探索，尚无基因工程菌研发成功。这也限制了国内甾体药物生产的进一步发展。随着分子生物学的发展和人们对甾体代谢机制研究的深入，基因工程在甾体药物生产中必将得到广泛的应用。

[0004] 本发明所用的简单节杆菌是一种模式C1,2位脱氢微生物，由于其发酵工业背景清楚，操作技术成熟等特点，已经广泛用于醋酸可的松C1,2位脱氢等领域。Choi等（1995, Journal of bacteriology 1779（5），4152-4156）描述了简单节杆菌(Arthrobacter Simplex)菌株中C1,2位脱氢基因（KsdD）的基因序列、成功的将此基因异源表达于链霉菌并研究了此酶的性质，但并未对简单节杆菌本身进行分子改造。简单节杆菌本身的遗传背景不清楚，没有相关的能在简单节杆菌中复制表达的质粒被报道。

[0005] 通过检索，尚未发现与本专利申请相关的专利公开文献。

发明内容

[0006] 本发明目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种制备时环境温和、易于操作、生产成本低、能在简单节杆菌里复制并且高效表达甾体类化合物A环1,2位脱氢酶基因的质粒。

[0007] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

[0008] 一种能在简单节杆菌（Arthrobacter Simplex）中复制并表达甾体类化合物A环1,2位脱氢酶基因的质粒的构建方法，具体步骤如下：

[0009] ⑴以简单节杆菌基因组为模板进行PCR，所需要的引物如下：

[0010] P3：5′- CCGGAATTC ATGGACTGGGCAGAGGAGTA-3′ EcoRI；

[0011] P4：5′- CCCAAGCT TCATCGCGCGTCCTCGG-3′     HindIII；

[0012] 反应体系为50μL，配比如下：

[0013]

[0014] PCR程序如下：

[0015] 95℃预变性 5min；94℃ 变性45s；63℃ 退火45s；72℃ 延伸1min30s；30个循环后72℃延伸10min；4℃保存；

[0016] 再通过琼脂糖凝胶电泳及切胶回收得到目的基因片段；

[0017] ⑵构建游离表达载体pXJM19- ksdD

[0018] 将目的基因通过EcoRI和HindIII双酶切连接在载体pXJM19多克隆位点上，得到重组载体pXJM19- ksdD，所用连接酶为T4 DNA连接酶，连接体系为20 µL，连接体系如下：目的基因：载体的摩尔浓度之比为3:1~9:1，加入0.2ul连接酶混匀后，在16 ºC下，过夜反应；

[0019] 经转化、验证构建成功后，即得能在简单节杆菌中复制并高效表达甾体类化合物A环1,2位脱氢酶基因的质粒。

[0020] 如上所述的构建方法构建得到的质粒在构建高效表达甾体化合物A环1,2位脱氢的简单节杆菌工程菌中的应用。

[0021] 而且，所述的构建高效表达甾体化合物A环1,2位脱氢的简单节杆菌工程菌的步骤如下：

[0022] 将冻存的简单节杆菌感受态细胞在冰上溶化后，取按感受态细胞：质料 μL：ng为1：3的比例加入质粒pXJM19- ksdD，混合均匀，使用高压脉冲电击转化电击该细胞混合物，电击参数设置为：15kV/cm，25 μF，电脉冲结束后，迅速将细胞悬液转移到室温复苏培养基中，振荡培养7~9 h，复苏培养基连续稀释后取150μL涂布于含40 μg/mL氯霉素的LB琼脂平板上，在培养箱培养24-30小时，在抗性板上长出的菌落，即为高效表达甾体化合物A环1,2位脱氢的简单节杆菌工程菌。

[0023] 而且，所述的复苏培养基的配方如下：含有浓度为10-15 mg/mL山梨醇的LB培养基。

[0024] 而且，所述的简单节杆菌工程菌在一次性投料的生物转化方面中的应用。

[0025] 本发明的优点和积极效果如下：

[0026] 1、本发明质粒能在简单节杆菌里复制并且高效表达甾体类化合物A环1,2位脱氢酶基因，该质粒制备时环境温和、易于操作、生产成本低，而且，本发明质粒pXJM19- KsdD在简单节杆菌中拷贝数较高并且能稳定存在，本发明质粒为进一步利用质粒pXJM19通过分子手段改良简单节杆菌提供了依据，具有重要的实用意义。

[0027] 2、本发明质粒构建的工程菌在含酵母提取物（5%-8%）、磷酸盐（1.5%-3%）、玉米浆（10%-15%）和葡萄糖（8%-12%）等营养成分的基础上，通过恒温通气搅拌发酵，在甾体化合物浓度不高于7%(m/V)时，采用一次加投甾体化合物底物，在40~50小时内生物脱氢转化率能够达到90%以上；在甾体化合物浓度高于7%时，采用连续补加甾体化合物底物的情况下，在55~65小时内生物脱氢转化率能够达到95%以上。与原始菌不同时间段转化醋酸可的松能力的比较，重组菌最终转化率提高了11.5 %，说明本发明质粒可以应用于构建高效表达甾体化合物A环1,2位脱氢的简单节杆菌工程菌和一次性投料的生物转化方面中。

附图说明

[0028] 图1为本发明中游离表达载体pXJM19- ksdD的构建过程图；

[0029] 图2为本发明中含有空质粒pXJM19重组简单节杆菌提取质粒HindIII单切验证图，1为提取质粒单切验证结果，M为marker.；

[0030] 图3为本发明pXJM19- ksdD质粒的重组菌转化子图；

[0031] 图4为本发明所构建菌株与原始菌不同时间段转化醋酸可的松能力的比较，重组菌最终转化率提高了11.5%左右。

具体实施方式

[0032] 下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

[0033] 本发明所使用的质粒大肠杆菌-谷氨酸棒状杆菌穿梭表达载体pXJM19（Construction and application of newCorynebacterium glutamicumvectors,1999，Biotechnology techniques 13（6）, 437-441）；

[0034] 本发明所使用宿主菌为简单节杆菌（Arthrobacter Simplex），保藏编号为ACCC 12070，可用于甾体化合物生物脱氢。

[0035] 本发明在分析穿梭表达载体pXJM19能在简单节杆菌里复制的基础上，进一步验证了该质粒能在简单节杆菌中高效表达，并成功的实现了pXJM19-KsdD重组表达载体在简单节杆菌中的高效表达。

[0036] 一种能在简单节杆菌中复制并高效表达甾体类化合物A环1,2位脱氢酶基因的质粒的构建及检测步骤的总体思路如下：

[0037] 一、验证质粒pXJM19能在简单节杆菌里稳定复制；

[0038] 二、验证质粒pXJM19能在简单节杆菌里高效表达；

[0039] 三、构建表达载体pXJM19-KsdD，将此表达质粒pXJM19- KsdD电转进简单节杆菌中得到一株高效用于甾体化合物A环1,2位脱氢的简单节杆菌工程菌株；

[0040] 四、测定重组菌在甾体化合物浓度不高于7%(m/V)时，采用一次加投甾体化合物底物的转化能力；

[0041] 五、测定在甾体化合物浓度高于7%时，采用连续补加甾体化合物底物的情况下，重组菌的转化能力。

[0042] 一种能在简单节杆菌中复制并高效表达甾体类化合物A环1,2位脱氢酶基因的质粒pXJM19-KsdD，该质粒的基因序列为： NCBI(GenBank accession No. AJ133195)。

[0043] 本发明中游离表达载体pXJM19- ksdD的构建过程图见图1，本发明质粒pXJM19-KsdD的构建的具体步骤如下：

[0044] 一、质粒pXJM19能否在简单节杆菌里稳定复制验证

[0045] 菌种：简单节杆菌（保藏编号为ACCC 12070）质粒：pXJM19

[0046] 所述LB培养基为：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L、氯化钠10 g/L、葡萄糖10 g/L。

[0047] 所述氯霉素抗性平板为含有40 μg/mL的氯霉素，1.4%的琼脂粉的LB固体培养基。

[0048] 质粒pXJM19能在简单节杆菌内复制的验证：

[0049] 将稳定期的简单节杆菌按0.1%的接种量接种于新鲜培养基培养，当0D600值接近0.3- 0.5时，加入一定浓度的青霉素，使其终浓度为30μg/mL ，继续振荡培养lh。随后迅速将培养物冰上放置至少10min，离心收集菌体(2000转，15min，4°C，用等体积冰预冷的电击缓冲液(20%甘油 +0.5mol/L山梨醇)洗涤3次，将细胞浓缩100倍。最后，将细胞悬液分装到EP管中，每管60μL，冻存于-80°C待用。

[0050] 将冻存的简单节杆菌感受态细胞在冰上溶化后，取50μL加入150ng质粒pXJM19 (从 E.coliDH5a中制备)混合均匀，然后转移到冰预冷的电击杯中。使用高压脉冲电击转化电击该细胞混合物，电击参数设置为：15kV/cm，25 μF电脉冲结束后，迅速将细胞悬液转移到室温复苏培养基的EP管中，振荡培养8h，复苏后培养基连续稀释后取150μL涂布于含40 μg/mL氯霉素的LB琼脂平板上，在培养箱培养24-30小时，能在抗性板上长出菌落，对照组没长菌落，再通过提取质粒单酶切验证。酶切反应体积为50 μL，将待酶切的DNA片段、ddH20、10×Buffer混合均匀后，加入2 μLHindIII限制性内切酶，混匀后，37 ºC酶切3-4 h。验证结果如图2验证成功，说明质粒pXJM19能在简单节杆菌中复制。

[0051] 二、质粒pXJM19能在简单节杆菌内表达的验证

[0052] 1、卡那抗性基因编码序列（不含启动子和终止子）的扩增

[0053] 以质粒PET28为模板进行PCR，再通过琼脂糖凝胶电泳及切胶回收得到目的基因片段。

[0054] 所需要的引物如下：

[0055] P1：5′- CCGGAATTC ATGAGCCATATTCAACGGGAAAC-3′ (EcoRI)；

[0056] P2：5′-CCCAAGCTTTTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAAT -3′ (HindIII)；

[0057] 反应体系为50μL，配比如下：

[0058]

[0059] PCR程序如下：

[0060] 95℃预变性 5min；94℃ 变性45s；54℃ 退火45s；72℃ 延伸1min30s；30个循环后72℃延伸10min；4℃ 保存。

[0061] DNA片段回收：

[0062] DNA片段回收采用北京庄盟国际生物基因科技有限公司的小量DNA产物纯化试剂盒，方法如下：

[0063] ⑴估计PCR反应液或酶切反应液的体积，向其中加入5倍体积的结合液，充分混匀。

[0064] ⑵将上一步所得溶液加入一个吸附柱中，室温放置2 min，12000 r/min离心30-60 s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。

[0065] ⑶向吸附柱中加入700 μL漂洗液，12000 r/min离心30-60 s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。重复此步骤一次。

[0066] ⑷将吸附柱放入收集管中，12000 r/min离心2 min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底晾干，以防残留的漂洗液影响下一步的实验。

[0067] ⑸取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30-50 μL洗脱缓冲液，室温放置2 min，12000 r/min离心2 min，收集DNA溶液。-20 ºC保存。

[0068] 2、构建游离表达载体

[0069] 将目的基因通过EcoRI和HindIII双酶切连接在pXJM19多克隆位点上，得到重组载体pXJM19-Km。酶切反应体积为50 μL，将待酶切的DNA片段、ddH20、10×Buffer混合均匀后，加入2 μLHindIII和EcoRI限制性内切酶，混匀后，37 ºC酶切3-4 h。所用连接酶为T4 DNA连接酶，连接体系为20 µL，连接体系如下：目的基因：载体 （摩尔浓度之比）=3:1-9:1，加入适量0.2ul连接酶混匀，在16 ºC下，过夜反应

[0070] 3、电转游离表达载体

[0071] 将稳定期的简单节杆菌按0.1%的接种量接种于新鲜培养基培养，当0D600值接近0.3- 0.5时，加入一定浓度的青霉素，使其终浓度为30μg/mL ，继续振荡培养lh。随后迅速将培养物冰上放置至少10min，离心收集菌体(2000转， 15min，4°C，用等体积冰预冷的电击缓冲液(20%甘油 +0.5mol/L山梨醇)洗涤3次，将细胞浓缩100倍。最后，将细胞悬液分装 到EP管中，每管60μL，冻存于-80°C待用

[0072] 将冻存的简单节杆菌感受态细胞在冰上溶化后，取50μL加入150ng质粒pXJM19-Km (从 E.coliDH5a中制备)混合均匀，然后转移到冰预冷的电击杯中。使用高压脉冲电击转化电击该细胞混合物，电击参数设置为 :15kV/cm，25 μF电脉冲结束后，迅速将细胞悬液转移到室温复苏培养基的EP管中，振荡培养8h，复苏后培养基连续稀释后取150μL涂布于含40 μg/mL氯霉素的LB琼脂平板上，在培养箱培养24-30小时，能在抗性板上长出菌落，对照组没长菌落，再通过提取质粒验证。

[0073] 质粒提取采用北京庄盟国际生物基因科技有限公司的质粒小提试剂盒。方法如下：

[0074] ⑴取1-5 mL过夜培养的菌液，加入离心管中，12000 r/min 离心1 min，尽量吸除上清。

[0075] ⑵向留有菌体沉淀的离心管中加入250 μL溶液1（已加入RNaseA），使用移液器或涡旋器彻底悬浮细菌沉淀（革兰氏阳性菌需要加入溶菌酶至终浓度1 mg/mL，37 ºC温育30 min）。

[0076] ⑶向离心管中加入250 μL溶液2，温和的上下翻转6-8次使菌体充分裂解。

[0077] ⑷向离心管中加入350 μL溶液3，立即温和的上下翻转6-8次，充分混匀，即出现白色絮状沉淀。12000 r/min 离心10 min，此时在离心管底部形成沉淀。

[0078] ⑸将上一步收集的上清液用移液器移至吸附柱中，尽量不要吸出沉淀。12000 r/min 离心30-60 s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。

[0079] ⑹向吸附柱中加入500 μL去蛋白液，12000 r/min 离心30-60 s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

[0080] ⑺向吸附柱中加入700 μL漂洗液，12000 r/min离心30-60 s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。重复此步骤一次。

[0081] ⑻将吸附柱放入收集管中，12000 r/min离心2 min，尽量除去漂洗液。

[0082] ⑼将吸附柱置于一个干净的离心管中，室温放置数分钟，彻底晾干，以防残留的漂洗液影响下一步的实验。

[0083] ⑽向吸附膜中间位置悬空滴加60-100 μL洗脱缓冲液，室温放置2 min，12000 r/min离心2 min，收集DNA溶液。-20 ºC保存。

[0084] 4、质粒pXJM19表达能力的验证

[0085] 挑取验证成功的菌株，接种含40 μg/mL氯霉素的LB培养基上，0D600值接近0.3- 0.5时加入一定浓度的IPTG诱导，诱导6h后将菌体涂布于含有不同浓度(50、60、70、90、180、
300) μg/mL的卡纳霉素的LB琼脂平板。结果重组菌在平板上长有菌落，而对照组（带有空质粒的菌种）没在平板上长有菌落。并且重组菌可在含有180μg/mL抗生素的平板上生长。这说明质粒pXJM19能在简单节杆菌里表达且表达水平较高。

[0086] 三、表达载体pXJM19-KsdD的构建

[0087] 1、各基因的扩增

[0088] 目的基因（ksdD）的扩增

[0089] 首先，以简单节杆菌基因组为模板进行PCR，再通过琼脂糖凝胶电泳及切胶回收得到目的基因片段。

[0090] 所需要的引物如下：

[0091] P3：5′- CCGGAATTC ATGGACTGGGCAGAGGAGTA-3′(EcoRI)；

[0092] P4：5′- CCCAAGCT TCATCGCGCGTCCTCGG-3′(HindIII)；

[0093] 反应体系为50μL，配比如下：

[0094]

[0095] PCR程序如下:

[0096] 95℃预变性 5min；94℃ 变性45s；63℃ 退火45s；72℃ 延伸1min30s；30个循环后72℃延伸10min；4℃保存。

[0097] 2、构建游离表达载体pXJM19- ksdD

[0098] 将目的基因通过EcoRI和HindIII双酶切连接在pXJM19多克隆位点上，酶切反应体积为50 μL，将待酶切的DNA片段、ddH20、10×Buffer混合均匀后，加入2 μLHindIII和EcoRI限制性内切酶，混匀后，37 ºC酶切3-4 h。所用连接酶为T4 DNA连接酶，连接体系为20 µL，连接体系如下：目的基因：载体 （摩尔浓度之比）=3:1-9:1，加入适量0.2ul连接酶混匀，在16 ºC下，过夜反应。经转化、验证构建成功后，即得能在简单节杆菌中复制并高效表达甾体类化合物A环1,2位脱氢酶基因的质粒。得到重组载体pXJM19- ksdD。

[0099] 3、将稳定期的简单节杆菌按0.1%的接种量接种于新鲜培养基培养，当OD600值接近0.3- 0.5时，加入一定浓度的青霉素，使其终浓度为30μg/mL ，继续振荡培养lh。随后迅速将培养物冰上放置至少10min，离心收集菌体(2000转， 15min，4°C，用等体积冰预冷的电击缓冲液(20%甘油 +0.5mol/L山梨醇)洗涤3次，将细胞浓缩100倍。最后，将细胞悬液分装 到EP管中，每管60μL，冻存于-80°C待用。

[0100] 将冻存的简单节杆菌感受态细胞在冰上溶化后，取50μL加入150ng质粒pXJM19- ksdD (从 E.coliDH5a中制备)混合均匀，然后转移到冰预冷的电击杯中。使用高压脉冲电击转化电击该细胞混合物，电击参数设置为 :15kV/cm，25 μF电脉冲结束后，迅速将细胞悬液转移到室温复苏培养基即（10-15mg/ml ）山梨醇的LB培养基的EP管中，振荡培养8h，复苏后培养基连续稀释后取150μL涂布于含40 μg/mL氯霉素的LB琼脂平板上，在培养箱培养24-30小时，能在抗性板上长出菌落，对照组没长菌落。如图3。

[0101] 4、重组转化子的验证

[0102] 挑取其中10株转化子，提取质粒验证，1,3，4，5，6，7号菌验证成功。

[0103] 质粒提取采用北京庄盟国际生物基因科技有限公司的质粒小提试剂盒。方法如下：

[0104] ⑴取1-5 mL过夜培养的菌液，加入离心管中，12000 r/min 离心1 min，尽量吸除上清。

[0105] ⑵向留有菌体沉淀的离心管中加入250 μL溶液1（已加入RNaseA），使用移液器或涡旋器彻底悬浮细菌沉淀（革兰氏阳性菌需要加入溶菌酶至终浓度1 mg/mL，37 ºC温育30 min）。

[0106] ⑶向离心管中加入250 μL溶液2，温和的上下翻转6-8次使菌体充分裂解。

[0107] ⑷向离心管中加入350 μL溶液3，立即温和的上下翻转6-8次，充分混匀，即出现白色絮状沉淀。12000 r/min 离心10 min，此时在离心管底部形成沉淀。

[0108] ⑸将上一步收集的上清液用移液器移至吸附柱中，尽量不要吸出沉淀。12000 r/min 离心30-60 s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。

[0109] ⑹向吸附柱中加入500 μL去蛋白液，12000 r/min 离心30-60 s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

[0110] ⑺向吸附柱中加入700 μL漂洗液，12000 r/min离心30-60 s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。重复此步骤一次。

[0111] ⑻将吸附柱放入收集管中，12000 r/min离心2 min，尽量除去漂洗液。

[0112] ⑼将吸附柱置于一个干净的离心管中，室温放置数分钟，彻底晾干，以防残留的漂洗液影响下一步的实验。

[0113] ⑽向吸附膜中间位置悬空滴加60-100 μL洗脱缓冲液，室温放置2 min，12000 r/min离心2 min，收集DNA溶液。-20 ºC保存。

[0114] 四、重组菌转化醋酸可的松能力的测定为初步测定重组菌转化醋酸可的松能力的变化情况，将得到的重组菌株和原始菌株分别在在含有酵母提取物（5%-8%）、磷酸盐（1.5%-3%）、玉米浆（10%-15%）和葡萄糖（8%-12%），通过恒温通气搅拌发酵，在甾体化合物（醋酸可的松、含氟皮质激素、4-AD等）浓度不高于7%(m/V)时，采用一次加投甾体化合物底物，实验结果见图4。在甾体化合物浓度高于7%时，采用分次少量补加底物，酒精水的乳浊液的连续缓慢流加的生物转化方法，在60小时内生物脱氢转化率能够达到95%以上。

[0115] 综上，本实验室中保藏的大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭表达载体pXJM19能在简单节杆菌中复制和表达。将A环1,2位脱氢酶基因（KsdD）连接在质粒pXJM19上构建出重组表达质粒后，将此重组质粒pXJM19- KsdD电转进简单节杆菌，经筛选得到一株高效用于甾体化合物A环1,2位脱氢的简单节杆菌工程菌株，实现了A环1,2位脱氢酶在出发菌中的高水平游离表达。

[0116] 此外，该质粒能在简单节杆菌中具有良好的遗传稳定性，且能高效稳定地表达A环1,2位脱氢酶基因。构建的工程菌在含有酵母提取物、磷酸盐、玉米浆和葡萄糖等营养成分的基础上，通过恒温通气搅拌发酵，在甾体化合物浓度不高于7%(m/V)时，采用一次加投甾体化合物底物，在40~50小时内生物脱氢转化率能够达到90%以上；在甾体化合物浓度高于
7%时，采用连续补加甾体化合物底物的情况下，在55~65小时内生物脱氢转化率能够达到
95%以上。与原始菌不同时间段转化醋酸可的松能力的比较，重组菌最终转化率提高了11.5 %。